中国旱獭Ⅰ型干扰素受体β亚基克隆、表达及功能初步鉴定

摘要

目的 克隆中国旱獭Ⅰ型干扰素受体β亚基（mhIFNAR2）的基因，并进行抗体制备及功能鉴定。方法 应用RT-PCR技术，从中国旱獭脾组织中扩增得到序列，克隆至原核表达载体p RSET-B，表达重组蛋白，电泳和Western Blot法鉴定；重组蛋白常规免疫BALB/c小鼠制备其胞外段多克隆抗体，免疫组化、免疫荧光和Western Blot法鉴定；再通过si RNA阻断的方法检测其功能。计量资料多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。结果 从mhIFNAR2扩增出149～1 300 bp片段，其同源性在分析的种属中以土拨鼠最高，可达98.05%。成功地构建了表达胞外段mhIFNAR2_((50-181aa))蛋白的原核表达质粒，命名为pRSET-B. mhIFNAR2；其表达重组蛋白分子量27 kD，纯化后纯度约为95%，浓度约为160μg/mL。用纯化的重组蛋白常规免疫BALB/c小鼠后，获得1∶1 000的特异性多克隆抗体，用免疫组化及免疫荧光可见细胞膜、细胞质有表达。合成的三条siRNA，其中有一条起始于277位点的siRNA(siRNA277)与空白对照及阴性对照相比，可以沉默目的基因的表达，并能减弱干扰素的信号通路（P值均<0.05）。结论 获得mhIFNAR2的部分序列，成功地制备出抗mhIFNAR2胞外段多克隆抗体，该抗体有较高的效价和特异性，并能用于免疫组化、免疫荧光及Western Blot的检测。用siRNA277可以抑制目的基因的表达，并能阻断干扰素的信号通路。

关键词

受体,干扰素αβ / 克隆 / 乙型肝炎