靶向叶酸受体α(FRα)的程序性细胞死亡受体1敲低型嵌合抗原受体T细胞杀伤肝癌细胞的效果分析

摘要

目的 探究靶向叶酸受体α(FRα)嵌合抗原受体（CAR）的程序性细胞死亡受体1(PD-1)敲低型T细胞（si-PD-1-CAR-T）对肝癌细胞的清除能力。方法 应用生物信息学数据库TCGA分析FRα抗原在肝癌及正常肝组织中的表达情况，以及FRα表达与肝癌患者生存期的关系。分别将编码靶向FRα抗原的CAR结构的mRNA及mRNA联合靶向PD-1基因的小干扰RNA(siRNA)使用电穿孔仪转导入T细胞，制备FRα-CAR-T和si-PD-1-CAR-T。流式细胞术分析FRα-CAR的表达效率和PD-1的敲低效率。体外培养肝癌细胞系JHH-1和HepG2，采用流式细胞术分析FRα在肿瘤细胞表面的表达情况，将FRα-CAR-T、si-PD-1-CAR-T及空载体转导的T细胞（Mock T）作为效应细胞，JHH-1和HepG2作为靶细胞，CCK-8法检测在不同效靶比（1∶1、2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1）时对靶细胞的杀伤效率；采用ELISA法分别检测效应细胞与靶细胞（10∶1）共培养上清中IFN-γ和IL-2的分泌情况。计量资料符合正态分布时，两组间比较采用成组t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK检验。采用Kaplan-Meier法分析比较患者生存差异。结果 TCGA数据库分析显示，FOLR1在肝癌组织中表达水平明显升高，FOLR1高表达肝癌患者的总生存期显著低于FOLR1低表达者（P=0.013）。将m RNA转导入T细胞后，FRα-CAR在CAR-T和si-PD-1-CAR-T中的表达率可达89.8%和84.7%，使用m RNA和si RNA共转染可将T细胞的PD-1下调并维持至少7天的PD-1低表达状态。FRα抗原在JHH-1细胞中表达率为100%，而在Hep G2细胞中呈阴性表达。CCK-8结果显示，si-PD-1-CAR-T对JHH-1细胞杀伤效率显著高于FRα-CAR-T细胞（P<0.05）;ELISA结果显示，FRα-CAR-T细胞与JHH-1细胞共培养时，IL-2分泌量较Mock T细胞显著增加[（1 032.50±135.90） pg/mL vs (50.26±7.87) pg/mL,P<0.001],IFN-γ分泌量显著增加[（1 430.56±184.20） pg/mL vs (89.05±11.26) pg/mL, P<0.001];si-PD-1-CAR-T与JHH-1细胞共培养后，IFN-γ和IL-2的释放水平较FRα-CAR-T均显著提高（P值均<0.05）。结论 FRα是肝癌治疗的潜在靶点，敲低T细胞PD-1可显著提高FRα-CAR-T在体外的杀伤活性。

关键词

癌,肝细胞 / 嵌合抗原受体 / 叶酸盐受体1 / 程序性细胞死亡受体1