腺相关病毒通用型亲和介质的制备与吸附性能研究

Preparation and Adsorption Performance Study of Universal Affinity Media for Adeno-Associated Viruses

摘要

文章利用仿生多肽与腺相关病毒 (AAV) 的亲和相互作用，将仿生多肽偶联于琼脂糖微球，制备出一种用于AAV纯化的通用型亲和介质。以不同种类的仿生多肽为配基，以Sengarose 4FF微球为基质，通过环氧活化的方式将多肽配基偶联至琼脂糖微球，制备AAV多肽亲和介质；通过调控活化基团密度、多肽配基种类及浓度、反应温度等条件，最终制备出配基密度为2.2~5.6 mg/mL的多种AAV多肽亲和介质。该介质形貌规整，平均粒径为90 μm。扫描电子显微镜结果表明，琼脂糖微球在偶联配基前后表面形貌基本未改变。在介质吸附性能研究中，分别采用高效液相色谱 (HPLC) 和激光共聚焦显微镜 (CLSM) 表征介质结合AAV的效果。结果表明，该仿生多肽介质能有效结合AAV，在特定吸附与解吸条件下顺利捕获目标病毒。进一步研究该多肽亲和介质的通用结合性能发现，其对AAV2型和AAV9型均具有结合能力。多肽配基密度对AAV2吸附量的影响结果表明，介质对AAV的结合量随配基密度增大而增加，当配基密度为5.6 mg/mL时，AAV结合量达到最大值。文章为AAV亲和层析纯化技术的发展提供了新思路。

Abstract

The article utilized the affinity interaction between biomimetic peptides and adeno-associated virus (AAV) to couple the biomimetic peptides onto agarose microspheres, thereby preparing a universal affinity medium for AAV purification. With different types of biomimetic peptides as ligands and Sengarose 4FF microspheres as the matrix, the biomimetic peptide ligands were coupled to the agarose microspheres through epoxy activation to prepare AAV peptide affinity media. By regulating the density of the activated groups, the type and concentration of the peptide ligands, and the reaction temperature, various AAV peptide affinity media with ligand densities ranging from 2.2 to 5.6 mg/mL were ultimately prepared. The morphology of the medium was regular, with an average particle size of 90 μm. Scanning electron microscopy results indicated that the surface morphology of the agarose microspheres remained largely unchanged before and after coupling the ligands. In the study of the adsorption performance of the medium, high-performance liquid chromatography (HPLC) and confocal laser scanning microscopy (CLSM) were used to characterize the binding effect of the medium on AAV. The results showed that the biomimetic peptide medium could effectively bind AAV and successfully capture the target virus under specific adsorption and desorption conditions. Further research on the universal binding performance of the peptide affinity medium revealed that it had binding capabilities for both AAV2 and AAV9 types. The results of the influence of the peptide ligand density on the adsorption capacity of AAV2 indicated that the binding capacity of the medium to AAV increased with the increase in ligand density, reaching the maximum value whenthe ligand density was 5.6 mg/mL. The article provided a new idea for the development of AAV affinity chromatography purification technology.

Graphical abstract

关键词

腺相关病毒 / 琼脂糖 / 多肽亲和介质 / 吸附性能 / 仿生多肽

Key words

AAV / Agarose chromatography media / Peptide affinity media / Adsorption performance / Biomimetic peptide

