嵌合抗原受体细胞工程技术在肿瘤治疗中的研究进展

Research progress of CAR cell engineering technology in tumor therapy

摘要

嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor，CAR）介导的细胞免疫疗法是一种抗肿瘤的新型精准靶向疗法，能够实现对肿瘤细胞的高效靶向杀伤。CAR免疫细胞疗法是目前研究热点，其中CAR-T细胞已在治疗B细胞系恶性血液病方面取得重大突破，但在治疗实体肿瘤领域尚未进行深入研究。本文结合近年来国内外的研究文献，对当前CAR细胞免疫疗法的研究成果、局限性、优化策略进行综述。文献复习结果表明，相比于CAR-T细胞和CAR-自然杀伤细胞，CAR-巨噬细胞和CAR-中性粒细胞对肿瘤细胞杀伤能力有所增强，在治疗中产生的不良反应也会减少。目前研究发现CAR结构的设计和CAR介导的免疫细胞来源，决定了CAR细胞对肿瘤细胞的靶向作用以及抗肿瘤能力。通过充分的基础研究与临床试验，CAR细胞工程技术有望在治疗实体肿瘤方面发挥巨大作用。

关键词

嵌合抗原受体 / CAR-T细胞 / CAR-NK细胞 / CAR-巨噬细胞 / CAR-中性粒细胞

Key words

Chimeric antigen receptors / CAR-T cells / CAR-NK cells / CAR-macrophages / CAR-neutrophils

人体微生物防御系统可以简单分为解剖与生理屏障和免疫反应系统，免疫反应系统又可分为固有免疫和适应性免疫系统。固有免疫系统由吞噬细胞（如中性粒细胞、巨噬细胞和NK细胞等）、抗菌肽和补体途径组成，构成了人体第一道防线，可快速感知和清除病原体。适应性免疫系统涉及抗原呈递细胞与T淋巴细胞和B淋巴细胞间相互作用，从而促进病原体特异性免疫效应通路、免疫记忆的产生和宿主免疫稳态的调节，可以对自身和非自身抗原广泛而精确地识别。固有免疫和适应性免疫系统之间通过细胞因子实现信号传导^［1-3］。

近年来，免疫细胞工程在血液肿瘤的治疗中成功应用，嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor，CAR）细胞技术是免疫细胞疗法中常用的技术手段。早在1989年，GROSS G等^［4］通过转基因技术在T细胞表面表达目的受体。这些转基因T细胞最初被称为“T体（T-body）”^［5］，现在更广为人知的是CAR-T^［6-9］。CAR是一种合成细胞表面受体，通常与独立于组织相容性复合体（Major histocompatibility complex，MHC）的靶细胞表面抗原结合，能将细胞毒性免疫细胞重新靶向表达该抗原的细胞。CAR的组成元件包括：⑴胞外抗原结合域，负责直接识别并结合肿瘤相关抗原；⑵跨膜结构域，负责将CAR锚定在T细胞膜上；⑶铰链区，负责链接抗原结合域与跨膜结构域；⑷胞内信号传导结构域，负责将抗原信号传导至胞内激活T细胞。在开发CAR-T细胞的同时，基于转基因T细胞受体（T-cell receptors，TCR）转导的T细胞（TCR-T细胞）的免疫细胞疗法也得到发展。与TCR相比，CAR能够靶向任何表面抗原，且往往具有较低的抗原敏感性，目前仅有数量庞大的CAR-T细胞处于临床试验阶段^［10］。

CAR免疫疗法是继手术、放疗、化疗后的第4大治疗癌症的手段，还是继免疫检查点抑制剂、细胞过继疗法的第3大免疫疗法。但CAR-T细胞免疫疗法受到肿瘤细胞浸润、细胞毒性以及免疫抑制性微环境等因素的限制，为了避免CAR-T细胞疗法的不良反应且能够获得更好的抗肿瘤效果，研究人员把目光聚焦到其他免疫细胞，相继开发出了CAR-NK（Natural killer，NK）细胞、CAR-巨噬细胞（CAR-Ms）以及CAR-中性粒细胞（CAR-neut），形成4种免疫细胞疗法并行发展的局面。本文对以上4种疗法的研究进展进行归纳总结，包括CAR的基础结构及构建、当前研究成果、局限性及优化策略。

1 CAR-T

CAR-T细胞可在各种共刺激分子和CAR的帮助下识别抗原并直接杀死靶细胞，为治疗人类癌症提供新思路。CAR-T细胞疗法基本原理是将CAR cDNA整合入自体移植的T细胞基因组中，CAR-T细胞在受者体内扩增，靶向清除肿瘤细胞^{［7-9， 11］}。

