液体活检技术在乳腺癌领域中的研究及应用现状

Research and application of liquid biopsy in breast cancer

摘要

液体活检作为一种新兴的无创活检技术，广泛应用在肿瘤诊疗领域。其通过对血液、尿液等体液检测，获取肿瘤组织衍生生物标记物，因具有操作简便、可重复性好、非侵入性等特性，为肿瘤精准医疗带来变革。乳腺癌作为女性高发恶性肿瘤，其早期诊断与精准治疗对改善患者预后至关重要，在此背景下，液体活检技术在乳腺癌领域的应用价值备受关注。本文结合近年来国内外研究文献，从液体活检的检测技术及其在乳腺癌中的应用进展两方面展开探讨。文献复习结果表明，虽然循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA、外泌体、肿瘤相关微粒和肿瘤教化血小板的检测原理和技术特点不同，但这些液体活检指标为乳腺癌的早期筛查及临床诊断、肿瘤分期及预后评估以及治疗反应评估提供了强大助力。这些结果表明液体活检技术在乳腺癌领域应用前景广阔，未来仍需推进技术优化和整合，以促进其在乳腺癌临床诊疗中的广泛规范应用。

关键词

液体活检 / 乳腺癌 / 循环肿瘤细胞 / 循环肿瘤DNA / 外泌体

Key words

Liquid biopsy / Breast cancer / Circulating tumor cells / Circulating tumor DNA / Exosomes

液体活检是近些年新兴的疾病诊断和监测工具，广义上指对以血液为主的非固态生物组织进行取样和分析，肿瘤诊治是其主要应用领域。与传统的瘤体活检技术相比，其优点在于取材范围更广泛、创口明显更小。循环肿瘤细胞（Circulation tumor cells，CTCs）^［1］、循环肿瘤DNA（Circulation tumor DNA，ctDNA）^［1］、外泌体（Exosomes，Exs）^［2］、肿瘤相关微粒（Tumor associated microparticles，taMPs）^［3］和肿瘤教化血小板（Tumor-educated platelets，TEPs）^［4］等液体活检技术在包括乳腺癌等多种癌症的早期诊断、预后评估及疗效评价方面都广泛应用，促进了主流精准个体化医学的发展。本文就几种液体活检的检测技术研究进展进行综述。

1 液体活检技术

1.1　循环肿瘤细胞（CTCs）

CTCs是指从实体肿瘤的原发或转移灶中脱落，进入血液循环，游离在外周血中的异质性肿瘤细胞群^［1］。外周血中存活的CTCs数量很少，通常为0～1 000个·（7.5 mL）^-1，被认为是一种新型的肿瘤生物标记物^［5］。临床研究指出，乳腺癌的原发灶尚未出现明显症状之前，肿瘤细胞就可能已经从原发肿瘤组织脱落，形成CTCs，并随着血液循环到达远处组织，进行种植、生长，最终形成转移性病灶^［6］。因此对血样中CTCs进行分离、富集和定量，对患者的早期筛查和临床诊断具有重大指导价值。目前分离富集CTCs的技术多种多样，见表1。与正常外周血细胞相比，CTCs核质比大、体积大，直径约为10~20 μm。目前基于免疫磁珠的阳性富集法代表技术Cell Search是唯一获得美国食品药品监督管理局临床许可的CTCs检测技术，特异性较高^［7］。BIDARD F C等^［8］用Cell Search技术对1 944例转移性乳腺癌患者的数据进行了分析，发现911例患者治疗前CTCs数目超过5个·（7.5 mL）^-1，相比于CTCs数目低于5个·（7.5 mL）^-1的患者，治疗前计数水平高的患者，其总生存期（Overall survival，OS）和无进展生存期（Progression-free survival，PFS）显著更短。因此，对晚期乳腺癌患者而言，治疗前基线及治疗后随访得到的CTCs计数≥5个·（7.5 mL）^-1，可作为预测OS和PFS的独立预后指标^［9］。