1 前 言

腺相关病毒 (AAV) 是一种广泛应用于基因治疗的非致病性病毒载体，不仅是全球首个获美国食品药品监督管理局 (FDA) 批准的基因治疗病毒载体，也是当前临床应用前景最广阔的基因药物载体之一^[1-3]。凭借个性化设计与精准递送的优势，AAV已被应用于血友病^[4]、阿尔兹海默病^[5]等145项疾病的干预性临床试验。AAV的分离纯化生产过程复杂且精细，超速离心法、聚乙二醇沉淀法、超滤法虽可获得完整的AAV颗粒，但操作烦琐、耗时较长，还易导致病毒活性损失^[6]。近年来，层析法在AAV纯化中的应用愈发广泛。例如，离子交换层析可实现完整病毒颗粒与空壳颗粒的区分^[7]；亲和层析虽可纯化特定血清型AAV，但亲和介质成本较高，以纳米抗体为代表的AAV亲和配基价格昂贵，大幅增加AAV纯化成本^[8-9]。采用仿生多肽作为亲和配基，不仅能达到与蛋白配基相当的亲和性，还可显著降低介质成本。朱俐燕等^[10]仿生了蛋白A与IgG Fc片段结合处的氨基酸序列，将获得的仿生多肽偶联至pGMA-EDMA纳米球，成功制备出对IgG具有高亲和力的肽配基纳米载体。Chu等^[11]筛选出可用于纯化AAV2的肽配基，并将选定的肽与Toyopearl基质结合，从HEK 293细胞裂解液中成功纯化AAV2，回收率达到50%~80%。

本研究以腺相关病毒受体 (AAVR) 结构中与AAV结合力最强的胞外结构片段PKD2为设计依据，仿生出PKD2与AAV结合区域的肽段^[12-13]。将该仿生多肽偶联于琼脂糖基球，制备得到AAV多肽亲和层析介质。该介质既具有对多种血清型AAV的特异性结合能力，又具有易于制备、稳定性好、价格低廉等优势，为AAV高效分离纯化提供了新选择。

2 实验部分

2.1 仪器和试剂

试剂：Sengarose 4FF(中科森辉微球技术 (苏州) 有限公司)；1,4-丁二醇二缩水甘油醚 (麦克林公司)；异硫氰酸荧光素 (FITC，美国Sigma公司)；D5肽、D15肽、D16肽 (国家生化工程技术研究中心 (北京) 提供)；其他试剂均为分析纯 (国药集团北京化学试剂公司)。

仪器：激光共聚焦显微镜 (CLSM，Leica TCS SP 5，德国Leica公司)；AKTA Purifier 100层析系统 (美国Cytiva公司)；UNcle多功能蛋白稳定性分析仪 (美国Unchained Labs公司)；752紫外可见分光光度计 (上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；光学显微镜 (美国AMG公司)；LC-20AT型高效液相层析仪 (日本岛津公司)。

2.2 实验方法

2.2.1 多肽稳定性评价

(1) 酸碱稳定性测试。采用体积排阻层析法研究多肽溶液在不同pH环境中的结构稳定性，分析多肽在极端pH环境下的聚集和降解情况。精确配制pH 2.0~9.0的多肽缓冲体系 (多肽浓度1 mg/mL)，并置于4 ℃恒温空气摇床中振荡处理24 h。随后用Upsepdex 30 10/300 GL色谱柱进行体积排阻色谱分析，流动相为50 mmol/L磷酸盐缓冲液(含150 mmol/L NaCl，pH7.4)，流速为0.5 mL/min，检测波长为220 nm，计算各pH条件下多肽的保留时间偏移量及纯度^[14-15]。

(2) 热稳定性测试。采用UNcle多功能蛋白稳定性分析仪测定多肽溶液的热稳定性。将多肽溶液以0.5 ℃/min的速度从20 ℃升温至80 ℃，通过内源性荧光检测多肽构象变化，从而确定多肽变性温度T_m，评估蛋白构象的稳定性。

2.2.2 多肽亲和介质的制备

(1) 环氧活化。多肽亲和介质制备流程如图1所示，采用双环氧化合物活化法对Sengarose 4FF微球进行活化^[16-18]。准确称取一定量Sengarose 4FF微球，依次加入二甲亚砜、1,4-丁二醇二缩水甘油醚及NaOH溶液，于30 ℃下反应一定时间，制备得到环氧活化胶^[19]。

(2) 偶联多肽配基。将多肽偶联至环氧活化胶。准确称取多肽冻干粉，用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液 (PB，pH 10) 配制多肽溶液。加入等体积环氧活化胶，反应24 h。反应结束后，用去离子水洗涤微球至中性，得到AAV多肽亲和介质。测定反应前后溶液中多肽的含量，计算得到多肽亲和介质的配基密度。