CAR-T细胞的构建载体常见的有逆转录病毒、慢病毒转染和非病毒载体，但是前2种载体存在潜在风险，如插入的突变点有潜在的致癌风险、有产生可自我复制的病毒风险以及高成本^［12-14］。而非病毒载体有转座子和质粒DNA。当基因和转座子被引入预激活或静息T细胞时，转座子能够稳定表达目的基因，例如piggyBac（pB）转座子，在CAR-T细胞疗法中尚未充分开发，是一种可移动遗传元件，能够通过“剪切-粘贴”机制在携带者和染色体之间有效转座子，能高效地将其内容物从原来的位置移动并高效整合到染色体特定位点^［15］。pB转座子介导CAR-T细胞构建的方法可以得到稳定的CAR-T细胞，且可以避免早期T细胞耗竭^［16］，但转座子介导构建的CAR-T细胞的过程复杂且时间长以及质粒DNA的转录沉默，研究人员设计了小环型DNA（minicircle DNA），并且通过电穿孔成功构建的CAR-T细胞^［17］，可避免上述转座子介导构建CAR-T的过程复杂耗时长及质粒DNA的转录沉默等问题。TAY J C K等^［18］通过电穿孔法将编码NKG2D CAR的pB转座子质粒导入T细胞中制备NKG2D CAR-T细胞，而该类CAR-T细胞扩增多代后，T细胞耗竭标志物 TIGIT（T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains，TIGIT）、T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3（T-cell immunoglobulin mucin-3，TIM3）和LAG3（Lymphocyte activation protein 3， LAG3）表达降低。综上，无论是pB转座子还是小环型DNA介导构建CAR-T，都可在输注一段时间后检测到该类多数的CAR-T细胞，避免CAR-T的早期耗竭。这为后续在治疗实体肿瘤方面的研究时对载体的选择提供新思路。

目前，已有6种CAR-T细胞获得FDA（Food and drug administration，FDA）或NMPA（National medical products administration，NMPA）批准上市用于治疗复发或难治性血液系统恶性肿瘤，包括B细胞淋巴瘤和白血病以及多发性骨髓瘤（表1）^［19-25］。除了以上6种获批用于治疗B细胞淋巴瘤的CAR-T细胞外，目前国际上还有8项关于制造和使用CAR-T细胞治疗癌症和其他疾病的专利^［26］。

目前尚无CAR-T细胞获得FDA批准用于实体瘤治疗。ALLEN G M等^［27］构建了含有synNotch的IL-2诱导元件的CAR-T细胞，在胰腺肿瘤和黑色素瘤模型中发现CAR-T细胞可以有效促进T细胞的肿瘤浸润。USLU U等^［28］设计了高表达标记蛋白间皮素的CAR-T细胞，可以同时靶向乳腺癌和胰腺导管腺癌，并且可以迅速清除肿瘤切除手术后的小鼠残余肿瘤组织，这提示CAR-T细胞疗法可以作为治疗实体肿瘤的辅助手段。

研究发现，CAR-T细胞疗法治疗效果不佳往往与抗原逃逸、靶向脱瘤效应、CAR-T细胞运输和肿瘤浸润、免疫抑制性微环境、CAR-T细胞毒性等因素有关^［29］。因此，为了提高CAR-T细胞治疗实体肿瘤的效果，在设计时要重点考虑以下4点：⑴抗原选择，理想的靶抗原是那些仅在恶性细胞上表达的肿瘤特异性抗原；⑵CAR模块改造，一种是将主要和共刺激信号域分成2个不同的CAR，一种是分裂、通用和可编程CAR系统；⑶抗原异质性；⑷CAR-T细胞的杀伤肿瘤能力，可通过与其他药物联用或敲除某些基因如TGF-β，从而增强CAR-T细胞的功能。

严重的不良反应是限制CAR-T细胞临床应用的重要原因之一，如细胞因子释放综合征（Cytokine release syndrome，CRS）、免疫效应细胞相关神经毒性综合征、脱靶效应、过敏反应、与CAR-T细胞输注（CAR-T cells infusion，CTI）相关的感染、肿瘤溶解综合征（Tumor lysis syndrome，TLS）、B细胞发育不良、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症（Hemophagocytic lymphohistiocytosis，HLH）、巨噬细胞活化综合征（Macrophage activation syndrome，MAS）和凝血障碍等^［30］。目前很多研究集中于减轻CAR-T细胞疗法治疗血液恶性肿瘤和实体瘤时产生的众多不良反应，就CRS而言，研究发现，在T细胞表面表达的mbaIL6可快速从培养上清液中去除IL-6，但不会影响CAR-T细胞抗肿瘤潜力^［31］；通过CRISPR/Cas9构建粒细胞-单核细胞集落刺激因子（Granulocyte-monocyte colony-stimulating factor，GM-CSF）缺陷的CAR-T19细胞可以抗CRS和神经炎症^［32］。

