生物活性物质层析树脂清洗技术及工艺优化

Cleaning Technology and Process Optimization of Chromatographic Resins for Bioactive Substances

摘要

树脂作为层析工艺中的重要材料 (填料)，已经广泛应用于多个领域，如药品、食品、生物等行业。层析技术作为生物制药、食品工业和环境工程等领域高分子物质分离纯化的核心手段，其分离效能与层析介质 (树脂) 的使用寿命紧密相关。高效的清洗过程是维持树脂性能、保障产品质量及降低生产成本的关键环节。文章系统综述了层析树脂污染物的来源与类型，从物理作用、化学作用及生物作用多角度深入剖析清洗机理；重点论述了传统化学清洗 (酸、碱、盐、有机溶剂、表面活性剂) 与新兴清洗技术 (酶法清洗、电化学清洗、超声波辅助、超临界流体清洗) 的技术进展，分析比较了各类方法的优缺点与适用场景；同时探讨了清洗工艺开发与优化的策略 (清洗剂筛选、条件优化、在线监测与验证)，并综述了清洗效果的评价指标与方法，旨在为层析技术的科学应用与树脂的再生维护提供理论依据和实践参考。

Abstract

As an important material (filler) in chromatography processes, resin has been widely applied in various fields, such as the pharmaceutical, food, and biological industries. Chromatography technology, as a core means for the separation and purification of high-value substances in fields such as biopharmaceuticals, food industry, and environmental engineering, has a separation efficiency closely related to the service life of the chromatography medium (resin). An efficient cleaning process is a key link in maintaining the performance of resins, ensuring product quality and reducing production costs. This article systematically reviews the sources and types of contaminants in chromatographic resins and deeply analyzes the cleaning mechanism from multiple perspectives including physical, chemical and biological actions. The research progress of traditional chemical cleaning (acids, bases, salts, organic solvents, surfactants) and emerging cleaning technologies (enzymatic cleaning, electrochemical cleaning, ultrasonic-assisted cleaning, supercritical fluid cleaning) was mainly reviewed, and the advantages, disadvantages and applicable scenarios of various methods were analyzed and compared. Meanwhile, the strategies for the development and optimization of cleaning processes (including the screening of cleaning agents, condition optimization, online monitoring and verification) were discussed, and the evaluation indicators and methods for cleaning effects were summarized. This article aims to provide theoretical basis and practical reference for the scientific application of chromatography technology and the regeneration and maintenance of resins.

关键词

层析树脂 / 清洗工艺 / 清洗机理

Key words

Chromatography resin / Cleaning process / Cleaning mechanism

1 前 言

层析技术作为一种重要的分离纯化方法，广泛应用于食品、生物医药和环境等领域^[1]。层析填料 (又称层析树脂) 作为层析技术的核心组件，其性能直接影响分离效果。然而，随着使用频次的增加，树脂会逐渐被污染，导致树脂性能下降、寿命缩短^[2]或产生质量问题，因此需要定期清洗以恢复其功能^[3]。

一般而言，根据层析技术的分类不同，树脂的类型和特性存在显著差异。层析技术主要可分为离子交换层析、亲和层析^[4]、凝胶过滤层析，所使用的树脂一般为大分子交联聚合物，如经过基团修饰的琼脂糖等。不同层析技术所适用的范围有所不同，例如离子交换层析主要应用于蛋白质、核酸、多糖等带电分子的分离^[5]；亲和层析主要用于抗体、酶、激素等生物大分子的分离纯化^[6]；凝胶过滤层析主要用于蛋白质、多肽等大分子的分离，根据分子量大小进行分离。

在树脂循环使用过程中，进料液中的各种杂质 (如宿主细胞蛋白 (HCP)、宿主细胞脱氧核糖核酸 (DNA)、核酸、脂质、内毒素、色素、变性蛋白、无机沉淀等) 会不可逆或强有力地吸附在树脂表面、孔道内部或共价配体上^[7]。这种污染会导致以下一系列严重后果^[8]：

