红毛五加多糖蛋白酶-反胶束法脱色脱蛋白方法的建立与优化

Establishment and Optimization of Proteinase-Reverse Micelle Method for Decolorization and Deproteinization of Acanthopanax giraldii Harms Polysaccharide

摘要

文章探讨了蛋白酶法与反胶束法联合应用于红毛五加粗多糖的脱色和脱蛋白工艺。通过单因素实验，确定了CTAB浓度、pH值以及多糖溶液与反胶束体积比为主要影响因素。基于这些因素，采用响应面法进行了工艺条件的优化，评价指标包括脱蛋白率、脱色率、多糖回收率以及三者的加权综合评分。优化后的工艺条件如下：首先，将粗多糖溶液的pH值调至6.5，随后按照1.2×10⁴ U/mL的浓度加入木瓜蛋白酶，并在40 ℃下酶解1.5 h。酶解完成后，再次调整多糖溶液的pH值至4.0，并加入NaCl至0.4 mol/L。然后，按照4∶1的体积比加入反胶束溶液 (正己醇、异辛烷、H₂O体积比为5∶65∶30，含CTAB 0.12 mol/L)，振荡5 min后离心收集水相。在优化后的工艺条件下，脱蛋白率高达84.71%，多糖脱色率达到88.90%，多糖回收率为80.15%。这一工艺为红毛五加粗多糖的脱色和脱蛋白提供了一种高效且实用的方法。

Abstract

This study aimed to establish a proteinase-reversed micelle method for simultaneous deproteinization and decolorization of crude Acanthopanax giraldii Harms polysaccharides (cAHP). According to the results of single-factor test, CTAB concentration, pH value and polysaccharide solution-reverse micelle volume efficiency were determined as the optimized conditions, and response surface methodology was then used to evaluate the interaction of several experimental parameters. The weight assignment method was applied to balance the deproteinization efficiency, decolorization efficiency and polysaccharide recovery efficiency of proteinase-reversed micelle. The process of decolorization and deproteinization of crude Acanthopanax giraldii Harms polysaccharides with proteinase-reverse micelle was obtained. The crude polysaccharide solution was adjusted to pH 6.5, and papain of concentration of 1.2×10⁴ U/mL was added. After enzymatic hydrolysis at 40 ℃ for 1.5 h, the solution was adjusted to pH 4.0 and NaCl was added to concentration of 0.4 mol/L. And then, the reverse micelle solution (n-hexanol:isooctane: H₂O = 5:65:30, V∶V, containing CTAB of concentration of 0.12 mol/L) was added in a ratio of 4∶1 (V∶V). After shock for 5 min, the water phase was collected by centrifugation. Under the optimal conditions, the decolorization efficiency was 84.71%, the decolorization efficiency was 88.90% and the polysaccharide recovery efficiency 80.15%. This process provides an efficient and practical method for the decolorization and deproteinization of Acanthopanax giraldii Harms polysaccharides.

Graphical abstract

关键词

红毛五加 / 粗多糖 / 蛋白酶法 / 反胶束法 / 脱色 / 脱蛋白

Key words

Acanthopanax giraldii Harms / Crude polysaccharide / Proteinase / Reversed micelle / Decolorization and deproteinization

1 前 言

红毛五加多糖是传统中药红毛五加 (Eleutherococcus giraldii Harms) 的重要活性成分。与许多中草药来源的多糖相似，采用传统水提醇沉法制备时，通常会有色素和蛋白等杂质混入，这对后续多糖结构解析、药理研究以及作用机制的阐明造成障碍。现有的脱色素和脱蛋白方法，如活性炭法、H₂O₂法、三氯乙酸 (Trichloroacetic Acid, TCA) 法和Sevage法，存在耗时、耗力^[1-3]等不足，或可能引起多糖和生物活性改变^[4]。因此，急需建立一种高效去除粗多糖中色素和蛋白质杂质的方法。

反胶束是表面活性剂分散在连续的有机相中，使其浓度超过临界胶束浓度 (Critical Micelle Concentration, CMC) 而自发形成的一种纳米尺度的聚集体，利用其胶束作用，可将色素杂质从多糖溶液中吸附去除^[5]。反胶束也可用于提取蛋白质、氨基酸和核酸等生物活性物质^[6]。蛋白酶可催化蛋白质分子中肽链断裂，生成短肽或游离氨基酸^[7-8]。利用酶与底物特异性结合的原理，酶与蛋白质结合并将其水解，达到除蛋白的目的^[9]。然而，关于采用蛋白酶法与反胶束法联用对粗多糖提取物脱蛋白、脱色的研究尚不多见。