2.2.3 亲和介质形貌观察

用吸管吸取适量介质置于载玻片，盖上盖玻片，通过光学显微镜观察、拍摄并保存图像。

2.2.4 亲和介质粒径分析

采用激光粒度仪测定亲和介质的平均粒径及分布。操作时先清洗仪器，设置固定转速，待仪器自检参数稳定后，取适量介质与水的混悬液加入样品池，进行测定和分析。

粒径分布系数R_span的表达式为式(1)。

R_{\mathrm{s}\mathrm{p}\mathrm{a}\mathrm{n}}=\left(d_{\mathrm{0.9}}-d_{\mathrm{0.1}}\right)/d_{\mathrm{0.5}}(1)

式中：d_0.9、d_0.1和d_0.5分别为体积占全部微球总体积90%、10%和50%的微球直径，d_0.5左右两侧体积分布曲线下的面积相等，为体积平均粒径。

2.2.5 亲和介质压力流速曲线测定

将介质与水的混合浆液缓慢倒入层析柱 (φ1.0 cm×10 cm)，排出柱内气泡。待床层稳定后，以一定流速向柱内通入10倍柱体积的去离子水，然后将层析柱连接至层析系统。设置一定流速v_x 压柱至压力稳定，记录该流速下层析系统的压力；逐步增大流速，记录不同流速与压力的对应关系。

线速度v的表达式为式(2)。

v=\mathrm{60}{v}_x/S(2)

式中：S为层析柱截面积，cm²。

2.2.6 静态吸附实验

取初始浓度为1.0×10¹³ GC/mL和0.8×10¹³ GC/mL的AAV2溶液各50 μL作为目标蛋白样品，分别加入精确称量的10 mg亲和层析微球，于室温下吸附2 h后离心取上清液。采用甘氨酸-盐酸缓冲液 (pH 2.5) 进行洗脱并收集洗脱液，然后通过TSK G5000PWXL色谱柱对各组分进行高效液相色谱 (HPLC) 分析。

CLSM观察：取适量AAV溶液加入离心管，在避光条件下加入0.01 g FITC，立即混匀后于4 ℃染色4 h。反应结束后，用缓冲液反复洗涤以去除未结合的FITC，得到FITC-AAV。取0.01 g亲和介质进行FITC-AAV吸附实验，通过CLSM观测FITC-AAV与介质的结合情况。

3 结果与讨论

3.1 仿生多肽稳定性评价

3.1.1 酸碱稳定性测试

利用多孔凝胶固定相的独特特性，根据分子尺寸差异考察多肽样品的纯度变化 (图2)。多肽溶液在pH 2.0~9.0内的色谱峰形无变化，保留时间稳定在13.40~13.90 min，纯度均保持在94%以上，表明其未发生显著聚集或降解 (表1)。进一步说明该配基在层析介质制备及纯化过程中具有较强的稳定性，可耐受更广范围的溶液条件。

3.1.2 热稳定性测试

多肽配基的耐高温特性已被多项研究证实，例如Pham等^[20]设计了一种基于天然β-折叠多肽 (Trpzip2) 的工程化多肽Tz₂H₃，可耐受80 ℃高温；通过合理设计或化学修饰，还可降低多肽配基对温度的敏感性。本研究中多肽配基的温度变性测试曲线见图3，曲线整体表现为连续平滑的单相过渡，未出现多相拐点或突跃式变化，且在20～80 ℃未监测到波长变化，表明多肽配基未出现聚合或变性现象。

上述酸碱和热稳定性测试结果均表明，D16肽具有良好的稳定性。在AAV纯化工艺中，低pH洗脱是打破配基与衣壳蛋白结合的常规手段，传统配基易因酸性条件发生不可逆变性；而D16肽配基在pH 2.0洗脱条件下仍保持稳定，且具有优异的热稳定性，为后续规模化制备和纯化应用奠定了良好基础。

3.2 亲和介质形貌和流通性能

本研究采用五肽、十五肽分别制备D5亲和介质和D15亲和介质作为对照，其中五肽为理论计算中PKD2与AAV的关键接触区域肽段，十五肽为PKD2与AAV结合处的完整肽段。为加强多肽配基与AAV的亲和相互作用，进一步选用十六肽 (D16) 作为亲和配基。