(1) 柱效下降：表现为色谱峰展宽、拖尾或分裂，分辨率降低；

(2) 载量损失：动态结合载量显著降低，需要更频繁更换树脂或增加层析柱体积，导致成本增加；

(3) 背压升高：污染物堵塞孔道或颗粒间隙，导致操作压力增加、流速降低，甚至损坏层析柱硬件；

(4) 产品纯度风险：污染物可能在后续洗脱步骤中被共洗脱，影响最终产品的纯度和质量；

(5) 树脂寿命缩短：强吸附的污染物累积会永久性损伤树脂功能基团或基质结构，导致树脂提前报废。

因此，高效、可靠、经济的清洗工艺是层析操作中至关重要的环节，直接关系到生产工艺的稳定性、产品的安全性和生产成本，需要不断根据树脂类型以及目标物的特点选择清洗试剂并对清洗工艺进行优化，以达到最大化去除各类污染物、最小化对树脂的损伤、最大限度缩短清洗时间和降低试剂消耗成本的目的。

本文旨在系统梳理层析树脂清洗领域的研究现状与进展。首先，深入解析不同类型污染物的性质及其在树脂上的吸附机理，这是理解清洗机制的基础。其次，从物理、化学和生物3个层面系统阐述清洗作用的基本原理，重点综述传统化学清洗方法和近年来涌现的新兴清洗技术的研究成果、应用效果及局限性，同时探讨清洗工艺开发与优化的科学方法，以及清洗效果评价的指标体系。最后，展望该领域未来可能的研究热点和发展趋势，为层析技术的可持续发展提供参考。

2 层析树脂污染物来源、类型及污染(吸附) 机理

2.1 主要污染物来源

2.1.1 进料料液

宿主细胞相关杂质：来源于表达体系 (如酵母) 的杂蛋白种类繁多、性质各异 (等电点、疏水性、分子量分布范围广)，是单抗和重组蛋白纯化中主要的污染物之一^[9]，可能通过离子交换、疏水作用或与配体非特异性结合吸附在树脂上。在乳制品行业中，牛奶中的脂肪、变性蛋白会在长期层析过程中累积在树脂内部。

宿主细胞DNA：为高分子量、带强负电荷的核酸片段，极易与阳离子交换树脂或带正电荷的配体发生强静电吸附，也能通过氢键或嵌入作用吸附^[10]。宿主细胞DNA残留是生物制品安全性的重要关注点。

脂质和内毒素：主要来自细胞膜。内毒素 (脂多糖) 带负电荷且具有疏水性尾部，可通过静电作用 (阴离子交换树脂风险高) 和疏水作用吸附，难以去除且对产品安全性影响巨大^[11]，脂质则主要堵塞树脂吸附孔道或覆盖疏水位点。

2.1.2 层析过程产生

变性/聚集蛋白：操作条件(pH、盐浓度、流速、温度) 不当或界面剪切力的存在，可能导致目标蛋白或杂质蛋白变性、聚集，形成更难溶解和去除的沉淀物吸附在树脂表面或深层孔道^[12-13]。

沉淀物：缓冲液组分 (如磷酸盐、硫酸盐) 在高浓度或特定pH下可能形成沉淀 (如磷酸钙)，从而堵塞孔道或占据吸附位点^[14]。

2.1.3 环境引入

微生物及其代谢产物：生产操作过程中若无菌控制不严，可能导致微生物生长并分泌黏性物质^[15]。

颗粒物/杂质：可能来自水、缓冲液或系统清洁残留。

2.2 污染物吸附的主要作用力

污染物在树脂上的吸附、残留、累积是多个作用力共同作用的结果。

2.2.1 静电相互作用

带相反电荷的污染物分子与树脂功能基团之间的库仑引力是离子交换层析的主要结合力^[16]，也是HCP、宿主细胞DNA、内毒素吸附在离子交换树脂上的主要机制^[5]。在乳制品工业提取活性蛋白过程中，常发生静电相互作用，由于洗脱不彻底或清洗不彻底，树脂上累积污染物，造成柱压升高，对生产造成不利影响。

2.2.2 疏水相互作用

非极性或弱极性区域之间的吸引力是疏水层析中的主要结合力，在离子交换、亲和层析中也可能参与杂质的吸附^[17]。脂质、变性蛋白 (通过其疏水区)、内毒素的脂质部分主要通过此力吸附在树脂上。

2.2.3 氢键

氢键是氢原子在供体原子 (如—OH、—NH)和受体原子 (如O、N) 之间形成的非共价相互作用^[18]。这种作用力在多肽、核酸、多糖类等多种污染物吸附中都可能扮演关键角色。

