纳米凝胶用于固定化酶的研究进展

Research Progress of Nanogels in Enzyme Immobilization

摘要

酶是一种大分子生物催化剂，其最大的特点是具有催化特异性，可选择性催化特定的底物发生化学反应，并极大提高反应速率。然而，酶的高级结构主要由一系列分子间弱相互作用维持，包括静电相互作用、氢键、疏水作用和范德华力等，这些弱相互作用容易受到温度、pH值等条件的影响，从而破坏酶的高级结构，导致酶的活性下降或丧失。聚合物纳米凝胶具有多孔网络结构，其比表面积大，粒径和孔道尺寸可调，内部网络亲水，作为优异的载体材料已被广泛用于药物递送和催化剂负载等领域。近年来，纳米凝胶被用于固定化酶的研究并显示出良好的应用前景。文章简要介绍了固定化酶的常用材料及方法，重点综述了纳米凝胶在固定化酶方面的最新研究进展和应用成果。

Abstract

Enzymes are macromolecular biological catalysts, characterized by their catalytic specificity, which allows them to selectively catalyze chemical reactions of specific substrates and significantly enhance reaction rates. However, the advanced structure of enzymes is primarily maintained by a series of weak interactions, including electrostatic forces, hydrogen bonds, hydrophobic interactions, and van der Waals forces. These interactions are susceptible to environmental factors such as high temperature, acids, and bases, which can disrupt the enzyme's tertiary structure, leading to a decrease or loss of enzymatic activity. Polymer nanogels, with their porous network structure, large specific surface area, tunable particle size and pore dimensions, and hydrophilic internal networks, have been widely used as excellent carrier materials in drug delivery, catalyst loading, and other fields. In recent years, nanogels have also been applied in enzyme immobilization research, demonstrating promising application prospects. This paper briefly introduces common materials and methods for enzyme immobilization, with a focus on reviewing the latest research and application progress of nanogels in enzyme immobilization.

Graphical abstract

关键词

纳米凝胶 / 固定化酶 / 酶催化 / 酶保护

Key words

Nanogels / Enzyme immobilization / Enzymatic catalysis / Enzyme protection

1 前 言

酶是一类天然大分子生物催化剂，其关键组成部分是活性中心，由催化基团和识别基团组成。催化基团是酶催化活性的根源，其作用在于断裂底物分子中特定的化学键并形成新的化学键，从而使底物分子发生特定的化学反应。催化基团中的关键组成部分是辅助因子，其在酶促反应中一般通过携带或转移电子、原子、功能基团来发挥催化的关键作用。识别基团可通过特异性地识别底物，使具有特定结构的底物与催化基团结合，赋予酶催化特异性，这也是酶区别于普通化学催化剂的最大特征。酶的催化特异性可以分为底物特异性与反应特异性^[1]。底物特异性，即酶可以选择性地针对特定的底物进行催化。例如，乙醇脱氢酶可高效地催化乙醇的脱氢反应，同时也可以较低的效率催化甲醇的脱氢反应，这类酶具有较低的底物选择性；脲酶只能催化尿素的水解反应，生成氨和二氧化碳，这类酶具有较高的底物选择性。酶的反应特异性，即一种酶通常只催化一类特定的转化形式。例如，L-氨基酸氧化酶可催化L-氨基酸的氧化反应，生成相应的酮酸、氨以及水；氨基酸消旋酶可催化L-氨基酸的外消旋作用，使其转化为D-氨基酸。这2种酶都具有反应特异性，只能催化一种反应类型。

酶能在非常温和的条件下催化化学反应，但其使用条件比较苛刻，通常在适宜的温度、pH值等条件下才具有最佳催化效果。当温度或pH值等条件改变时，其催化速率会显著下降^[1]。如图1(A) 所示，酶催化反应速率会随温度的升高而升高，但当温度超过一定值时，催化反应速率开始下降。如图1(B) 所示，酶催化反应的初始速率与温度之间呈现“钟型”关系，存在一个最佳温度。如图1(C) 所示，对酶进行热处理的温度越高，其催化活性下降得越多，这是由于高温处理会导致酶发生热变性而失活。同时，酶所处溶液环境的pH值也会影响其催化活性。大多数酶的活性与pH之间也呈现“钟型”关系，且存在一个最适宜的pH值^[2]，如图1(D) 所示。这是因为酶的高级结构主要由一系列分子间弱相互作用维持，包括静电相互作用、氢键、疏水作用、范德华力等。这些弱相互作用易受温度、pH值和离子强度等变化的影响，从而破坏酶的高级结构，导致酶活性下降或丧失。此外，一些物质会与酶发生反应，进而引起酶的结构变化或破坏酶的活性中心。例如，羟基自由基、过氧化氢等会与酶的氨基酸残基反应，使酶发生氧化损伤，从而导致酶活性不可逆转地降低，甚至完全丧失。