2 CAR-NK

CAR-T在治疗B细胞系恶性血液病方面取得重大突破，但CAR-T存在诸如上述的局限性，其他免疫效应细胞也被作为CAR修饰的候选者。NK细胞因其独特的生物学属性、对肿瘤的特殊细胞毒性、安全性等受到广泛关注，成为CAR细胞工程有前景的候选者^［33］。

NK细胞作为先天免疫的一员，占体循环中白细胞的5％～15％，产生于骨髓并在骨髓和次级淋巴器官中成熟^［34］。NK细胞的功能包括细胞毒性和细胞因子释放，并受来自抑制性和激活性受体信号的协调调控。NK细胞表达MHCⅠ类分子的抑制受体，当细胞缺乏或下调MHC-1表达时，激活受体发出NK细胞毒性信号^［35］，激活性受体包括天然细胞毒性受体（Natural cytotoxicity receptors，NCRs）：NKp46、NKp30、NKp44以及c型凝集素样激活性免疫受体：NKG2D^［36］。NK细胞可以通过多种机制抑制肿瘤细胞增殖、转移，主要包括产生穿孔素、颗粒酶、抗体依赖性细胞毒性和产生免疫刺激细胞因子，如IL-5、IL-10和IL-13、GM-CSF和TNF-α^［37］。NK细胞作为先天免疫淋巴细胞的关键成员，在宿主防御恶性细胞方面起着关键作用。

相较于CAR-T细胞，CAR-NK细胞有4个最主要的优势^［38-39］：⑴CAR-NK工程细胞的NK细胞可以是自体或异体来源，而CAR-T细胞的T细胞必须是来源于自体；⑵接受CAR-NK细胞疗法的患者不会出现CRS和神经毒性；⑶NK细胞除了CAR通路外还具有很多靶向和消除癌细胞的机制；⑷NK细胞寿命有限，不会产生持续的细胞毒性。

CAR-NK细胞的CAR结构设计与CAR-T细胞的CAR结构相同，CAR作为一种合成杂交抗原，第一代CAR仅含有CD3ζ作为单次激活的细胞内信号传导区；第二代和第三代CAR引入了额外的刺激信号区域，包括CD28、4-1BB（CD137）、ICOS或OX40（CD134）；第四代CAR携带转基因“有效载荷”（如IL-2或IL-15），可促进CAR-NK细胞的增殖^［40］。

CAR-NK细胞疗法作为CAR-T细胞疗法的替代方案，目前有24项已经计划或正在进行的CAR-NK细胞临床试验^［39］。2018年，研究者进行了CAR-NK-92细胞的首次人体Ⅰ期临床试验：该试验对CD33-CAR-NK-92细胞在复发和难治性急性髓系白血病患者中进行安全性测试^［41］。在一项靶向CD19阳性淋巴样肿瘤的CAR-NK细胞的Ⅰ期临床试验中^［42］，研究者使用与CAR-T细胞相似的CAR结构来建立以抗CD19 scFv（Single chain variable fragment， scFv）为抗原结合细胞外结构域，CD3ζ为细胞内信号结构域的CAR-NK细胞，研究表明，CAR-NK细胞表达IL-15增强CAR-NK细胞在体内扩增，并且活化的半胱天冬酶-9可以限制在严重不良事件发生时触发的CAR-NK细胞毒性^［43］。此外，DAHER M等^［44］在设计出既靶向CD19又表达IL-15的CAR-NK的基础上，同时敲除了靶向细胞因子检查点IL-15信号传导负调控因子CIS的编码基因，进而增强了分泌IL-15的装甲CAR-NK细胞的抗肿瘤活性。综上，研究者设计CAR-NK细胞时，将焦点集中于CAR结构的优化以及NK细胞基因改造上，旨在设计出能限制CAR-NK细胞的持续细胞毒性。

综上所述，CAR-NK细胞疗法的优势显而易见，但同时也存在很大局限性，几乎所有与CAR-T细胞疗法相关的局限性均适用于CAR-NK细胞，CAR-NK细胞面临着靶抗原选择、抗原异质性、CAR设计、制造到输注后的细胞迁移和存活等诸多挑战。