图4为D5介质、D15介质、D16介质及Sengarose 4FF白球的光学显微镜图像，可见几种介质均呈规整球形，表明后续引入环氧基及偶联反应对介质的外观形貌无明显影响。

采用扫描电子显微镜观察各介质的微观表面结构 (图5)，可见不同配基的介质形貌与孔径相似，说明在吸附过程中，亲和介质吸附性能的影响因素主要为配基种类及其在介质上的结合情况。

图6为仿生多肽亲和介质及基质微球的粒径分布，可见以Sengarose 4FF为基质制备的D5介质、D15介质、D16介质平均粒径均为90 μm，粒径分布与空白基质基本一致。

图7为多肽介质及基质微球的流通性能测定结果，可见在0～800 cm/h流速内，亲和介质的压力-流速曲线接近线性，表明介质内部孔道贯通性良好，可满足AAV捕获步骤中高流速、长周期运行的工业化需求。

3.3 亲和介质吸附动力学研究

样品浓度归一化处理过程如下：对初始浓度设定为1×10¹³ GC/mL的标准品AAV2进行稀释，得到不同浓度的AAV体系，再通过HPLC分析获得各浓度对应的峰面积值；以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，建立AAV标准曲线。根据该曲线，采用HPLC法分析吸附前后AAV样品的浓度变化。D16介质对AAV2标品的吸附情况如图8所示，AAV标品的初始浓度为0.8×10¹³ GC/mL，吸附后和洗脱后上清液的目标峰均出现在15 min左右；吸附后上清液浓度明显降低，表明介质对AAV2具有吸附作用；洗脱液中除目标峰外，21.4 min时出现另一蛋白峰，推测洗脱过程中洗脱液pH值较低，可能导致AAV衣壳蛋白发生裂解。

通过CLSM考察AAV2扩散进入D16介质内部的过程：用D16介质吸附FITC-AAV2，分别在5 min、30 min、1 h、2 h时取样观察 (图9)。结果显示，当吸附5 min时，亲和介质内部已布满强度较弱的荧光，说明此时AAV2已扩散进入D16介质内部，但吸附量较低；当吸附30 min时，平均荧光强度较吸附5 min提升61.2%；当吸附1 h时，平均荧光强度提升105.0%，且介质内外层吸附能力无明显差异；当吸附2 h时，截面平均荧光强度和空间分布特征与吸附1 h时基本一致，说明此时AAV在介质内的扩散受孔隙结构限制，达到吸附平衡状态^[21]。此外，FITC-AAV2的吸附行为受限于介质内部孔道的传质阻力，当两者达到平衡状态时，结合量达到峰值。

图10(a)~(h) 为D16介质从顶部到底部等距层切的剖面图。沿Z轴逐层切片成像可见，荧光标记的AAV2病毒颗粒在介质各切面上均匀分布，这表明AAV2已吸附于整个介质内部孔道，此结果与图9中的荧光信号分布一致。上述现象说明，D16介质的孔隙结构能为AAV2提供低阻力的扩散路径，其均匀分布的配基位点有效避免了病毒在近表面区域过度富集，从而实现了全孔道空间的高效利用。

3.4 多肽种类对亲和介质吸附行为的影响

通过CLSM观察FITC-AAV2在不同多肽亲和介质内部的传质情况 (图11)。D5亲和介质整体荧光强度较弱，且荧光主要集中于介质外表面；D15介质的荧光均匀分布于整个微球，但强度仍弱于D16介质；D16介质的荧光强度最大且分布均匀。进一步对3种介质的最大横截面荧光强度进行定量分析，可知D16介质平均荧光强度为D5介质的3.3倍、D15介质的2.0倍。推测原因如下：五肽配基与AAV结合位点较少，多数多肽配基利用率较低，无法与AAV特异位点接触，导致AAV颗粒的捕获效率显著受限；十五肽配基通过延长分子链形成柔性连接臂，但氨基在多肽表面分布较广，偶联可能发生在多个位点，导致多肽以不同方向固定于琼脂糖微球基质，部分多肽的活性位点可能被遮挡或朝向基质内部，无法有效结合AAV；十六肽配基能将关键肽链部分进一步向空间延伸，大幅减小与AAV结合的空间位阻，从而有效提高结合效率。