利用载体材料负载或结合酶，将其固定于载体表面或内部，即可实现酶的固定化。这样既可以提高酶在存储和操作条件下的稳定性，又便于其在完成催化反应后与反应介质有效分离。因此，开发酶的固定化技术和材料，以扩大酶的应用范围并实现其高效回收和重复利用^[3]，具有重要的科学意义和应用价值。近年来，有关固定化酶的新方法和新材料的研究引起了人们的广泛关注，其中利用纳米材料实现酶的固定化已成为酶催化领域的研究热点。不同种类的酶往往需要不同的固定化方法和材料，适用于不同的应用场景。本文概述了固定化酶的常见纳米材料与方法，重点介绍了纳米凝胶用于固定化酶的最新研究进展和重要应用实例。

2 固定化酶的纳米材料与方法

2.1 固定化酶的纳米材料

近30年来，已有多种不同类型的纳米材料被用于固定化酶的研究，包括石墨烯^[4]、介孔二氧化硅^[5]、金属有机框架材料 (MOFs)^[6]、磁性Fe₃O₄纳米粒子 (MNPs)^[7]、离子交换树脂^[8]、纳米凝胶等。石墨烯及其衍生物是固定化酶的重要载体，其中氧化石墨烯 (GO) 是石墨烯片的高度氧化形式，具有力学强度高、比表面积大等特点。Zhang等^[4]通过静电和疏水作用将辣根过氧化物酶 (HRP) 固定在GO表面，有效稳定了酶的有利构象，保持了酶的高效催化活性。MOFs是一种由金属离子或金属簇与有机配体通过配位作用构建的多孔结晶材料，其孔径均一，可将酶封装在孔隙内部，从而实现酶的固定化。Hu等^[6]通过扩散的方式将过氧化物酶-11封装到MOFs中，显著提高了其催化效率和稳定性。介孔二氧化硅是一种孔径为2~50 nm的多孔微球材料，具有良好的热稳定性、化学稳定性和生物相容性，已被成功用于水解酶、氧化还原酶等蛋白酶的固定化。介孔二氧化硅可减小外界环境对酶的损伤，有效提高酶的稳定性，使酶保持优良的催化性能^[5]。MNPs具有超顺磁性，能利用磁场使酶快速富集并从反应混合物中分离^[7]。由MNPs与二氧化硅等材料制备的复合纳米粒子，兼具磁分离性能和良好的酶吸附能力，在固定化酶领域应用广泛。Yang等^[9]利用介孔Fe₃O₄@SiO₂纳米颗粒同时负载葡萄糖氧化酶和L-精氨酸制备了磁性级联反应容器，用于产生活性氧。通过施加外部磁场可使纳米颗粒在感染性生物被膜内的同一深度均匀分布，并原位产生NO以杀死细菌。离子交换树脂是含有丰富官能团 (有交换离子的活性基团) 的交联网状聚合物，具有稳定的理化性质和多孔结构，是良好的固定化酶载体。Wang等^[8]利用螯合了Ni的离子交换树脂开展了对组氨酸标记酶的固定化研究，结果表明，固定化的组氨酸标记酶表现出优异的重复利用性，经过10次催化反应循环后，酶的保留活性仍高达92%。纳米凝胶是尺寸<200 nm的水凝胶，具有含水量高、吸收和负载能力强、框架结构稳定等优点，是非常重要的固定化酶载体材料。下文将对纳米凝胶用于固定化酶的研究和应用进行详细介绍。

2.2 固定化酶的方法

经过几十年的研究，不仅用于固定化酶的材料种类越来越多样，而且固定化酶的方法也得到了快速发展。到目前为止，人们已开发了多种不同的固定化酶方法，可逆的方法包括物理吸附、离子键合和亲和作用等，不可逆的方法包括共价键合、封装、包埋和化学交联等方法 (图2)。