3 CAR-Ms

巨噬细胞是高度可塑性的细胞，具有多种功能，包括参与组织发育和维持组织稳态，清除细胞碎片，消除病原体和调节炎症反应。活化的巨噬细胞可以分为M1型和M2型，M1型巨噬细胞极化是由暴露于GM-CSF、IFN-γ、TNF-α、脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）或其他病原体相关分子模式，M2型巨噬细胞极化发生在M-CSF、IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β、糖皮质激素或免疫复合物存在的情况下。肿瘤将循环单核细胞和组织驻留巨噬细胞募集到肿瘤微环境（Tumor microenvironment，TME），并通过各种可溶性和机械因子将其极化为M2表型，从而产生肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophage，TAM）。肿瘤微环境中的TAM通常促进癌细胞增殖，免疫抑制和血管生成，以支持肿瘤生长和转移^［45］。近年来肿瘤微环境已成为肿瘤治疗的靶点，通过靶向代谢改善肿瘤微环境，如靶向肿瘤相关巨噬细胞的代谢，阻断其为恶性细胞提供支持，从而发挥抗癌作用^［46-47］。

巨噬细胞由于其本身可以作为治疗肿瘤的靶点以及强大的肿瘤组织浸润能力，CAR-Ms可发挥抗肿瘤作用。通过使用编码CD3ζ细胞内结构域的第一代抗CD19-CAR转导了人巨噬细胞系THP-1，生成的间皮素或HER2的CAR-Ms，基于CD3ζ的CARs可以介导抗肿瘤吞噬活性^［48］。因此CAR-Ms成为继CAR-T、CAR-NK 细胞的又一替代疗法。

CAR-Ms核心成分包含1个细胞外结构域、1个铰链结构域、1个跨膜结构域（主要是CD8）和1个连接特异下游信号分子的细胞内结构域，除了使用CD3ζ作为CAR-Ms的结构域外，同样，含有免疫受体酪氨酸激活基序（Immunoreceptor tyrosinebased activation motifs，ITAMs）的细胞内结构域也可以作为CAR结构，如Fc受体γ亚基（FcRγ）和多表皮生长因子样结构域蛋白10（Multiple EGF-like domain protein 10，Megf10），与CD3ζ作用相当^［39］。并且与CAR-T细胞类似，可以通过额外的信号结构域增强CAR-Ms的作用。独立于其天然细胞外结构域的Megf10和FcRɣ的胞质结构域能强烈触发吞噬，添加串联PI3K募集结构域能增加对癌细胞的吞噬^［49］。通过对免疫检查点调控也可以增强CAR-Ms的吞噬作用。SLAMF3和SLAMF4是信号淋巴细胞活化分子（Signaling lymphocytic activation molecule，SLAM）的家族成员SFR（SLAM family receptors，SFR），它们作为限制造血肿瘤巨噬细胞吞噬作用的免疫检查点，SFR的缺失显著增强了表达嵌合CD19抗原受体的巨噬细胞对CD19阳性造血靶标的吞噬作用，成为血液肿瘤潜在治疗靶标^［50］。

CAR-T细胞疗法中T细胞只能来源于患者本身，T细胞数目成为了构建CAR-T细胞治疗限制因素之一，与CAR-T细胞比较，CAR-Ms细胞来源较为广泛。CAR-Ms的巨噬细胞可由健康人群外周单核细胞来源的多能干细胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）经诱导而来，研究表明，表达CAR的iPSCs可诱导分化成表达CAR的巨噬细胞（CAR-iMs），且当CAR-iMs与抗原接触时，CAR-iMs更趋向于促炎状态，即向抗肿瘤方向极化^［51］。除了上述来源外，CAR-Ms的巨噬细胞还可来源于人THP-1巨噬细胞系、或源自外周血单核细胞（Peripheral blood monocytic cells， PBMC）的人原代单核细胞^［52］。

构建CAR-Ms体系的方法与CAR-T、CAR-NK细胞疗法一样可以是慢病毒、逆转录病毒以及非病毒方法。但慢病毒与逆转录病毒方法存在局限性，而非病毒方法可以避免病毒载体带来的风险，因此研究者更倾向于开发非病毒载体构建CAR-Ms，如纳米复合物介导的嵌合抗原受体-M1型巨噬细胞体内编程用于癌症治疗，该研究将巨噬细胞靶向纳米载体和CAR-IFN-γ编码质粒DNA构建CAR-M1型巨噬细胞，注射该巨噬细胞后在体内发挥介导癌细胞吞噬、抗肿瘤免疫调节和抑制实体瘤生长的作用^［53］。