1.2　循环肿瘤DNA（ctDNA）

ctDNA是坏死或凋亡的肿瘤细胞释放入血液中的单链或双链DNA片段，来源于原发性肿瘤、微转移灶、转移灶和CTCs等^［10］。相比于正常体细胞DNA，ctDNA的片段明显更短，大小为160~180 bp，但却有和肿瘤组织一样的遗传信息，如拷贝数改变、结构变异和肿瘤相关单核苷酸变异，这些信息有助于对乳腺癌患者ctDNA进行鉴定^［11］。ctDNA的半衰期很短，通常只有十几分钟到数小时，一旦进入外周循环，很快就会通过脏器从体内清除^［12］。虽然这给ctDNA的检测带来挑战，但其检测信息有助于检测微小残留病灶和隐匿性转移瘤及确定治疗反应和耐药性。ctDNA检测技术概括为2种：⑴基于已知基因突变位点进行定量检测的数字化聚合酶链式反应（Digital polymerase chain reaction，dPCR）技术；⑵靶向多基因，实现对未知目标基因和未知突变筛查的二代测序技术（Next-generation sequencing，NGS）（表1）。NGS和dPCR技术的进步推动了ctDNA检测相关研究的进程。NIK-ZAINAL S等^［13］分析了560例乳腺癌患者的全基因组序列，发现93个蛋白质编码癌症基因携带了可能与乳腺癌发生相关的1 628个驱动突变。ctDNA为乳腺肿瘤的组学研究提供了新的无创手段，但仍需推动检测技术规范化，开展前瞻性临床试验加以验证。

1.3　外泌体（Exs）

Exs是一种各类细胞经过内吞-融合-外排等一系列调控过程而产生的细胞外脂质双层小囊泡结构，直径约为30~150 nm^［14］。囊泡内携带的蛋白质、DNA和RNA通过调节宿主细胞的表面蛋白表达水平，进而调控细胞间通信和物质的跨膜运输过程^［2］。乳腺癌细胞中Exs内包含的多种蛋白质（如TGF-β、CD73和CD39等）及miRNA（如miR-222、miR-105、miR-122、miR-10b等）被证实在肿瘤转移和免疫耐药等过程中发挥重要作用^［15］。因此，对Exs中蛋白质组学和遗传信息的检测将助力于肿瘤的精准诊断和治疗。由于体液的复杂性以及Exs体积小、密度低，高效、无杂质且生物活性完整的Exs分离在技术上仍具有挑战性。超速离心法虽然可以通过多次数的离心来获取纯度更高的Exs，但该过程也会降低Exs的回收率。分子排阻色谱法分离的Exs不含大量杂质，纯度相对较高，但其产量低、耗时长，其与超速离心的结合可以提高回收率和纯度。而免疫磁珠分选法的分离原理就是抗体磁珠（如CD81、CD63和CD9）和Exs结合之后，利用磁力作用将Exs和其他组分相互分离^［16］。

1.4　肿瘤相关微粒（taMPs）

taMPs是活化、损伤或凋亡的肿瘤细胞由细胞内向细胞外排放进入血流循环的细胞膜包裹的微粒，直径为100~1 000 nm，主要由蛋白和脂类组成^［3］。taMPs通过调节细胞表面磷脂酰丝氨酸的表达水平，进而发挥调控肿瘤转移、增殖及参与相关凝血过程的作用^［17］。研究表明，肿瘤患者外周循环中AnnexinV+EpCAM⁺CD147⁺阳性的taMPs，可以帮助检测结直肠癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、肝细胞癌和胆管癌，且具有较高的敏感性和特异性，在未来可能作为筛查、诊断和监测肿瘤的重要血液标志物^［18］。血中微粒数目相当少，taMPs的检测需要排除细胞外囊泡其他亚群成分的影响，因此对技术要求高。血清样本中的微粒主要通过差速离心法（2 000~20 000 g）分离。然后用流式细胞术对20 000 g沉淀的微粒进行检测。流式细胞术虽是一种在测量微粒方面极具竞争力的分析方法，但在大小、探测和计数方面仍存在局限性，其检测微粒的特异性和敏感性有待提高^［19］。因此检测技术的标准化改进和创新仍是taMPs推向未来临床实践应用的重点。