2.2.1 物理吸附

物理吸附是一种简单且可逆的固定化酶技术，其常用的材料包括纤维素、氧化铝、水凝胶等^[11]。这种方法主要依靠载体材料和酶之间的弱相互作用力 (如氢键、疏水作用等) 将酶吸附于材料的表面或内部^[12]。该方法的优点是可选载体材料的种类繁多，缺点是载体对酶只有较弱的约束力，酶易从载体上脱落。因此，可通过在载体材料上修饰特定的基团来增强酶与载体之间的相互作用，提高固定化酶的稳定性，如图3所示^[11]。

2.2.2 静电结合

静电结合固定化酶技术主要依靠酶和载体材料之间的静电相互作用实现酶的固定化，这通常要求载体材料带有与酶相反的电荷^[13]。通过调节溶液的pH值或离子强度，可改变材料或酶的电荷性质，从而调控载体与酶之间的静电相互作用强度，实现酶的可逆固定化。需要说明的是，利用静电相互作用进行酶的固定化也存在一定的缺陷，如过强的静电相互作用可能会破坏酶的结构，导致酶的催化动力学发生变化，从而降低酶促反应的速率或产率。

2.2.3 亲和作用

亲和作用是生物分子特异性识别特定物质并与之结合的现象，通常包含静电、氢键、疏水作用、配位和弱共价键等多种相互作用^[14]。亲和作用可使酶与材料之间形成稳定的复合物，即实现酶的固定化，从而提高酶的催化活性，促进催化反应。亲和结合的主要优点是酶不会暴露在苛刻的化学条件下，有利于保持其高催化活性。Liu等^[15]发现了与胰蛋白酶具有较高亲和性的小分子配体2-硝基苯基-β-D-葡糖苷，将其与肝素琼脂糖凝胶偶联制备了亲和载体，并实现了胰蛋白酶的定向固定化。研究表明，利用亲和载体固定化胰蛋白酶的酶活达到340.8 U·g^-1，比活达到300.3 U·mg^-1，分别是未修饰亲和载体固定化酶的10倍和5倍。

2.2.4 共价键合

共价键合固定化酶技术是将酶与载体材料(如多孔二氧化硅、聚丙烯酰胺、琼脂糖、多孔玻璃等) 通过共价键连接，实现酶固定化的一种重要方法^[16]。共价键合固定化酶主要通过添加反应性分子改变聚合物的骨架以激活载体来实现^[17]。该方法具有诸多优点，如提高酶的稳定性和回收率。Ebadi等^[18]通过共价偶联将乙酰胆碱酯酶固定在多壁碳纳米管上，经10次循环回收后仍保留90%以上的初始活性。共价键合有时还可提高酶的特异性，如脂肪酶与乙醛琼脂糖共价键合后，其对应的选择性提高了3倍^[19]，且在高浓度的底物或强缓冲溶液中，酶从载体泄漏的概率显著降低。亲水性多糖聚合物是最常用的共价键合载体^[20]，通常需要在聚合物上引入亲电基团、环氧基团等，这些基因在温和条件下可与酶的氨基反应形成稳定的共价键，从而实现酶的固定化^[21]。虽然通过共价键合的固定化酶具有很多优点，但也存在一些局限性，如需要相对复杂的步骤和较长的孵育时间^[22]，需对酶进行额外的修饰，这些操作都可能导致酶变性失活。此外，共价键合还可能限制酶催化所需的构象变化，从而降低酶活性^[22]。

2.2.5 封装

封装法固定化酶是指将酶包裹在载体材料的网络结构中，从而形成不可逆的固定化酶体系^[23-24]。该方法通过载体材料网络限制酶的活动、迁移，而底物或产物则可在网络空隙中自由扩散^[25]。封装法固定化酶分两步进行：第一步将酶分散到可聚合单体溶液中，第二步对单体进行溶液聚合，从而将酶包裹在聚合物网络中。在此过程中，载体材料不与酶发生反应，可避免酶变性失活。封装法可提高材料的负载能力，降低制造成本，有效增强酶的稳定性。此外，通过对载体材料进行适当的改性，可为酶提供最佳的微环境。然而，封装也存在一些缺点，如交联密度或凝胶基质厚度过大，会导致传质阻力增加，从而使底物难以扩散到基质深处的酶活性位点^[26]。相反，如果载体孔径过大，则会导致酶泄漏。