目前，CAR-Ms疗法同样未获得NMPA或FDA批准，但其靶向实体瘤方面的研究仍在继续。KLICHINSKY M等^［48］在卵巢癌肿瘤模型中证明了CAR-Ms利用其吞噬和适应性免疫反应刺激能力的潜力，单次注射CAR-Ms，可以减轻肿瘤负荷，延长总生存期，而在人源化小鼠模型中，CAR-Ms进一步被证明可以诱导促炎肿瘤微环境并提高抗肿瘤T细胞活性。在泌尿生殖系统中，M1、M2型巨噬细胞之间的失衡与肿瘤细胞生长直接相关，为CAR-Ms在治疗肾细胞癌、膀胱癌和前列腺癌提供了理论基础^［54］。通过靶向细胞外基质，CAR-Ms可以治疗乳腺癌，在该项研究中，为了能够突破肿瘤的细胞外基质，设计了CAR-CD147，识别肿瘤抗原HER2，触发CD147信号传导，增强基质金属蛋白酶活性，最终增加了T细胞对肿瘤的浸润^［55］。综上，通过增加实体肿瘤微环境M1型巨噬细胞浸润数量与突破肿瘤的细胞外基质，能够增加CAR-Ms对实体肿瘤细胞浸润，实现对肿瘤细胞靶向杀伤。因此，肿瘤微环境已成为CAR免疫细胞疗法治疗实体肿瘤的治疗靶点。

TAM具有可塑性，受肿瘤微环境的影响较大，CAR-Ms可以将M2型的TAM向M1型极化，起到促炎抗肿瘤的作用。大多数CAR-Ms来源于健康人群，在靶向肿瘤细胞的同时，也会对正常细胞产生毒性，导致脱靶效应；构建的CAR构建体的表达成分会让机体产生免疫应答^［56］。但CAR-Ms在抗肿瘤方面仍然具有非常好的前景。

4 CAR-neut

中性粒细胞作为先天免疫的效应细胞参与急性损伤和修复、癌症、自身免疫和慢性炎症等过程^［57］。中性粒细胞具有呈递抗原给杀伤性CD8⁺T细胞、重塑细胞外基质、促进血管生成、活化M2型巨噬细胞、抑制抗肿瘤免疫、产生活性氧及释放中性粒细胞外陷阱（External neutrophil trap，NETs）等功能^［58-59］。中性粒细胞与淋巴细胞比值作为肿瘤预后指标，中性粒细胞活化时释放的中性粒细胞颗粒蛋白影响肿瘤进展以及导致中性粒细胞的表型变化^［60］。

目前关于CAR-neut的研究尚在初始阶段，现有研究成果相对较少。CHANG Y等^［61］构建了来源于人类多能干细胞的CAR-neut用于靶向癌症免疫治疗，该研究使用CRISPR-Cas9介导的同源重组技术将3种不同的靶向胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme，GBM）的CAR敲入人多功能干细胞（Human pluripotent stem cells，hPSCs）中，发现CLTX-T-CAR在增强hPSC衍生中性粒细胞的抗肿瘤细胞毒性方面效果最佳，该中性粒细胞通过膜相关基质金属蛋白酶2与GBM特异性结合后杀死肿瘤细胞。同时对CAR结构进行优化后发现，R-SiO₂-TPZ NP负载的CAR-中性粒细胞表现出对脑肿瘤更好靶向浸润效果，并且表现出较小的全身毒性反应以及优异的生物相容性^［62］。

CAR-neut也存在着与CAR-T细胞类似的问题，研究中也观察到TNF-α和IL-6的表达量增加了，CAR-neut的肿瘤杀伤力涉及吞噬作用、ROS释放和NETs形成，提示CAR-neut可能也会导致细胞因子释放综合征及损伤正常细胞。由此，可考虑CAR-T细胞与CAR-neut联合治疗，既能避免细胞因子释放综合征又可以增强CAR-neut的抗肿瘤效应。目前，CAR-neut尚未得到充分研究，存在的风险仍需要进一步评估。