2.2.4 配位作用/金属螯合

某些污染物 (如含组氨酸、半胱氨酸的蛋白质及核酸) 可与亲和层析中的金属螯合配体 (如IMAC) 结合^[1]。

2.2.5 空间截留/物理堵塞

大分子 (如聚集蛋白、DNA、细胞碎片、脂肪) 或颗粒物机械性地滞留在树脂颗粒间隙或孔道狭窄处，而非通过特异性作用力吸附^[19]。

理解污染物类型及其与树脂间的主要作用力，是设计和选择有效清洗策略的第一步。根据不同的层析类型以及污染物的类型，选择合适的清洗试剂和清洗工艺，才能实现有效清洗。

3 层析树脂清洗机理

在层析工艺中，树脂清洗的本质是破坏或削弱污染物与树脂之间以及污染物分子内部的相互作用力，使污染物解吸附并从树脂孔道中移除。这是一个复杂的物理化学过程，涉及多种机理。

3.1 物理作用机理

扩散：清洗剂分子从主体溶液扩散到树脂颗粒内部 (孔道中)，污染物分子从吸附位点解吸附后反向扩散到主体溶液。这是清洗速率的关键限速步骤，遵循Fick扩散定律。提高温度、降低清洗剂黏度、减小树脂粒径、增加孔道连通性、延长接触时间均有利于扩散^[20]。

流体剪切力：流动的清洗剂在树脂颗粒表面和孔道内产生的剪切力，有助于剥离疏松附着的污染物层 (尤其是物理堵塞物)，并将解吸的污染物带离树脂表面，防止其重新吸附。增加流速可以提高剪切力，但需平衡扩散时间^[21]。

溶胀/收缩：某些清洗剂 (如强碱、有机溶剂) 可能引起树脂基质的溶胀或收缩，这种物理形变可能改变孔道结构，有助于释放截留其中的污染物^[22]。

3.2 化学作用机理

通常使用化学试剂与污染物或树脂基团的直接接触与反应来实现解吸。

3.2.1 水解

蛋白质水解：强碱 (如NaOH) 能水解蛋白质的肽键 (酰胺键)，特别是天冬酰胺 (Asn) 和谷氨酰胺 (Gln) 的侧链酰胺基，以及丝氨酸 (Ser)/苏氨酸 (Thr) 的酯键 (如果存在)。水解使大分子蛋白质断裂成较小片段，溶解度增加，更易被洗脱^[22-23]。已有研究结果表明，热NaOH溶液是去除蛋白类污染物的最有效和最常用的清洗剂。

核酸水解：强碱能水解RNA的磷酸二酯键 (DNA相对稳定，但在长时间高浓度碱作用下也会降解)，酸 (如HCl) 也能在一定程度上水解核酸。降解后的小片段核酸更易通过离子交换或扩散作用去除。

3.2.2 氧化还原

氧化剂 (如NaClO、H₂O₂)^[1]：通过氧化作用破坏污染物分子的特定基团，如氧化蛋白质中的巯基 (—SH) 形成二硫键或磺酸基，氧化色氨酸 (Trp)、酪氨酸 (Tyr)、甲硫氨酸 (Met) 等氨基酸残基，氧化破坏核酸碱基或糖环，氧化降解脂质和内毒素。氧化清洗效果强，但对树脂本身 (特别是多糖基质和某些配体) 损伤风险也高，需谨慎使用，尤其在食品工业中需经严格评估后方可使用。

还原剂 (如DTT、TCEP)：主要用于打断蛋白质分子内或分子间的二硫键 (—S—S—)，使聚集的蛋白解聚，或使紧密结合的蛋白结构松散，便于后续清洗剂发挥作用^[24]，常用于处理因二硫键交联形成的难溶性沉淀。

3.2.3 离子交换/电荷屏蔽

高浓度盐 (如NaCl、NaSCN)：通过提供大量抗衡离子 (如Na⁺)，与带电荷的污染物竞争结合树脂上的离子交换位点 (离子交换原理)^[25]。同时，高离子强度压缩扩散双电层，屏蔽污染物与树脂之间以及污染物分子之间的静电排斥或吸引力 (电荷屏蔽效应)^[26]。这是去除离子吸附类污染物 (如HCP、DNA、内毒素) 的基础，盐的种类和浓度是关键参数。

3.2.4 疏水作用破坏

有机溶剂 (如乙醇、异丙醇)：降低溶液的极性，削弱疏水作用力，使通过疏水作用吸附的污染物 (如脂质、疏水蛋白区域) 解吸^[27]。有机溶剂常与表面活性剂或盐共同使用，以提高清洗效果。