2.2.6 包埋

包埋法是一种常见的固定化酶技术，是指将包载酶的多孔微囊泡束缚在聚合物基质中，多孔微囊泡的作用是为酶提供适宜的微环境^[13]。与封装法类似，酶因尺寸较大而不能在微囊泡和聚合物基质中随意迁移，但底物和产物可自由迁移^[27]。将酶包埋在聚合物基质中可避免其与不利的环境接触，使酶的活性持续较长时间，但包埋过程也可能降低酶的催化效率^[28]。包埋法通常采用由硝酸纤维素、尼龙、海藻酸盐和聚丙烯酰胺等制成的尺寸为10~100 μm的微胶囊泡将酶包裹起来，再将微胶囊泡包埋在聚合物基质中。常用的聚合物基质包括聚偏氟乙烯膜、聚酰胺膜、环氧树脂涂层等。包埋法的优点是可以方便地将2种及以上的酶共同固定化，从而获得高效的级联催化体系^[29]。但该固定化技术也存在一些局限性，如反应产物迅速聚集可能会使微胶囊泡破裂，从而导致酶扩散流失。

2.2.7 共价交联

交联是一种无载体的、不可逆的固定化酶技术，是指利用交联剂将相邻的酶分子连接到一起，形成三维交联聚集体。交联剂的作用类似于桥梁^[30]，可使酶之间通过共价键连接，从而形成稳定的网络结构。交联酶晶体 (CLEC) 和交联酶聚集体 (CLEA)^[16]是交联固定化酶的典型代表，2种方法均使用交联剂 (戊二醛) 与酶分子中赖氨酸残基的游离氨基发生交联反应，从而实现酶的交联固定化。交联固定化能有效提高酶对有机溶剂和高温的耐受性，同时具有良好的稳定性、高催化活性以及高回收利用率，因而在工业生物转化领域应用广泛。但基于CLEC的固定化方法要求酶具有结晶结构，且纯度较高，因此该固定化技术成本昂贵。CLEA是CLEC的改进方法，通过在水溶液中添加适当的聚集剂将酶分子结合在一起，从而产生由酶组成的不溶性物理聚集体，这些聚集体通过交联剂 (戊二醛) 发生交联反应^[31]，形成的CLEA表现出与CLEC相当的活性和稳定性^[31]。但使用戊二醛可能会导致酶的过度修饰，进而引发酶构象改变和活性丧失。

3 纳米凝胶性质及合成

3.1 纳米凝胶的特征及性质

Vinogradov等^[32]于1999年首次提出了“纳米凝胶”这一概念，用来描述由亲水性聚合物网络组成的胶体粒子。纳米凝胶通常指直径<200 nm的水凝胶粒子，是一种三维网状的纳米级聚合物交联体系，具有不熔不溶的特性^[33]。纳米凝胶具有很大的比表面积、良好的负载和吸收客体分子的能力，在药物递送和催化剂负载等领域被广泛研究和应用。例如，纳米凝胶能通过化学结合或物理包埋的方式负载药物^[33]，协助其穿过生物屏障到达病灶部位^[34]。此外，纳米凝胶还可通过生物降解或刺激 (温度或pH) 响应性结构变化实现药物或生物活性物质释放^[35]。纳米凝胶的三维结构具有良好的稳定性，能保护负载的蛋白类物质 (酶或蛋白类药物) 免受外界不良环境或体内复杂环境的影响，使其更好地发挥作用。因此，纳米凝胶用于固定化酶具有巨大的潜能，可显著提高酶的催化活性、稳定性、化学选择性，在生物医药、生物催化和生物传感^[36]等领域具有广泛的应用前景。