本文尝试将蛋白酶与反胶束法联用，对红毛五加粗多糖进行脱蛋白和脱色，并采用权重分配法对蛋白酶-反胶束的脱蛋白率、脱色率和多糖回收率进行综合评分。

2 实验部分

2.1 仪器和试剂

仪器：RE-52旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；TH-梯度混合器，上海精科实业有限公司；V-5000H可见光分光光度计，上海元析仪器有限公司；HH-60数显恒温搅拌循环水箱，常州国华电器有限公司；P901酸度计，上海佑科仪器仪表有限公司；HC-3018高速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；HC-3618R高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司。

试剂：红毛五加茎皮，购于北京同仁堂集团有限公司；十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)，购于索瑞生物科技有限公司；中性蛋白酶，购于合肥博美生物科技有限责任公司；碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶，购于北京索莱宝科技有限公司；丙酮、无水乙醇，购于烟台远东精细化工有限公司；正丙醇、硫酸，购于国药集团化学试剂有限公司；正己醇，购于天津博迪化工股份有限公司；异辛烷，购于天津市富宇精细化工有限公司；盐酸 (HCl)、葡萄糖，购于莱阳经济技术开发区精细化工厂；氯化钠 (NaCl)，购于天津市华东试剂厂；过氧化氢 (H₂O₂)，购于天津市大茂化学试剂厂；苯酚，购于深圳市福林仪器科技有限公司。以上试剂均为分析纯。

2.2 实验方法

2.2.1 粗多糖的制备

将干燥的红毛五加茎皮粉末在58 ℃下用蒸馏水提取80 min，超声功率为85 W。收集提取液，加入4倍体积的乙醇，于4 ℃下沉淀过夜；8000 r/min离心20 min收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚脱水，减压干燥，得到干燥的棕色红毛五加粗多糖粉末^[10]。使用前，将红毛五加粗多糖用蒸馏水配成10 mg/mL溶液。

2.2.2 蛋白酶-反胶束法脱色脱蛋白

用0.5 mol/L HCl溶液将粗多糖溶液pH调至蛋白酶最适pH，加入1.2×10⁴ U/mL的蛋白酶，并在其最佳温度下水解2.0 h，沸水浴10 min后终止反应。再用0.5 mol/L HCl溶液将酶解后的粗多糖溶液pH调至4.0，加入NaCl至0.1 mol/L。将反胶束溶液 (正己醇、异辛烷、H₂O的体积比为5∶65∶30，含0.1 mol/L CTAB) 与粗多糖溶液以体积比1∶7混合，剧烈振荡5 min后静置10 min，5000 r/min离心10 min，收集水相。

2.2.3 单因素实验

单因素实验分别考察了蛋白酶类型 (木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶)、酶量 (0.8×10⁴、1.2×10⁴、1.6×10⁴、2.0×10⁴、2.4×10⁴ U/mL)、酶解时间 (0.5、1.5、2.5、3.5 h)、CTAB浓度 (0.01、0.05、0.10、0.20、0.25 mol/L)、NaCl浓度 (0.05、0.10、0.20、0.40、0.60 mol/L)、多糖溶液-反胶束体积比 (3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1) 和pH值 (2、3、4、5、6、7、8、9)。

2.2.4 响应面法

基于上述单因素实验结果，选取CTAB浓度 (X₁)、pH值 (X₂)、多糖溶液-反胶束体积比 (X₃) 为考察因素，以Y值为响应值，进一步进行响应面优化实验。响应面实验的因素与水平见表1。

2.2.5 统计分析

每项实验设置3个重复。数据以均数±标准差 (x̄±SD) 表示，采用单因素方差分析，并通过Duncan多重极差检验进行组间比较。p<0.05时，认为差异具有统计学意义。所有统计分析均采用SPSS statistics 21.0、Expert design 8.0和SAS 9.3进行。