3.2.5 表面活性剂

非离子型 (如吐温20、吐温80)：通过吸附在污染物或树脂的疏水表面，降低界面张力，增溶疏水性物质，并防止其重新吸附^[28-29]。

阴离子型 (如十二烷基硫酸钠 (SDS))：除了增溶作用，其强负电荷还能通过静电排斥帮助解吸带负电的污染物 (需注意对树脂电荷的影响)，并能破坏蛋白结构。

3.2.6 pH调节

改变pH可以显著影响污染物和树脂功能基团的电离状态 (电荷性质)^[30-31]。对于蛋白质，调节pH远离其等电点可增加其净电荷量，增强其与树脂的静电排斥 (如果电荷相同) 或减弱静电吸附 (如果电荷相反)。例如，用低pH清洗阳离子交换树脂 (带负电的污染物在低pH下可能带正电，与树脂产生静电排斥)，或用高pH清洗阴离子交换树脂(带正电的污染物在高pH下可能带负电，与树脂产生静电排斥)。此外，pH还能影响某些化学键 (如酯键、部分肽键) 的稳定性。

3.2.7 配位竞争/金属离子剥离

使用高浓度螯合剂 (如乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸盐) 与金属离子 (Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺等)结合，将其从配体上竞争下来 (金属剥离)；或者使用竞争性物质 (如咪唑、组氨酸) 与目标分子竞争结合金属离子位点 (配位竞争)^[32-33]。清洗后通常需要重新加载金属离子。

3.3 生物作用机理

层析树脂清洗中的生物作用主要指的是酶解作用^[34]。使用蛋白酶可以特异性地催化水解蛋白质内部的肽键，将大分子蛋白质污染物降解成小肽或氨基酸，使其更容易从树脂上解吸和扩散出来，具有高效、相对温和 (对树脂损伤小)、特异性强的优点。核酸酶可以水解DNA和RNA的磷酸二酯键，将高分子量核酸降解成寡核苷酸或单核苷酸，有效去除导致高黏度和强吸附的核酸污染。其中，Benzonase (一种非特异性核酸内切酶) 因其高效广谱、耐受一定盐浓度和pH范围而被广泛应用。

需要明确的是，实际清洗过程通常是上述多种机理协同作用的结果。有效的清洗策略需要针对特定的污染物-树脂作用力组合，选择合适的清洗剂及其组合，并优化浓度、pH、温度、时间、流速等操作条件。

4 清洗方法与工艺调控

4.1 传统化学清洗方法

常规的化学清洗包括强碱清洗、酸清洗、盐溶液清洗、有机溶剂清洗、表面活性剂清洗、还原剂清洗^[35]。

4.1.1 强碱清洗

清洗作用机理：水解 (主要)、皂化脂质、破坏内毒素、使蛋白质变性 (暴露出更多位点)、杀菌。

应用特征：几乎是所有类型树脂去除蛋白、脂质、内毒素、微生物污染的首选和最常用方法。浓度范围通常为0.1~1.0 mol/L，接触时间从数分钟到数小时不等。以蛋白质为例，NaOH被引入层析树脂系统后，将在水中形成氢氧根离子 (OH^-)，这些离子能够与树脂中残留蛋白质的酸性氨基酸残基 (如谷氨酸和天冬氨酸) 中的负电荷相互作用，使蛋白质分子带负电荷，即碱与蛋白质发生反应后使其带上负电荷，分子之间产生斥力，蛋白质在水中的溶解性增加，从而更容易被水冲洗出去。

在加热条件下，碱会促使大分子的蛋白质水解为较小分子的氨基酸而溶解。进一步提高溶液的碱性会导致蛋白质解聚，即蛋白质的三维空间结构被打破，从而暴露出更多的氨基酸残基。这些暴露的残基能够与碱性溶液中的OH^-发生更多的相互作用，蛋白质分子的解聚也增加了其暴露表面积，提高了清洗效果。

技术优势：成本低、效果强、广谱性好、易于在线监测 (电导率)、可灭菌。

局限性：(1) 对树脂稳定性要求高，传统多糖基质(如琼脂糖)在长期高浓度碱处理下会水解，导致交联度下降、流速降低、载量损失；(2) 新型高交联或合成基质 (如聚丙烯酸酯、聚苯乙烯二乙烯苯) 耐碱性显著提高^[36]；(3) 对某些色素去除效果有限。