3.2 纳米凝胶的合成

根据形成方式的不同，合成纳米凝胶主要分为两类：一类是通过共价键形成的化学交联纳米凝胶，另一类是通过弱相互作用自组装形成的物理交联纳米凝胶^[37]，如图4所示。化学交联纳米凝胶指单体在交联剂的作用下，通过化学作用形成纳米尺寸的永久、稳定的聚合物网络结构^[38]。物理交联纳米凝胶是聚合物链在温和条件下通过氢键、静电相互作用、范德华力和疏水作用等非共价作用缠结形成的纳米粒子^[39]。对比两类纳米凝胶发现，化学交联纳米凝胶稳定性高，物理交联纳米凝胶的形态结构会随环境的变化而发生转变。

4 纳米凝胶固定化酶的位置及方式

纳米凝胶固定化酶的方法既有可逆的物理吸附，也有不可逆的共价键合。酶固定化在载体上既要考虑酶与载体之间的相互作用，也要考虑纳米凝胶的合成方法，以确保酶能被有效负载，并满足易回收利用的要求。常见的纳米凝胶固定化酶的位置有两种：一种是固定在纳米凝胶表面，另一种是包封在纳米凝胶内部(图5)。每种方式都有优缺点，酶固定化方法的选择取决于酶自身的结构和纳米凝胶与酶之间的相互作用。下文总结了一些纳米凝胶固定化酶的研究实例，如表1所示。

4.1 纳米凝胶表面固定化酶

表面固定技术是一种简单的酶固定化技术，即将酶固定在载体材料表面，这样既能提高酶的稳定性，又能保证酶与底物充分接触。纳米凝胶表面固定化酶的方式一般有两种，分别是共价键合和非共价吸附。共价键合是将酶与纳米凝胶通过共价键稳定连接；非共价吸附则是纳米凝胶通过氢键、静电相互作用、疏水作用等非共价作用将酶吸附在表面^[46]。将酶固定在纳米凝胶表面，可有效避免酶与纳米凝胶内部基团发生相互作用而导致酶活性损失。然而，非共价吸附的酶可能出现流失与泄漏，而共价键合则能显著提升酶的固载稳定性。

4.1.1 共价键合

利用纳米凝胶通过共价键将酶固定化在表面，需在纳米凝胶表面修饰特定的功能基团，如醛基、叠氮基团、环氧基团等，使它们与氨基(—NH₂)、羧基(—COOH)、巯基(—SH)、羟基(—OH)等酶自身的功能基团发生缩合、席夫碱、点击化学等反应，从而将酶偶联到纳米凝胶表面。

Liu等^[43]利用甲基丙烯酸羟乙酯和二甲基二烯丙基氯化铵聚合制备了内部含有Fe₃O₄磁性纳米颗粒的纳米凝胶，并用环氧氯丙烷对其进行表面活化 (图6)，得到了兼具磁性、正电荷和活性环氧基的纳米凝胶。该纳米凝胶可同时通过静电吸附和共价键合作用实现念珠菌脂肪酶的固定化，从而有效提高酶的稳定性，扩大酶的应用范围。此外，可利用纳米凝胶的磁性将固定化的念珠菌脂肪酶从反应体系中快速分离出来，酶活回收率达到60.4%。因此，这种磁性纳米凝胶是一种经济高效的固定化酶载体，可用于不同种类酶的固定化。

有机磷化合物被广泛用于农业害虫杀灭，但其残留物对人类和动物的健康危害极大，且在生态系统和农产品中的半衰期较长。芳基二烷基磷酸酶常被用于分解有害的有机磷化合物，但其催化活性在使用过程中容易丧失。Mesbah等^[40]利用席夫碱反应将芳基二烷基磷酸酶共价固定在由壳聚糖 (CS) 和肉豆蔻酸组成的纳米凝胶表面，有效增强了酶的稳定性。与游离酶相比，固定化酶的pH稳定性和热稳定性显著提高，关键催化动力学参数明显得到改善，催化活性保持时间大幅延长，经35 d后，其催化活性仍保留50%左右。因此，该纳米凝胶固定化芳基二烷基磷酸酶在清除有机磷农药方面具有重要的应用价值。

Raj等^[41]通过乳液聚合制备了一种由甲基丙烯酸、N-乙烯基吡咯烷酮和乙二醇二甲基丙烯酸酯组成的叠氮功能化纳米凝胶，利用其与炔基功能化酶之间的点击反应将蔗糖酶成功地固定在纳米凝胶表面。纳米凝胶固定化有效提高了蔗糖酶的储存稳定性、热稳定性和pH稳定性，实现了8次循环利用。在最佳条件下，固定化酶的米氏常数k_m和活化能E_a (3.511 kJ/mol) 与游离蔗糖酶接近。

