灵芝酸A对刀豆球蛋白A诱导的急性免疫性肝损伤小鼠模型的影响及其作用机制

摘要

目的 观察灵芝酸A(GA-A)对刀豆球蛋白A(ConA)诱导的小鼠自身免疫性肝炎（AIH）模型的治疗作用。方法 将35只小鼠随机分为空白组（NC组）、模型组（ConA组）和GA-A低、中、高剂量治疗组（GA-A-L组、GA-A-M组、GA-A-H组），每组各7只小鼠。通过尾静脉注射ConA建立经典AIH小鼠模型，1 h后通过腹腔注射不同剂量GA-A治疗。应用蛋白质组学技术探究GA-A对肝细胞的保护机制，另外在体外用全反式维甲酸（ATRA）将HL-60细胞分化为dHL-60中性粒细胞来验证GA-A的作用机制。检测炎症（血清ALT和AST活性、HE染色及炎症相关基因）、凋亡（TUNEL染色）、中性粒细胞和中性粒细胞胞外陷阱（NET）标志物[髓过氧化物酶（MPO）、瓜氨酸化组蛋白3(CitH3)、Ly6G、游离双链DNA(dsDNA)]及p38磷酸化指标。计量资料两组间比较采用成组t检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。结果 与NC组相比，ConA组小鼠血清ALT和AST水平显著增加（P值均<0.001）。与ConA组相比，GA-A治疗显著降低ALT和AST水平（P值均<0.01）。HE染色结果表明，ConA组小鼠肝脏发生明显坏死。GA-A治疗后显著减少肝坏死面积和TUNEL阳性肝细胞的数量（P值均<0.05）。另外，与ConA组相比，GA-A治疗后血清和肝组织中炎症因子IL-6、TNF-α和IFN-γ表达水平显著降低（P值均<0.05）。蛋白质组学分析提示，GA-A通过抑制NET的释放和p38 MAPK通路来减轻ConA诱导的急性免疫性肝损伤。小鼠肝组织免疫荧光染色结果显示，与ConA组相比，GA-A治疗组MPO阳性中性粒细胞的数量及Ly6G和CitH3阳性细胞的数量显著降低（P值均<0.01）。Western Blot及dsDNA结果显示，GA-A显著抑制小鼠肝组织及dHL-60细胞中的NET标志物dsDNA、CitH3以及p38磷酸化水平（P值均<0.05）。结论 GA-A抑制p38 MAPK通路和NET释放减轻肝脏炎症反应和肝细胞死亡，从而减轻ConA诱导的急性免疫性肝损伤。本研究为GA-A通过调节嗜中性粒细胞功能治疗免疫性肝损伤提供了理论依据。

关键词

灵芝酸A / 伴刀豆球蛋白A / 肝炎,自身免疫性 / 胞外诱捕网 / 蛋白质组学 / 小鼠,近交C57BL

基金资助

国家自然科学基金（82104606,81874436）