3.5 配基密度对亲和介质传质行为的影响

配基密度是影响介质吸附性能的关键因素，直接决定最终分离纯化效果。研究表明，当配基密度为2.2~5.6 mg/mL时，D16介质对AAV2的吸附能力与配基密度呈正相关。结合荧光强度分析，当配基密度从2.2 mg/mL提升至3.7 mg/mL时，介质截面的平均荧光强度提升145.2%；当密度达到4.7 mg/mL时，平均荧光强度提升346.8%；当继续增加至5.6 mg/mL时，平均荧光强度提升550.8% (图12)。这表明适度提升配基密度可增加结合位点，显著增强介质的吸附能力。

3.6 亲和介质通用性研究

在AAV家族中，AAV9凭借突破性生物学特性成为新一代明星载体。与AAV2相比，AAV9能高效穿透血脑屏障实现中枢神经系统靶向递送，其转导能力在心肌病、代谢综合征等疾病模型中展现出独特优势。然而，现有商品化亲和介质大多针对AAV2优化设计，对AAV9的结合特异性与载量普遍不足，工业生产中常采用离子交换结合分子筛的多步纯化策略，大幅增加AAV的生产成本与工艺复杂性^[22]。本研究采用的亲和配基仿生AAVR是AAV2与AAV9的共同天然受体，可实现对AAV2与AAV9的通用性高效捕获。

进一步考察D16介质对AAV9的吸附性能，采用与AAV2相同的荧光标记策略，对FITC标记的AAV9与介质进行动态吸附实验，通过CLSM实时监测AAV9在介质内的吸附行为 (图13)。结果显示：在吸附初始阶段 (5 min)，介质截面仅出现零星分布的微弱荧光信号；当吸附30 min时，荧光信号强度显著提升，拍摄视野内可见大片荧光；当吸附时间延长至2 h时，荧光强度与空间分布特征趋于稳定，表明此时已达到动态吸附平衡状态。该现象与AAV2的吸附动力学特征具有相似性，说明亲和介质的孔道结构能有效克服病毒颗粒的空间位阻效应，实现对不同血清型AAV的捕获。

4 结 论

本研究对AAVR与AAV结合区域结合力最强的胞外结构域 (PKD2) 进行仿生，合成多肽亲和配基；采用1,4-丁二醇缩水甘油醚对Sengarose 4FF琼脂糖微球进行环氧活化，再将仿生多肽作为配基偶联至微球，制备出一系列AAV仿生多肽亲和介质。通过探讨多肽的酸碱与热稳定性，研究AAV与仿生多肽亲和介质的吸附行为，得出以下主要结论：

(1) 所制备的仿生多肽具有良好的酸碱与热稳定性。

(2) 以环氧活化胶偶联多肽的方式，通过控制配基偶联过程中的环氧基密度、多肽浓度和反应温度等条件，成功制备出配基密度为2.2～5.6 mg/mL的AAV仿生多肽亲和介质。在该密度范围内，D16介质对AAV2的吸附能力与配基密度呈正相关，配基密度由2.2 mg/mL提升至5.6 mg/mL，其吸附能力提升约5倍。

(3) 选用十六肽作为亲和介质配基，制备的D16介质有效解决了多肽亲和介质结合AAV2时存在的空间位阻效应。与D5、D15介质相比，D16介质对AAV2的吸附能力最优，分别为D5介质的3.3倍、D15介质的2.0倍。

(4) D16介质对AAV9表现出良好的结合性能，表明该仿生多肽亲和介质在AAV9纯化中具有应用潜力，对AAV的结合作用具有通用性。

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基金资助

国家重点研发计划资助项目(2023YFC2812001)

国家重点研发计划资助项目(2023YFC2812002)

国家自然科学基金资助项目(22278411)

国家自然科学基金资助项目(32471385)