1.5　肿瘤教化血小板（TEPs）

通过不同信号分子，肿瘤细胞与其微环境和血小板发生相互作用，进而改变血小板遗传信息及蛋白含量，这类因肿瘤影响改变了RNA谱的血小板称之为TEPs^［4］。研究表明，血小板在肿瘤发生所有过程中均发挥一定功能，包括肿瘤生长、肿瘤细胞外渗、血管生成和转移^［20］。TEPs和正常人体血小板的最大区别在于TEPs不仅携带丰富的蛋白质（如生长因子、细胞因子、趋化因子），还具有不同的RNA组成（如mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等）和丰富的表达谱^［21］。研究发现癌症患者血小板中存在特异性RNA信号，比如在转移性肺癌患者中，与健康人群相比有197个血小板基因下调，几个基因差异剪接，因此癌症患者TEPs的RNA特征差异提升了其作为泛肿瘤生物标志物的应用潜能^［22］。TEPs的RNA特征检测基于RNA测序，如粒子群优化增强的ThromboSeq平台，能够从微量血小板RNA（100~500 pg，相当于1滴血中的血小板）中识别拼接的RNA图谱，对数百个血小板样本的RNA图谱进行分析和分类^［23］。一项对来自228例局部和转移性肿瘤患者及55例健康个体的283个血小板样本进行测序来确定TEPs诊断潜力的研究发现，其区分癌症患者和健康个体的准确性高达96%，识别6种肿瘤（乳腺癌、胰腺癌、肝胆管癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤）原发肿瘤位置的准确度达到71%^［24］。所以，TEPs是一种能够应用于癌症患者泛癌、多类癌症和伴随诊断的无创液体活检技术。

2 液体活检在乳腺癌中的应用

2.1　乳腺癌的早期筛查及诊断

液体活检技术可为乳腺癌患者的早期筛查和临床诊断提供指导。SHAO X等^［25］在343例中国女性参与者（102例未接受治疗的乳腺癌患者、177例乳腺良性疾病患者和64例健康女性患者）中对CTCs与超声、钼靶摄影和增强磁共振成像等乳腺癌筛查方式进行比较分析，发现CTCs分类的特异性最高，为0.938。CROOK T等^［26］发现，基于乳腺癌相关CTCs富集的检测试验，能够在病例对照临床研究和前瞻性临床研究中，精准区分乳腺癌患者和健康女性、乳腺癌患者和良性乳腺疾病患者，提示通过检测和分析CTCs可精确筛查早期乳腺癌。

研究表明，检测外周血中ctDNA水平比临床上影像学、放射学技术可提前5个月诊断乳腺癌^［27］。与良性乳腺病变患者相比，早期乳腺癌患者的ctDNA水平更高，手术后ctDNA水平降低^［28］。RODRIGUEZ B J等^［29］通过对乳腺癌患者的血浆DNA进行测序，发现4个未在患者的组织活检中检测到的ctDNA突变（3个在TP53中，1个在PIK3CA中），且肿瘤分级和大小、免疫组织化学亚型、BIRADS类别和淋巴结阳性与这些突变显著相关。对于TEPs而言，通过对其RNA特征的检测，可助力于癌症诊断和分型，为癌症患者提供个性化精准治疗策略^［24］。MOON P G等^［30］检测了健康人群（n=70）、乳腺癌患者（n=240）、手术切除后的乳腺癌患者（n=40）、良性乳腺肿瘤患者（n=55）以及非癌性疾病患者（n=80）中细胞外囊泡表面纤维连接蛋白的表达水平，发现其在所有阶段乳腺癌患者中均显著升高，并在肿瘤切除后恢复正常。DHAHBI J M等^［31］通过RNA测序技术分析5例乳腺癌患者血清Exs的sRNAs含量，发现乳腺癌诊断与sRNAs特定亚型水平的变化有关。研究表明乳腺癌细胞Exs中多种蛋白（CD82、生存素-2B、膜联蛋白A2等）表达水平增高，乳腺癌患者血清或血浆中Exs多种miRNA（miR-21、miR-1246、miR-145、miR-155和miR-382等）的水平明显高于健康受试者，表明这些Exs生物标志物可能用于早期识别乳腺癌^［32］。因此，液体活检技术可作为乳腺癌临床诊断的辅助检查手段。