4.1.2 非共价吸附

除共价键合外，纳米凝胶也可通过氢键、疏水作用、配位、静电相互作业等非共价作用将酶固定在表面。这要求纳米凝胶表面带有一些功能性基团，如苯硼酸、羧基、胍基等，以便与酶表面的氨基、羧基等基团发生较强的相互作用。Ahmed等^[44]利用反相微乳液聚合方法制备了聚丙烯酸纳米凝胶，其表面富含羧基，在碱性条件下带有大量负电荷，可用于正电性纤维素酶的吸附固定化，如图7所示。与游离酶相比，固定化纤维素酶在高温下的稳定性显著提高，在80 °C下仍能保持75%的水解活性，而游离酶的活性仅为45%。固定化纤维素酶可通过离心回收并重复使用，这对大规模工业生产具有重要意义。

Wang等^[45]以氨基功能化四氧化三铁 (Fe₃O₄-NH₂) 纳米颗粒为模板，以戊二醛为交联剂，通过交联作用将CS修饰到Fe₃O₄纳米颗粒表面，得到磁性纳米凝胶粒子Fe₃O₄/CS，它可通过离子吸附作用将葡萄糖淀粉酶固定在表面。通过研究固定在纳米凝胶表面上的葡萄糖淀粉酶的温度稳定性和重复利用性发现，固定化葡萄糖淀粉酶在65 ℃下仍能保持62.3%的水解活性，而游离酶的活性仅为43%；在常温下，经过10次循环反应后，固定化酶的保留活性仍有68.4%。因此，Fe₃O₄/CS表面固定化有效提高了葡萄糖淀粉酶的耐高温性和循环稳定性。

4.2 纳米凝胶内部固定化酶

将酶封装在纳米凝胶网络内部是一种常见的固定化酶技术^[47-48]。被封装于纳米凝胶内部的酶受到聚合物网络的保护，不易被外界环境影响，因而具有较高的催化活性、良好的有机溶剂耐受性和热稳定性。不仅如此，将两种或多种酶同时封装在纳米凝胶内部，可使它们高效协同地催化反应，构建生物催化级联体系^[49]，减少中间产物的扩散和分解，大大提高催化效率，实现高效生产。纳米凝胶内部固定化酶的方法主要分为共价键合、包埋封装和非共价吸附等，纳米凝胶内部固定化酶的研究应用实例如表2所示。

4.2.1 共价键合

共价键合固定化酶是指在合成纳米凝胶的过程中，通过共价键结合将酶固定在其内部。该技术主要包括两种方式：一是将双键功能化的酶与其他单体进行共聚形成纳米凝胶；二是将功能性聚合物与酶反应结合，再通过交联形成纳米凝胶。这2种固定化酶的共同点是酶与纳米凝胶网络之间存在共价连接，因而酶固定稳定性较高，但这类方法均涉及酶的化学修饰改性，可能会对酶的催化活性造成不利影响。

Yan等^[50]报道了一种简单高效的两步法制备单酶 (HRP)纳米凝胶的方法，如图8所示。首先，利用N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺与HRP表面的氨基反应，将双键修饰到HRP表面。其次，以双键功能化的HRP为单体与丙烯酰胺共聚形成纳米凝胶，从而将HRP以共价键合的方式固定在纳米凝胶内部。与游离HRP相比，纳米凝胶固定化HRP的稳定性显著提高，其活性维持在初始活性的91.8%~92.0%，且二者的米氏常数相近。

Liu等^[61]利用DNA抑制剂构建了一种结构精巧的复合酶骨架，将其与蔗糖酶 (Inv)、葡萄糖氧化酶 (GO _x ) 和HRP进行组装，再通过共价修饰将酶表面的双键与丙烯酰胺共聚，最后将这3种具有协同功能的酶原位封装在聚合物纳米胶囊中，如图9所示。该体系实现了多种酶在紧密空间中的规整排布，能精准地控制酶的组成比例，具有优异的稳定性、极高的催化效率以及良好的级联催化性能。由GO _x 催化产生的有毒中间体过氧化氢可迅速被HRP消除。利用该方法制备的包载乙醇脱氢酶和过氧化氢酶 (AO _x -CAT) 的纳米胶囊可用于清除血液中的酒精，有望成为一种高效的“解酒药”。