工艺调控方向：(1) 优化NaOH清洗参数，研究不同浓度、时间、温度对特定污染物去除效果和树脂寿命的影响，寻求最佳平衡点，如较低浓度 (如0.1~0.5 mol/L)、较长时间可能比高浓度、短时间对树脂更友好且能达到足够效果；(2) 针对较顽固的物质，如乳制品层析过程中涉及的脂肪、变性蛋白，可以使用NaOH与盐 (NaCl)、有机溶剂 (乙醇)、还原剂 (DTT) 或表面活性剂 (吐温) 组合清洗，增强对特定污染物的去除效果。

4.1.2 酸清洗

清洗作用机理：水解 (核酸)、溶解无机沉淀 (如磷酸钙)、改变电荷状态 (中和负电荷)、沉淀某些蛋白^[36]。

应用特征：主要用于去除金属离子沉淀、核酸 (特别是DNA)、某些在酸性条件下溶解度增加的污染物，也常用于阳离子交换柱清洗 (中和碱性污染物)，浓度通常为0.1~1.0 mol/L。

在乳制品工业层析技术中，酸清洗主要用于去除无机盐垢。其原理是：酸与矿物盐中的金属离子 (如钙、镁、铁) 发生反应，生成易溶的氯化物、水、二氧化碳等，随酸洗液排出，从而达到除垢的效果。其具体机理包括以下2个方面。(1) 酸解聚：酸可以与水中的金属离子发生酸碱中和反应，将其溶解为可溶性的盐或离子，例如，酸可以与钙镁盐结合反应，将其转化为可溶性的盐或离子，从而使矿物盐垢溶解。(2) 螯合作用：酸可以通过螯合作用与金属离子形成络合物，从而降低其溶解度，络合物的形成有助于将金属离子从设备表面解离，并增加其溶解性，从而易于冲洗。

技术优势：溶解无机沉淀效果好。

局限性：对蛋白质类污染物的去除效果通常不如碱；强酸对不锈钢设备有腐蚀性，需注意材质；可能引起某些蛋白质沉淀，反而加重污染。

4.1.3 盐溶液清洗

清洗作用机理：离子交换竞争、电荷屏蔽。

应用特征：去除主要通过静电作用吸附的污染物 (如离子交换柱上的HCP、DNA、内毒素)^[37]。其中NaCl最常用，而(NH₄)₂SO₄常用于疏水层析柱的清洗和再生。

技术优势：相对温和，对树脂损伤小。

局限性：单独使用时对强吸附污染物 (如某些HCP、聚集蛋白) 效果有限。

工艺调控方向：常与NaOH或其他清洗剂组合使用 (如1 mol/L NaCl溶解于0.1 mol/L NaOH)；研究不同离子种类和强度对不同类型污染物的解吸效率。

4.1.4 有机溶剂清洗

清洗作用机理：破坏疏水作用、杀菌、溶解脂类^[38]。

应用特征：去除脂质、脂蛋白、内毒素 (脂质A部分)、疏水性强的HCP。常用于疏水层析柱的清洗和保存，浓度通常为20%~70%。

技术优势：对去除疏水性污染物有效，有杀菌作用。

局限性：高浓度有机溶剂可能导致某些树脂 (特别是多糖类) 收缩或硬化，影响流速和载量；易燃，操作需注意安全；需彻底去除残留，否则可能影响后续层析或产品质量，尤其在食品行业需要严格评估后使用。

工艺调控方向：常与NaOH (如20%乙醇溶解于0.1 mol/L NaOH) 或表面活性剂联用，增强效果并降低所需浓度；研究其对不同基质树脂的兼容性。

4.1.5 表面活性剂清洗

清洗作用机理：降低表面张力、增溶疏水性物质、乳化脂质、防止再吸附 (非离子型)、破坏蛋白结构及静电排斥。

应用特征：去除脂质、疏水性蛋白、内毒素。吐温系列 (非离子) 最常用，相对温和；SDS (阴离子) 效果强，但难以彻底去除残留，且可能使蛋白变性沉淀，风险较高，较少用于生产柱清洗，多用于实验室或离线再生^[39]。

技术优势：吐温系列对疏水性和脂类污染物效果好。

局限性：吐温等非离子表面活性剂可能黏附在树脂上难以完全冲洗干净，残留物可能影响后续层析性能或产品分析；SDS残留问题更严重，且可能破坏树脂。

工艺调控方向：主要用于离线清洗或作为NaOH的添加剂 (如0.1%吐温80溶解于0.1 mol/L NaOH)^[40]。开发更易去除或无残留风险的新型表面活性剂是未来方向之一，但严格验证残留去除是关键。

