microRNA-933对LX-2细胞凋亡和增殖的影响及其分子机制

摘要

目的 探讨microRNA-933(miRNA-933)对人肝星状细胞系LX-2细胞凋亡和增殖的调控作用及其机制。方法 首先以人肝组织为研究对象，利用基因芯片技术，检测肝硬化与慢性乙型肝炎肝组织相较于正常肝组织中差异表达的基因，并从中筛选差异表达显著的miRNA，从而确定研究对象为miRNA-933。进而以人肝星状细胞系LX-2为研究对象，利用mi RNA-933分子模拟剂（mi RNA-933 mimic）与抑制剂（mi RNA-933 siRNA），构建LX-2过表达与敲减模型，并以转染mimic-NC（过表达）或si RNA-NC（敲减）的细胞作为阴性对照。使用实时荧光定量PCR(q PCR)和Western Blot技术，检测mi RNA-933与活化标志蛋白的表达水平；随后采用细胞增殖实验、流式细胞术等技术，检测mi RNA-933对细胞凋亡、增殖和活化的影响，并探讨其机制。计量资料两组间比较采用成组t检验，多组间比较采用单因素方差分析，并经过Bonferroni校正。结果 基于基因芯片检测结果，最终筛选出18个显著差异表达的mi RNA，其中mi RNA-933表达显著下调（P<0.05）。mi RNA-933 mimic与siRNA转染LX-2细胞后，结果显示，与阴性对照组相比，miRNA-933 siRNA显著下调miRNA-933的表达（P=0.000 7），而mi RNA-933 mimic显著上调mi RNA-933的表达（P=0.000 3）;Western Blot和q PCR检测结果表明，mi RNA-933 siRNA显著上调胶原蛋白Ⅰ（CollagenⅠ）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达（P值均<0.001），而mi RNA-933 mimic显著抑制CollagenⅠ和α-SMA的表达（P值均<0.05）。流式细胞术检测结果显示，与阴性对照组相比，miRNA-933 siRNA显著下调LX-2细胞凋亡率（P=0.031 9）,miRNA-933 mimic显著上调LX-2细胞凋亡率（P=0.005 5）;Western Blot检测结果表明，与阴性对照组相比，miRNA-933 siRNA可以抑制LX-2细胞中胱天蛋白酶3(Caspase-3)和多聚ADP核糖聚合酶1(PARP-1)的表达（P值分别为0.006 7、0.003 0），上调B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)的表达（P=0.002 0），而miRNA-933 mimic可显著上调Caspase-3(P=0.011 8)和PARP-1(P=0.049 5)的表达，下调Bcl-2的表达（P=0.002 1）。细胞增殖实验结果显示，与阴性对照组相比，miRNA-933siRNA可促进LX-2细胞增殖（P=0.011 5）；相反miRNA-933 mimic可抑制LX-2细胞增殖（P=0.001 2）。Western Blot和qPCR检测显示，mi RNA-933 siRNA显著抑制Kruppel样因子6(KLF6)的表达，进而下调活化转录因子4(ATF4)、活化转录因子3(ATF3)、C/EBP同源蛋白（CHOP）蛋白的表达，而miRNA-933 mimic会促进以上蛋白的表达（P值均<0.05）。结论 miRNA-933可能通过促进LX-2细胞中KLF6/ATF4/ATF3/CHOP/Bcl-2信号轴的激活，进而促进细胞凋亡，抑制细胞的活化和增殖。

关键词

肝纤维化 / 微RNAs / 肝星状细胞