5 小结

CAR-T细胞在治疗血液恶性肿瘤方面已经取得了很大突破，目前已有6种FDA批准的CAR-T细胞，但是使用CAR-T细胞治疗会产生细胞因子释放综合征和神经毒性等局限性，并且肿瘤细胞所处的肿瘤微环境会产生免疫抑制，会阻碍T细胞浸润等。NK细胞本身就是可以触发细胞毒性，经过改造的NK细胞靶向更强，抗肿瘤效应也更强。NK细胞来源广泛不局限于患者自体，CAR-NK细胞可以避免细胞因子风暴以及神经毒性的产生。巨噬细胞作为肿瘤微环境中最常见的免疫细胞，如果将CAR工程技术运用到巨噬细胞上，可以改变肿瘤相关巨噬细胞的表型，同时增强抗肿瘤效应，但巨噬细胞在体外不能增殖，且巨噬细胞受肿瘤微环境的影响。

从CAR-T细胞到CAR-neut，研究者们从最初寻找合适的抗原开始到寻找合适的细胞类型，都是期望CAR细胞既能发挥较强的抗肿瘤效应又能将对正常组织的不良反应降到最低。2种CAR-T细胞联合治疗能够避免细胞因子风暴或细胞毒性等，提高抗肿瘤活性。中性粒细胞在癌症中就是一把“双刃剑”，因此在开发CAR-neut，应先考虑中性粒细胞会释放NETs等特性，而CAR-neut是否可以与CAR-T细胞、CAR-NK细胞、CAR-Ms联合使用增强抗肿瘤效应仍需要进一步研究。

参考文献

[1] SPIERING M J. Primer on the immune system［J］. Alcohol Res， 2015，37（2）：171-175.

[2] BONILLA F A， OETTGEN H C. Adaptive immunity［J］. J Allergy Clin Immunol， 2010，125（2 ）：S33-S40.

[3] KAUR B P， SECORD E. Innate immunity［J］. Pediatr Clin North Am， 2019，66（5）：905-911.

[4] GROSS G， WAKS T， ESHHAR Z. Expression of immunoglobulin-T-cell receptor chimeric molecules as functional receptors with antibody-type specificity［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 1989，86（24）：10024-10028.

[5] ESHHAR Z. The T-body approach： redirecting T cells with antibody specificity［J］. Handb Exp Pharmacol， 2008（181）：329-342.

[6] JUNE C H， O'CONNOR R S， KAWALEKAR O U， et al. CAR T cell immunotherapy for human cancer［J］. Science， 2018，359（6382）：1361-1365.

[7] SADELAIN M. Chimeric antigen receptors： driving immunology towards synthetic biology［J］. Curr Opin Immunol， 2016，41：68-76.

[8] CARTELLIERI M， BACHMANN M， FELDMANN A， et al. Chimeric antigen receptor-engineered T cells for immunotherapy of cancer［J］. J Biomed Biotechnol， 2010，2010：956304.

[9] GUEDAN S， POSEY A D Jr， SHAW C， et al. Enhancing CAR T cell persistence through ICOS and 4-1BB costimulation［J］. JCI Insight， 2018，3（1）：e96976.

[10] IRVINE D J， MAUS M V， MOONEY D J， et al. The future of engineered immune cell therapies［J］. Science， 2022，378（6622）：853-858.

[11] SADELAIN M. CD19 CAR T cells［J］. Cell， 2017，171（7）：1471.

[12] HOWE S J， MANSOUR M R， SCHWARZWAELDER K， et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients［J］. J Clin Invest， 2008，118（9）：3143-3150.

[13] SCHLIMGEN R， HOWARD J， WOOLEY D， et al. Risks associated with lentiviral vector exposures and prevention strategies［J］. J Occup Environ Med， 2016，58（12）：1159-1166.

[14] WANG X， OLSZEWSKA M， QU J， et al. Large-scale clinical-grade retroviral vector production in a fixed-bed bioreactor［J］. J Immunother， 2015，38（3）：127-135.

[15] ZHAO S， JIANG E， CHEN S， et al. PiggyBac transposon vectors： the tools of the human gene encoding［J］. Transl Lung Cancer Res， 2016，5（1）：120-125.

[16] NAKAMURA K， YAGYU S， HIROTA S， et al. Autologous antigen-presenting cells efficiently expand piggyBac transposon CAR-T cells with predominant memory phenotype［J］. Mol Ther Methods Clin Dev， 2021，21：315-324.

[17] HAN J， GAO F， GENG S， et al. Minicircle DNA-engineered CAR T cells suppressed tumor growth in mice［J］. Mol Cancer Ther， 2020，19（1）：178-186.

[18] TAY J C K， WANG J， DU Z， et al. Manufacturing NKG2D CAR-T cells with piggyBac transposon vectors and K562 artificial antigen-presenting cells［J］. Mol Ther Methods Clin Dev， 2021，21：107-120.