4.1.6 还原剂清洗

清洗作用机理：还原断裂二硫键 (—S—S—→2—SH)，解聚蛋白聚集体。

应用特征：处理因二硫键交联形成的难溶性蛋白沉淀物。通常与其他清洗剂 (如NaOH、尿素) 联用，先还原打开聚集体结构，再由其他清洗剂去除^[41]。

技术优势：针对二硫键聚集物有特效。

局限性：DTT不稳定 (易氧化)，需新鲜配制；TCEP更稳定；需注意后续氧化问题；可能对某些含二硫键的配体有影响。

工艺调控方向：常作为组合清洗方案中的一环。

4.2 新兴清洗技术

4.2.1 酶法清洗

清洗作用原理：利用蛋白酶或核酸酶的特异性催化作用，将大分子污染物 (蛋白质、核酸) 高效降解成易去除的小片段^[42]。

技术优势：(1) 高效特异性，针对特定大分子污染物 (HCP、DNA) 降解效率高；(2) 温和性，通常在接近中性的pH条件和温和温度下操作 (如30~40 ℃)，对树脂基质和敏感配体(如Protein A)的损伤远小于强碱；(3) 显著延长树脂寿命，尤其是昂贵的亲和介质^[43]。

工艺调控方向：以蛋白酶清洗^[44]为例。(1) 广谱蛋白酶 (如Alcalase、Savinase)：用于去除多种HCP，研究证明其在Protein A层析后清洗中，能有效去除强吸附的HCP，恢复载量，并显著减少后续离子交换柱的污染负荷；常采用循环清洗模式以提高酶利用效率。(2) 特异性蛋白酶：研究开发针对特定宿主 (如CHO) 中难去除HCP的特异性蛋白酶。(3) 核酸酶清洗 (主要是Benzonase)^[44]：已成为去除DNA污染的金标准，尤其在澄清收获液和大体积料液处理中；也用于层析柱清洗，有效降解吸附的DNA，降低黏度，防止堵塞，常与低浓度盐 (提供Mg²⁺辅因子) 配合使用。(4) 酶组合与酶-化学组合：如蛋白酶+核酸酶联用去除蛋白和核酸复合污染；酶处理 (去除大分子) 后再辅以温和的化学清洗 (如低浓度碱盐)去除残余物和小分子污染物。

技术挑战：(1) 成本，高质量酶制剂成本相对较高，需优化酶用量、循环次数和工艺以提高经济性；(2) 残留与验证，酶蛋白本身是潜在的残留污染物，需要严格验证其去除效果(通过冲洗)和最终产品中的残留水平 (使用ELISA、PCR等高灵敏度检测方法)，这是法规关注重点；(3) 酶稳定性，在清洗条件下 (可能含低浓度有机溶剂、离液剂或极端pH残留) 的活性保持；(4) 最适条件筛选，针对特定树脂-污染物体系，筛选最有效的酶种类、浓度、pH、温度、作用时间和操作模式 (如流传或循环)^[45]。

展望：酶法清洗是层析树脂清洗领域最具前景的方向之一，随着酶工程技术的进步 (开发更稳定、高效、低成本、低免疫原性的酶) 和工艺优化经验的积累，其在工业生产中的应用将越来越广泛，尤其在单抗、基因治疗载体等高价值生物制品的亲和层析纯化中。

4.2.2 电化学辅助清洗

清洗作用原理：在层析柱内或外接装置中施加电场，利用电解产生的局部pH变化 (电极附近产生H^＋或OH^-)、氧化还原物质 (如阳极产生氧化剂ClO^-/O₃，阴极产生还原剂H₂/HO₂^-)、电渗流 (EOF) 或电泳作用来促进污染物的解吸附、降解或迁移^[46]。

技术优势：原位产生清洗剂，减少化学试剂添加；可实现更精准的局部清洗；具有杀菌潜力。

工艺调控方向：目前主要处于实验室研究阶段。有研究报道在离子交换膜或微流控层析装置中，通过施加电场能够有效去除吸附的蛋白或DNA。其在传统填充柱中的应用面临电极集成、流体分布均匀性、对树脂潜在影响等挑战。