与上述双键功能化修饰的酶再聚合方式不同，Pich等^[55]利用N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 活化的水溶性功能化聚合物与纤维素酶在微乳液中反应形成纳米凝胶，并进一步利用双末端氨基功能化的聚乙二醇与纳米凝胶进行交联，成功将纤维素酶共价固定在纳米凝胶内部，如图10所示。研究表明，与游离纤维素酶相比，纳米凝胶固定化纤维素酶的稳定性明显提高。同时，调节纳米凝胶的交联度可以调控固定化酶的活性，这是因为交联度提高会显著影响酶的二级结构，从而降低酶活。因此，这种纳米凝胶固定化酶策略有望在生物催化、生物质转化和能源利用等领域得到广泛应用。

4.2.2 包埋封装

L-天冬酰胺酶 (ASNase) 是一种酰胺水解酶，被广泛用于天冬酰胺依赖性肿瘤的治疗^[62]。尽管在临床治疗上ASNase具有很好的治疗效果，但由于酶的抗原性，其在血液循环中易被识别并清除，因而治疗效果有限。Monajati等^[53]先将ASNase与NHS功能化聚合物聚 (羟丙基甲基丙烯酰胺-丙烯酸聚乙二醇酯) (P(HPMA-MPEGA)) 共价偶联，再将所得聚合物-酶偶联物与环糊精二聚体 (bisCD) 通过超分子自组装形成纳米凝胶，从而将ASNase以共价键合的方式固定在纳米凝胶内部，如图11所示。研究表明，纳米凝胶固定化有效提高了ASNase的抗肿瘤活性，降低了其抗原性，改善了其药代动力学特征，其半衰期比游离酶长8.1倍。

与上述案例通过共价交联形成纳米凝胶并将酶包埋封装在其内部不同，Sharma等^[59]则利用金属离子交联作用制备纳米凝胶用于酶的固定化(图12)。他们先将念珠菌脂肪酶 (CrL) 与海藻酸钠溶液预混合，采用油包水法制成乳液粒子，然后加入FeCl₃交联形成纳米凝胶，最终将CrL包埋固定在纳米凝胶内部。纳米凝胶固定化可有效提高CrL的热稳定性、储存稳定性和操作稳定性，避免酶在使用过程中降解或发生不利的构象转变。研究表明，固定化CrL的催化活性比游离CrL更高，重复使用性显著增强，循环8次后仍保留较高活性。这种纳米凝胶包埋固定化CrL是一种较为环保的生物催化剂，在促进酯化、酯交换和其他生物转化反应中具有较好的应用前景。

4.2.3 非共价吸附

非共价吸附法固定化酶是先合成纳米凝胶，再利用静电相互作用、疏水作用等非共价作用将酶吸附固定在纳米凝胶内部。这种方法的优点是简便易行，固定化过程不会对酶的结构和活性造成严重影响，但缺点是由于酶的大分子属性以及凝胶网络的空间限制作用，部分酶难以进入凝胶内部，因而固载量和固定化效率往往不高。Cai等^[34]以阴离子聚合物聚丙烯酸-b-聚乙二醇为模板，利用静电组装定向聚合法 (EADP) 合成了不同尺寸和交联度的聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯阳离子纳米凝胶，并利用静电相互作用将具有负电性的脂肪酶吸附包埋在纳米凝胶内部 (图13)。研究表明，这种阳离子纳米凝胶能在较大的pH、离子强度和温度范围内有效提高固定化脂肪酶的稳定性和催化活性。尺寸较小和交联度适中的纳米凝胶固定化酶有助于提高酶的活性，其中利用粒径为35 nm、交联剂质量分数为30%的纳米凝胶包埋固定化的脂肪酶，其催化活性为游离酶的4倍。这表明，通过精确调控纳米凝胶的网络结构与尺寸大小，可有效调控酶的活性和稳定性，从而使其适应于不同的应用场景。