2.3 数据分析

2.3.1 脱蛋白率的测定

采用Bradford方法，以牛血清白蛋白 (BSA) 为标准品，测定蛋白质浓度^[11]。数据以x̄±SD表示 (n=3)。按式 (1) 计算脱蛋白率R_{\mathrm{A}}：

R_{\mathrm{A}}=\frac{C_{\mathrm{0}}{V}_{\mathrm{0}}-C_{\mathrm{e}}{V}_{\mathrm{e}}}{C_{\mathrm{0}}{V}_{\mathrm{0}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}(1)

式中：C₀和V₀分别为蛋白酶-反胶束处理前溶液的蛋白浓度 (mg/mL) 和体积 (mL)；C_e和V_e分别为蛋白酶-反胶束处理后溶液的蛋白浓度 (mg/mL) 和体积 (mL)。

2.3.2 多糖脱色率的测定

将粗多糖溶液于300~900 nm波长范围内进行全波长扫描，在最大吸收波长480 nm处测定吸光度^[12]。数据以x̄±SD表示 (n=3)。按式 (2) 计算多糖脱色率R_{\mathrm{B}}：

R_{\mathrm{B}}=\frac{A_{\mathrm{0}}-A_{\mathrm{e}}}{A_{\mathrm{0}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}(2)

式中：A₀和A_e分别为蛋白酶-反胶束处理前后溶液的吸光度值。

2.3.3 多糖回收率的测定

使用葡萄糖作为标准品，通过苯酚硫酸法测量多糖的浓度^[13]。数据以x̄±SD表示 (n=3)。按式 (3) 计算多糖回收率R_{\mathrm{C}}：

R_{\mathrm{C}}=\frac{C_{\mathrm{e}}{V}_{\mathrm{e}}}{C_{\mathrm{0}}{V}_{\mathrm{0}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}(3)

式中：C_{\mathrm{0}}、C_{\mathrm{e}}与V_{\mathrm{0}}、V_{\mathrm{e}}分别是蛋白酶-反胶束处理前后溶液的多糖浓度 (mg/mL) 与体积 (mL)。

2.3.4 权重分配法综合评分

引入Y值来评估蛋白酶-反胶束的纯化效果^[14]。数据以x̄±SD表示 (n=3)。Y值按式 (4) 计算：

Y=\frac{A_{\mathrm{n}}-A_{\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}}}{A_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}-A_{\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}}}\times \mathrm{35}\mathrm{\%}+\frac{B_{\mathrm{n}}-B_{\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}}}{B_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}-B_{\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}}}\times \mathrm{35}\mathrm{\%}+\frac{C_{\mathrm{n}}-C_{\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}}}{C_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}-C_{\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}}}\times \mathrm{30}\mathrm{\%}(4)

式中：A_n、A_max、A_min分别为脱蛋白率的实际值、最大值、最小值；B_n、B_max、B_min分别为脱色率的实际值、最大值、最小值；C_n、C_max、C_min分别为多糖回收率的实际值、最大值、最小值。

3 结果与讨论

3.1 单因素实验

3.1.1 蛋白酶类型对Y值的影响

将相同酶活单位 (1.2×10⁴ U/mL) 的3种蛋白酶 (木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶) 加入红毛五加粗多糖溶液中，分别在其最佳条件下反应2.0 h。如图1所示，木瓜蛋白酶的Y值最高，为63.94%，碱性蛋白酶为45.49%，中性蛋白酶为57.93%。因此，木瓜蛋白酶被选择用于进一步研究。

3.1.2 蛋白酶量对Y值的影响

研究某一单一变量时，其他变量固定如下：酶解时间为1.5 h，CTAB浓度为0.10 mol/L，NaCl浓度为0.40 mol/L，多糖溶液-反胶束体积比为5∶1，pH值为4.0。如图2(a) 所示，当酶量在0.8×10⁴~2.4×10⁴ U/mL范围内时，Y值随酶量的增加而增大，在1.2×10⁴ U/mL处达到峰值；此后继续增大酶量，Y值则缓慢降低。这可能是因为木瓜蛋白酶在水解蛋白质的同时，将蛋白质水解物重新合成为类蛋白质^[15]，从而影响蛋白质去除率。因此，1.2×10⁴ U/mL被认为是最佳酶量 (p<0.05)。