4.2.3 超声波辅助清洗

清洗作用原理：利用超声波在液体中产生的空化效应 (气泡剧烈形成和坍塌)、微射流和声流效应。这些强烈的物理效应能促进清洗剂向树脂孔道内传质，破坏污染物与树脂表面的黏附，并加速解吸污染物的扩散^[47]。

技术优势：强化传质，可缩短清洗时间或降低清洗剂浓度；以物理作用为主，化学兼容性广。

工艺调控方向：主要用于离线清洗或小型层析柱的再生研究，也用于去除膜污染的研究。研究表明，超声波能显著提高NaOH溶液对污染琼脂糖凝胶的清洗效率。

技术挑战：超声波能量难以在大型层析柱内均匀分布；可能对脆弱的树脂基质 (尤其是传统琼脂糖) 造成物理损伤 (颗粒破碎)；在线集成和放大实现难度大；空化效应产生的局部高温可能影响树脂。

传统化学清洗 (尤其是NaOH及其组合) 仍是目前工业主流，其核心在于耐碱性树脂的持续改进和清洗方案的优化。酶法清洗因其高效、温和、可延长树脂使用寿命的优势，发展迅速，是当前研究热点和未来重要方向，尤其在亲和层析中。电化学、超声、超临界流体等新兴技术各有特点，但面临集成、放大、成本或效果局限性的挑战，距离大规模工业应用尚有距离，需要持续的基础研究和工程创新。

5 清洗效果评价

评价清洗效果需要综合运用多种指标和方法^[48]。

5.1 动态结合载量

动态结合载量是最核心、最直接的评价指标^[49]。在标准条件下 (流速、缓冲液、样品、穿透判定标准)，测定清洗后树脂对新一批料液中目标产物的结合能力 (通常以10%穿透时的载量表示)；然后将其与新鲜树脂或上次清洗后的动态结合载量比较，计算恢复百分比 (如≥90%或符合预定义标准)。动态载量的稳定是清洗有效的最有力证据。

5.2 柱效

通过注入非保留或弱保留的小分子探针 (如丙酮)，测定理论塔板当量高度或峰不对称因子。理论塔板当量高度降低 (柱效升高) 和峰形对称性 (As接近1) 改善表明流路更畅通、传质更好，反映物理堵塞的清除和流体分布的改善。

5.3 保留时间/洗脱峰形

目标产物在树脂清洗后层析中的保留时间和洗脱峰形应与清洗前 (良好状态) 或标准状态一致。异常的保留时间漂移或峰展宽、拖尾，可能预示残留污染或树脂损伤。

5.4 背压

在标准流速下运行，树脂清洗后柱压应恢复到接近初始水平或可接受范围。持续高压表明物理堵塞未完全清除。

5.5 污染物残留量检测

离线检测：收集清洗后的淋洗液或通过小试从树脂上洗脱残留物 (如用强洗脱缓冲液)，使用高灵敏度方法检测特定污染物残留。

6 结 论

层析树脂污染是制约分离纯化效率的核心问题，其本质是进料杂质 (HCP、DNA、内毒素)、过程副产物 (变性蛋白、沉淀) 及环境污染物通过静电、疏水、氢键等多重作用力在树脂上的不可逆吸附。高效清洗需精准匹配污染物-树脂作用机制：传统化学清洗以NaOH为核心 (水解蛋白、核酸，破坏内毒素)，通过优化浓度、温度及组合策略 (如NaOH与NaCl去除DNA、NaOH与乙醇去除脂质) 提升效果；酸处理溶解无机沉淀，盐溶液屏蔽电荷，有机溶剂破解疏水作用，表面活性剂增溶脂质，还原剂解聚二硫键交联物。新兴技术中酶法清洗 (蛋白酶及Benzonase) 因高特异性、温和性成为趋势，显著延长昂贵的亲和树脂寿命；电化学、超声波等技术仍处实验室阶段，面临工程放大挑战。

最后，清洗评价同样尤为重要，动态结合载量恢复率 (≥90%) 是核心标准，辅以柱效 (理论塔板当量高度及峰形)、背压、污染物残留检测 (如ELISA、PCR) 确保工艺稳定性。基于以上结论，未来研究将聚焦于酶-化学复合清洗的智能化控制、耐极端条件树脂开发，以强化清洗强度、提升在线监测技术实现清洗过程实时优化，推动层析技术向高效、绿色、低成本方向发展。

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