[19] YING Z， YANG H， GUO Y， et al. Relmacabtagene autoleucel （relma-cel） CD19 CAR-T therapy for adults with heavily pretreated relapsed/refractory large B-cell lymphoma in China［J］. Cancer Med， 2021，10（3）：999-1011.

[20] NEELAPU S S， LOCKE F L， BARTLETT N L， et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma［J］. N Engl J Med， 2017，377（26）：2531-2544.

[21] BOUCHKOUJ N， ZIMMERMAN M， KASAMON Y L， et al. FDA approval summary： axicabtagene ciloleucel for relapsed or refractory follicular lymphoma［J］. Oncologist， 2022，27（7）：587-594.

[22] PRASAD V. Immunotherapy： tisagenlecleucel-the first approved CAR-T-cell therapy： implications for payers and policy makers［J］. Nat Rev Clin Oncol， 2018，15（1）：11-12.

[23] MAUDE S L， LAETSCH T W， BUECHNER J， et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia［J］. N Engl J Med， 2018，378（5）：439-448.

[24] ABRAMSON J S， PALOMBA M LIA， GORDON L I， et al. Lisocabtagene maraleucel for patients with relapsed or refractory large B-cell lymphomas （TRANSCEND NHL 001）： a multicentre seamless design study［J］. Lancet， 2020，396（10254）：839-852.

[25] MUNSHI N C， ANDERSON L D Jr， SHAH N， et al. Idecabtagene vicleucel in relapsed and refractory multiple myeloma［J］. N Engl J Med， 2021，384（8）：705-716.

[26] LYU L， FENG Y， CHEN X， et al. The global chimeric antigen receptor T （CAR-T） cell therapy patent landscape［J］. Nat Biotechnol， 2020，38（12）：1387-1394.

[27] ALLEN G M， FRANKEL N W， REDDY N R， et al. Synthetic cytokine circuits that drive T cells into immune-excluded tumors［J］. Science， 2022，378（6625）：eaba1624.

[28] USLU U， DA T， ASSENMACHER C A， et al. Chimeric antigen receptor T cells as adjuvant therapy for unresectable adenocarcinoma［J］. Sci Adv， 2023，9（2）：eade2526.

[29] STERNER R C， STERNER R M. CAR-T cell therapy： current limitations and potential strategies［J］. Blood Cancer J， 2021，11（4）：69.

[30] MIAO L， ZHANG Z， REN Z， et al. Reactions related to CAR-T cell therapy［J］. Front Immunol， 2021，12：663201.

[31] TAN A H J， VINANICA N， CAMPANA D. Chimeric antigen receptor-T cells with cytokine neutralizing capacity［J］. Blood Adv， 2020，4（7）：1419-1431.

[32] STERNER R M， SAKEMURA R， COX M J， et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts［J］. Blood， 2019，133（7）：697-709.

[33] DAHER M， REZVANI K. Next generation natural killer cells for cancer immunotherapy： the promise of genetic engineering［J］. Curr Opin Immunol， 2018，51：146-153.

[34] VIOLA D， DONA A， CASERTA E， et al. Daratumumab induces mechanisms of immune activation through CD38⁺ NK cell targeting［J］. Leukemia， 2021，35（1）：189-200.

[35] BOLLINO D， WEBB T J. Chimeric antigen receptor-engineered natural killer and natural killer T cells for cancer immunotherapy［J］. Transl Res， 2017，187：32-43.

[36] FARAG S S， CALIGIURI M A. Human natural killer cell development and biology［J］. Blood Rev， 2006，20（3）：123-137.

[37] ELAHI R， HEIDARY A H， HADILOO K， et al. Chimeric antigen receptor-engineered natural killer （CAR NK） cells in cancer treatment； recent advances and future prospects［J］. Stem Cell Rev Rep， 2021，17（6）：2081-2106.

[38] SIEGLER E L， ZHU Y， WANG P， et al. Off-the-shelf CAR-NK cells for cancer immunotherapy［J］. Cell Stem Cell， 2018，23（2）：160-161.

[39] PAN K， FARRUKH H， CHITTEPU V C S R， et al. CAR race to cancer immunotherapy： from CAR T， CAR NK to CAR macrophage therapy［J］. J Exp Clin Cancer Res， 2022，41（1）：119.

[40] MAROFI F， SALEH M M， RAHMAN H S， et al. CAR-engineered NK cells； a promising therapeutic option for treatment of hematological malignancies［J］. Stem Cell Res Ther， 2021，12（1）：374.