3.1.3 酶解时间对Y值的影响

如图2(b) 所示，其他条件固定时，Y值在酶解时间0.5~1.5 h范围内逐渐升高；当酶解时间超过1.5 h后，Y值降低。这可能与过量蛋白酶引起的空间位阻导致酶活性降低有关^[16]。因此，酶解时间1.5 h为Y值的最优条件 (p<0.05)。

3.1.4 CTAB浓度对Y值的影响

如图2(c) 所示，其他条件固定时，在0.01~0.10 mol/L范围内，Y值随CTAB浓度的增加而增大。CTAB浓度超过0.10 mol/L之后，Y值缓慢降低。这可能是因为表面活性剂浓度越高，则反胶束体系的黏度越高，乳化程度越高，多糖回收率随之降低^[17]。此外，还会形成相对复杂的聚集体，降低杂质去除率^[18]。因此，CTAB的最佳浓度为0.10 mol/L。

3.1.5 NaCl浓度对Y值的影响

如图2(d) 所示，其他条件相同时，在0.05~0.40 mol/L范围内，Y值随NaCl浓度的增加而增大。当NaCl浓度超过0.40 mol/L时，Y值下降。这是因为当多糖溶液中加入过量的盐时，会削弱蛋白质、色素与反胶束之间的静电吸引力^[19]，从而降低脱蛋白和脱色效果。因此，选择0.40 mol/L的NaCl浓度进行后续实验 (p<0.05)。

3.1.6 pH值对Y值的影响

如图2(e) 所示，其他条件相同时，Y值随着pH值的增加而增加，并在pH值为4.0时达到峰值 (p<0.05)。然而，当pH值超过4.0时，Y值降低。水相pH值对蛋白质和色素去除效果的影响主要体现在其改变两者表面电荷和解离状态的能力上，调节pH可以使蛋白质和色素分子与反胶束体系之间的静电排斥作用发生改变，从而影响杂质的去除率^[20]。因此，选择pH=4.0用于进一步研究。

3.1.7 多糖溶液-反胶束体积比对Y值的影响

如图2(f) 所示，其他条件相同时，当多糖溶液与反胶束体积比在3∶1~5∶1范围内时，Y值不断增大 (p<0.05)。然而，随着体积比的继续增加，Y值变化不再明显。从经济的角度来看，5∶1 (V∶V) 为最佳体积比。

3.2 响应面和SAS分析

基于单因素实验结果，发现CTAB浓度、多糖溶液-反胶束体积比、pH值3个因素对因变量Y值影响最大，因此采用Design-Expert 8.0软件对这3个因素进行响应面分析。在3个水平上使用Box-Behnken设计进行研究，以Y值为响应值。实验方案和结果见表2。

通过SAS 9.3软件对表2数据进行分析，得到如下二次响应面回归模型：Y=88.91+4.16X₁-0.45X₂-0.53X₃+1.42X₁X₂+0.045X₁X₃+0.13X₂X₃-3.22X₁²-1.02X₂²+0.89X₃²。

如表3所示，在α=0.05的条件下，回归模型有意义，模型拟合度显著。回归模型的决定系数 (R²) 为0.9642，表明Y值总变异的96.4%可以用模型来解释，模型可用于估计Y值。线性项和二次项表明单因素及其自身平方效应对Y值有显著影响，而交叉项表明两因素之间的相互作用对Y值的影响不显著。

如表4所示，各因素对Y值的影响程度依次为：CTAB浓度>多糖溶液-反胶束体积比>pH值。

从表5可以看出，这3个因子的特征值分别为正、负，表明第二个响应面是不存在极值的鞍形曲面。因此，最优的工艺参数不能直接从第二个响应面获得，需要做进一步的岭脊分析。

表6为岭脊分析结果，在编码半径为1时获得最大响应值。当CTAB浓度为0.12 mol/L、pH值为4.02、多糖溶液-反胶束体积比为4.12∶1时，估计响应值为89.46。

考虑到实验的可操作性，最佳的脱色和脱蛋白工艺确定如下：CTAB浓度0.12 mol/L，pH 4.0，多糖溶液-反胶束体积比为4∶1。

3.3 模型验证

为了验证模型的准确性，在优化工艺条件 (n=3) 下进行了验证实验。从表7可以看出，该工艺下脱蛋白率、脱色率、多糖回收率和Y值相对稳定，分别为84.71%±0.68%、88.90%±2.06%、80.15%±1.21%和81.89%±2.62%，重现性较好。此外，红毛五加多糖溶液在纯化前后的照片 (图3(b)) 直观显示了蛋白酶-反胶束的优良脱色效果。