2.2　乳腺癌的分期及预后评估

通过对外周血中CTCs计数发现，3/4的转移性乳腺癌患者中检测出CTCs，在一线化疗之后，1/2患者的CTCs数目上升，与基线时CTCs计数＜5个·（7.5 mL）^-1的患者相比，其PFS和OS都明显下降，提示CTCs数目和乳腺癌患者的生存期呈负相关^［33］。CTCs数量、型别的变化也可作为乳腺癌细胞发生复发转移的预测因子。LIU X等^［34］研究证实，乳腺癌患者肿瘤远端转移过程中起主导作用的细胞之一是肿瘤细胞EpCAM+小细胞异倍体CTCs，且相比于其他EMT表型（E、M/e及M），EMT表型为E/m型的CTCs具有最高的肿瘤转移能力。近年来，国内外发布的诸多指南均表明CTCs计数与乳腺癌预后和分期密切相关，见表2。2010年，美国癌症联合委员会（American joint committee on cancer，AJCC）在指南中首次将CTCs纳入TNM分期系统^［35］；而美国国立综合癌症网络（American national comprehensive cancer network，NCCN）也在2017年制定乳腺癌指南时正式引入cM0（i+）分期，体现CTCs对乳腺癌分期系统的重大价值^［36］。2019年，CTCs被中国临床肿瘤学会（Chinese society of clinical oncology，CSCO）纳入指南，提出CTCs可替代组织样本进行诊断和分子测序，表示其临床应用正走向基因分型细胞测序时代，这将进一步促进我国乳腺癌诊疗的规范化和精细化，为中国乳腺癌患者带来更多获益^［37］。

研究发现，ctDNA可作为预测乳腺癌转移及复发的预后指标之一，PRAT A等^［40］发现459例乳腺癌转移患者的血浆ctDNA构建的多基因特征和生存结果显著相关。随访结果显示，转移性乳腺癌患者显现ctDNA阳性早于临床确诊约11月，该指标预测复发转移的敏感度和特异度分别为93%和100%^［41］。一些乳腺癌患者的微小残留病灶会释放携带RBI、ANK3及FGFR1等体细胞基因突变的ctDNA，被证实与乳腺癌高风险复发密切相关^［42］。与患有良性乳腺肿瘤的女性相比，乳腺癌患者的血清Exs miR-148a水平显著下调，其水平与肿瘤分期和疾病复发密切相关^［32］。KHAN S等^［43］研究40例Ⅰ~Ⅵ期乳腺癌患者的血液标本时发现肿瘤细胞Exs分泌的生存素在疾病早期高表达，而在晚期低表达或不表达，提示其可作为乳腺癌预后评估的指标之一。而且，乳腺癌中Exs来源的AnxA2蛋白水平的高表达与肿瘤分级、OS低和无病生存率低显著相关^［32］。综上所述，液体活检技术有望为乳腺癌患者的预后评估及肿瘤分期提供更多指导。