Sawada等^[60]合成了一种胆固醇修饰的普鲁兰多糖 (CHP)，它可通过疏水缔合作用自组装形成纳米凝胶，并将脂肪酶吸附包埋在纳米凝胶内部 (图14)。CHP纳米凝胶固定化能有效抑制脂肪酶在加热过程中的变性和聚集，从而增强酶的热稳定性。同时，CHP纳米凝胶固定化还能避免酶在冻干过程中聚集，这对于提高酶的分散性和热稳定性，以及扩大酶的应用范围具有重要意义。

5 总结与展望

本文首先概述了酶的特异性和催化活性，阐述了酶作为生物催化剂的独特性质^[63]，详细介绍了多种常用的纳米材料及其在固定化酶制备中的具体应用方法，着重综述了纳米凝胶在固定化酶领域所取得的研究进展和应用成果。纳米凝胶作为一种固定化酶载体，凭借其卓越的生物相容性、大比表面积和出色的保水性^[64]，在固定化酶技术中展现出巨大的潜力。通过静电相互作用、疏水作用等其他非共价键合机制及共价交联的方式，纳米凝胶能有效地将酶固定在其表面或内部结构中^[65]。这种固定化策略不仅有助于克服传统游离酶存在的诸多局限，如易失活、难以回收等问题，还能显著延长酶的使用寿命，实现多次循环使用，降低生产成本^[66]。此外，纳米凝胶固定化酶通常表现出更高的催化活性和更广泛的适用条件，能在极端环境下 (如高温、强酸/碱环境) 保持较高的稳定性和耐受性^[67]。同时，纳米凝胶具备良好的结构稳定性及稳定的物理化学性质，因此固定化酶更易从复杂的反应混合物中分离纯化出来。更为重要的是，纳米凝胶还能支持多种不同类型的酶共同负载于同一载体上，这为构建高效的级联反应体系^[68]提供了理想的平台，极大地拓宽了酶在工业生产和科学研究中的应用范围。纳米凝胶固定化酶除具有上述诸多优点外，也存在一些不容忽视的问题 (表3)。例如，纳米凝胶的引入可能会阻碍底物分子接近酶的活性位点，从而导致传质阻力增加，降低催化效率；固定化可能会对酶的空间构象产生不利影响^[69]，甚至破坏其活性中心区域，最终削弱其整体的催化能力；部分纳米凝胶的合成步骤繁琐，材料昂贵，导致固定化酶成本较高。

近年来，纳米凝胶固定化酶技术已取得了巨大进步，但在实际应用中，科研人员仍面临诸多挑战和难题。其中的核心问题之一是催化中心的保护，酶作为生物催化剂，其催化中心是决定反应速率和特异性的关键部位。将酶用纳米凝胶固定化后，催化中心可能因化学或物理作用而遭到破坏^[70]，导致催化活性显著下降。这种破坏可能源于载体材料的化学性质，也可能与固定化酶过程中的温度、pH值等条件有关。此外，底物特异性识别能力减弱^[71]也是一个重要问题。酶在识别并结合底物时需要特定的空间结构和化学性质，即使酶的结构发生微小变化，也可能影响其底物识别能力，从而降低催化效率。然而，尽管存在这些挑战，纳米凝胶固定化酶技术仍展现出广阔的应用前景和无限的发展潜能^[72]。未来，该领域的研究重点应聚焦于开发既能有效保护酶的催化中心，又能维持其识别功能的创新性纳米凝胶材料。同时，通过设计新颖的保护策略，确保固定化酶免受来自载体本身的潜在损害以及外界环境的影响，进而显著提升酶的稳定性和使用寿命，这是实现固定化酶高效催化的关键所在。

随着计算化学和分子模拟技术^[73]的迅猛发展，科研人员已开始尝试利用这些先进的工具来精确预测和优化纳米凝胶固定化酶系统的性能。通过对纳米凝胶与酶之间复杂相互作用关系及其微观催化动力学过程^[74]进行深入剖析，有望构建出更加高效、稳定的新型纳米凝胶固定化酶系统。此外，在实际应用中，如何成功地将实验室中的研究成果转化为具有商业价值的大规模工业化生产工艺^[75]，也是当前亟待解决的关键问题之一。为此，需要不断改进和完善现有的固定化酶工艺流程，拓展相关应用的深度和广度，这是纳米凝胶固定化酶领域的重要发展方向。

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基金资助

天津市科技计划项目(23JCYBJC01780)