3.4 红毛五加多糖红外光谱分析

为了验证蛋白酶-反胶束法是否影响红毛五加多糖的官能团，对蛋白酶-反胶束法和Sevage法纯化后的红毛五加多糖^[21]进行FT-IR光谱分析。如图3(a) 所示，传统Sevage法和蛋白酶-反胶束法纯化红毛五加多糖的FT-IR谱无显著差异。FT-IR光谱中，3415 cm^-1附近的羟基 (—OH) 特征峰、1619 cm^-1处碳氧双键 (C=O) 的不对称吸收峰和1141 cm^-1处糖苷结构C—O—C的强特征峰均保持不变，证明蛋白酶-反胶束法未破坏多糖的主要官能团结构。

3.5 不同方法的脱色和脱蛋白比较

为了验证蛋白酶-反胶束法的优越性，将其与传统脱色和脱蛋白方法进行比较。如图4(a) 所示，蛋白酶-反胶束法的脱色率 (88.90%) 和多糖回收率 (80.15%) 均高于H₂O₂法和活性炭法。如图4(b) 所示，与传统脱蛋白方法相比，蛋白酶-反胶束法的脱蛋白率 (84.71%) 和多糖回收率高于Sevage试剂和TCA试剂。

4 结 论

本研究成功地为植物多糖纯化中蛋白和色素杂质的去除建立了一种新的方法。通过将蛋白酶与反胶束萃取技术相结合，实现了对红毛五加粗多糖的高效脱色和脱蛋白，得到了最佳工艺条件：木瓜蛋白酶1.2×10⁴ U/mL，40 °C酶解1.5 h，然后调节溶液pH值为4.0，并加入NaCl至0.4 mol/L，再按4∶1的体积比加入反胶束溶液 (正己醇、异辛烷、H₂O的体积比为5∶65∶30，含CTAB 0.12 mol/L) 振荡5 min，离心收集水相。在该条件下，脱蛋白率为84.71%，多糖脱色率88.90%，多糖回收率为80.15%。

这一性能显著优于先前报道的类似方法，如宋逍等^[26]采用的反胶束法脱色率为80.25%，李倩倩等^[27]采用木瓜蛋白酶法的蛋白去除率为77.07%。这表明本研究所提方法不仅杂质去除率高，而且能够同时实现脱色和脱蛋白的双重目的，在红毛五加粗多糖纯化中具有重要的应用前景。

本研究通过单因素实验和响应面法，优化了蛋白酶-反胶束法的脱色与脱蛋白工艺。实验结果表明，CTAB浓度、多糖溶液-反胶束体积比以及pH值是影响该工艺性能的主要因素。其中，CTAB浓度对多糖脱色效果的影响尤为显著。高浓度的CTAB会增大反胶束体系的乳化程度，这可能降低多糖保留率，同时也可能改变反胶束团的形状^[28]，形成复杂的聚集体，进而降低杂质的去除率。因此在实际应用中，需要综合考虑各种因素，确定合适的CTAB浓度，以获得最佳的纯化效果。

与传统的离子交换法、H₂O₂法、吸附树脂法、活性炭吸附法等多糖脱色方法^[29]，以及TCA法、酶解法、Sevage法、HCl法、NaCl法、重金属离子沉淀法、三氟三氯乙烷法等脱蛋白方法^[30]相比，蛋白酶-反胶束法展现出更高的效率、更低的溶剂消耗、更短的处理时间和更环保的反应条件。此外，该方法在处理过程中不会对多糖的结构造成破坏，有利于保持多糖的生物活性和功能性。这些优势使得蛋白酶-反胶束法在多糖纯化领域具有广泛的应用前景。

未来，将进一步研究该方法在其他植物多糖纯化中的应用，通过技术创新和参数优化，提高该方法在多糖纯化领域的效率并拓展其应用范围。此外，还将探讨如何降低该方法的成本，以实现其在工业领域的推广应用。

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基金资助

国家自然科学基金项目(81303198)

山东第二医科大学大学生创新创业训练计划(X2023502)