[41] TANG X， YANG L， LI Z， et al. First-in-man clinical trial of CAR NK-92 cells： safety test of CD33-CAR NK-92 cells in patients with relapsed and refractory acute myeloid leukemia［J］. Am J Cancer Res， 2018，8（6）：1083-1089.

[42] LIU E， MARIN D， BANERJEE P， et al. Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors［J］. N Engl J Med， 2020，382（6）：545-553.

[43] LIU E， TONG Y， DOTTI G， et al. Cord blood NK cells engineered to express IL-15 and a CD19-targeted CAR show long-term persistence and potent antitumor activity［J］. Leukemia， 2018，32（2）：520-531.

[44] DAHER M， BASAR R， GOKDEMIR E， et al. Targeting a cytokine checkpoint enhances the fitness of armored cord blood CAR-NK cells［J］. Blood， 2021，137（5）：624-636.

[45] NGAMBENJAWONG C， GUSTAFSON H H， PUN S H. Progress in tumor-associated macrophage （TAM）-targeted therapeutics［J］. Adv Drug Deliv Rev， 2017，114：206-221.

[46] BADER J E， VOSS K， RATHMELL J C. Targeting metabolism to improve the tumor microenvironment for cancer immunotherapy［J］. Mol Cell， 2020，78（6）：1019-1033.

[47] VITALE I， MANIC G， COUSSENS L M， et al. Macrophages and metabolism in the tumor microenvironment［J］. Cell Metab， 2019，30（1）：36-50.

[48] KLICHINSKY M， RUELLA M， SHESTOVA O， et al. Human chimeric antigen receptor macrophages for cancer immunotherapy［J］. Nat Biotechnol， 2020，38（8）：947-953.

[49] MORRISSEY M A， WILLIAMSON A P， STEINBACH A M， et al. Chimeric antigen receptors that trigger phagocytosis［J］. Elife， 2018，7：e36688.

[50] LI D， XIONG W， WANG Y， et al. SLAMF3 and SLAMF4 are immune checkpoints that constrain macrophage phagocytosis of hematopoietic tumors［J］. Sci Immunol， 2022，7（67）：eabj5501.

[51] ZHANG L， TIAN L， DAI X， et al. Pluripotent stem cell-derived CAR-macrophage cells with antigen-dependent anti-cancer cell functions［J］. J Hematol Oncol， 2020，13（1）：153.

[52] SU S， LEI A， WANG X， et al. Induced CAR-macrophages as a novel therapeutic cell type for cancer immune cell therapies［J］. Cells， 2022，11（10）：1652.

[53] KANG M， LEE S H， KWON M， et al. Nano complex-mediated in vivo programming to chimeric antigen receptor-M1 macrophages for cancer therapy［J］. Adv Mater， 2021，33（43）：2103258.

[54] KLICHINSKY M， RUELLA M， SHESTOVA O， et al. Human chimeric antigen receptor macrophages for cancer immunotherapy［J］. Nat Biotechnol， 2020， 38（8）： 947-953.

[55] ZHANG W， LIU L， SU H， et al. Chimeric antigen receptor macrophage therapy for breast tumours mediated by targeting the tumour extracellular matrix［J］. Br J Cancer， 2019，121（10）：837-845.

[56] WANG S， YANG Y， MA P， et al. CAR-macrophage： an extensive immune enhancer to fight cancer［J］. eBioMedicine， 2022，76：103873.

[57] LIEW P X， KUBES P. The neutrophil’s role during health and disease［J］. Physiol Rev， 2019，99（2）：1223-1248.

[58] MCFARLANE A J， FERCOQ F， COFFELT S B， et al. Neutrophil dynamics in the tumor microenvironment［J］. J Clin Invest， 2021，131（6）：143759.

[59] PARK J， WYSOCKI R W， AMOOZGAR Z， et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps［J］. Sci Transl Med， 2016，8（361）：361ra138.

[60] MOLLINEDO F. Neutrophil degranulation， plasticity， and cancer metastasis［J］. Trends Immunol， 2019，40（3）：228-242.

[61] CHANG Y， SYAHIRAH R， WANG X， et al. Engineering chimeric antigen receptor neutrophils from human pluripotent stem cells for targeted cancer immunotherapy［J］. Cell Rep， 2022，40（3）：111128.

[62] CHANG Y， CAI X， SYAHIRAH R， et al. CAR-neutrophil mediated delivery of tumor-microenvironment responsive nanodrugs for glioblastoma chemo-immunotherapy［J］. Nat Commun， 2023，14（1）：2266.