2.3　乳腺癌的治疗反应评估

通过对血液中CTCs数量变化的监测，可更好地评估肿瘤的进展情况，有利于后期治疗策略的选择。研究报道显示，当CTCs计数≥5个·（7.5 mL）^-1，选择化学药物治疗，而当CTCs计数＜5个·（7.5 mL）^-1时，选择激素治疗，能够显著促进乳腺癌患者的PFS提升^［44］。研究发现，乳腺癌患者化疗第1个周期后，CTCs数目已发生变化，化疗后CTCs数目较化疗前下降90%以上的有7例，较化疗前增加100%以上的有11例^［45］。研究表明，相比于CTCs-HER2阴性乳腺癌患者，CTCs-HER2阳性患者的PFS能够延长5个月，提示实时监测CTCs-HER2状态有助于指导乳腺癌靶向药物治疗^［46］。对于CTCs的其他表型研究，YUE C等^［47］发现PD-L1表达强阳性的CTCs可用于评估、预测PD-1单抗的治疗效果，而外周血中有PD-L1高表达CTCs的患者更容易从PD-1药物中获益。

实时检测肿瘤患者ctDNA中的基因突变信息，可预测患者耐药情况，进而指导药物治疗方案。PIK3CA基因突变是乳腺癌内分泌治疗耐药的原因之一。研究发现，如果在进行内分泌治疗的乳腺癌患者中检测到ctDNA发生PIK3CA基因突变，此时联合PI3K抑制剂治疗，患者的PFS会比对照组长4个月^［48］。O'LEARY B等^［49］研究发现，早期乳腺癌患者CDK4/6抑制剂治疗前后，其ctDNA中磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚基α突变的情况能够较好地预测患者对CDK4/6抑制剂的治疗反应。肿瘤衍生的Exs通过减少化疗药物的细胞内积累和递送激活促生存信号的功能性分子来介导乳腺癌的化疗耐药性；通过转移上调ERα表达和激素非依赖性信号的功能性分子来介导乳腺癌的激素抵抗^［50］。来自乳腺癌的Exs携带有HER家族的成员，在HER2过表达的乳腺癌细胞系中，HER2阳性Exs调节对曲妥珠单抗的敏感性，从而调节HER2驱动的肿瘤侵袭性，这表明Exs来源的HER2可能是治疗期间耐药性的潜在生物标志物^［32］。因此液体活检技术有助于监测乳腺癌患者的肿瘤动态变化及评估耐药情况。

3 小结

随着检测技术的革新发展，液体活检技术在乳腺癌中得到了广泛应用，在乳腺癌早期筛查、临床诊断、预后评估、治疗反应评估等多方面提供有效指导。在乳腺癌研究中，作为新一代活检技术的液体活检指标，CTCs、ctDNA、Exs、taMPs及TEPs各有其技术特点和应用范围。存活CTCs在细胞、蛋白质及基因组不同层面具有更广泛的研究价值。但血液CTCs含量极少，不易富集和分选，Cell Search检测系统不能捕获发生了EMT而变成无上皮表面抗原表达的CTCs。因此，如果仅用上皮性抗原作为CTCs富集标志，将会造成多数CTCs漏检的情况，降低检测精确性。因此今后的CTCs研究应该把更多焦点集中在相关表型、基因型层面。ctDNA检测特异度较高，且提取难度比CTCs检测更小，但乳腺癌细胞中的ctDNA只包含一小部分DNA片段，尚未反映全部的基因信息。Exs携带的基因片段更加丰富而稳定，然而同时保持Exs的高纯度和高活性仍是难题。而血液中taMPs的检测还需要排除EVs中Exs和凋亡小体的影响。TEPs的RNA特征有助于诊断癌症的类型，在精准癌症诊断方面比其他液体活检技术更为灵活。随着液体活检检测技术的进步和发展，研究者将从基因或转录水平探究肿瘤发生发展机制，实现多种生物标志物的整合分析，为乳腺癌诊断、预后和治疗提供更有力的支撑。

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(81903186)

江西省重点研发计划项目(20203BBGL73202)

江西省教育厅科学技术研究项目(GJJ211544)