基于网络药理学研究苦刺花提取物防治肺结节的作用机制

Study on the mechanism of the Sophora davidii flower extract in preventing and treating pulmonary nodules based on network pharmacology

摘要

目的 基于网络药理学预测苦刺花提取物（Sophora davidii flower extract， SDFE）防治肺结节的作用机制。 方法 利用SwissTarget Prediction、GeneCards数据库分别获得SDFE中化合物的作用靶点与肺结节治疗靶点并获取两者的交集靶点，应用STRING在线平台构建交集靶点的PPI网络，基于DAVID数据库对交集靶点进行GO和KEGG富集分析，应用Cytoscape软件构建化合物-交集靶点-KEGG网络，采用Discovery Studio软件进行分子对接验证。 结果 确定了92个交集靶点，GO功能富集分析发现主要涉及跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、激酶活性的正向调控，以及受体复合物等。KEGG富集分析主要涉及癌症相关通路以及磷脂酰肌醇-3激酶-蛋白激酶B信号通路等。PPI网络及化合物-交集靶点-KEGG网络的共有核心靶点为EGFR、MMP9、SRC和AKT1。排名前10的核心化合物分别为巴马汀、美迪紫檀素、芫花素、松属素、7-甲氧基木犀草素、假荆芥内酯、柚皮素、香叶木素、木犀草素以及苦参碱。分子对接结果显示，木犀草素和苦参碱与EGFR、MMP9和SRC等核心靶点的LibDockScore均大于100。 结论 SDFE可通过多成分、多靶点、多通路防治肺结节，这为后续实验验证及药物开发提供了理论依据。

Abstract

Objective : To predict the mechanism of the Sophora davidii flower extract （SDFE） in preventing and treating pulmonary nodules based on network pharmacology. Methods The SwissTarget Prediction and GeneCards databases were used to obtain the target genes of compounds in SDFE and the therapeutic targets for pulmonary nodules， respectively， followed by identifying their intersection targets. The STRING online platform was employed to construct a protein-protein interaction （PPI） network of the intersection targets. GO and KEGG enrichment analyses were performed on the intersection targets using the DAVID database. A compound-intersection target-KEGG network was constructed using Cytoscape software， and molecular docking validation was conducted using Discovery Studio software. Results : 92 intersection targets were determined. GO functional enrichment analysis revealed that these targets were primarily associated with transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity， positive regulation of kinase activity， and receptor complexes. KEGG enrichment analysis indicated significant involvement in pathways in cancer and PI3K-Akt signaling pathway. The common core targets in both the PPI network and the compound-intersection target-KEGG network were EGFR， MMP9， SRC and AKT1. The top 10 core compounds were palmatine， medicarpin， genkwanin， pinocembrin， 7-methoxy luteolin， nepetalactone， naringenin， diosmetin， luteolin and matrine. Molecular docking results showed that luteolin and matrine had LibDockScores greater than 100 when binding to core targets such as EGFR， MMP9 and SRC. Conclusion SDFE can prevent and treat pulmonary nodules through multiple components， multiple targets and multiple pathways， providing a theoretical basis for subsequent experimental validation and drug development.

Graphical abstract

关键词

肺结节 / 苦刺花提取物 / 网络药理学 / 药理作用 / 分子作用机制

Key words

Pulmonary nodules / Sophora davidii flower extract / Network pharmacology / Pharmacological action / Molecular mechanism of action

肺结节是指肺部小的、局限性的、近圆形的病灶，通常直径＜3 cm。肺部组织在某些因素（如细菌、病毒、真菌等病原体侵入）作用下会受到损伤和刺激，引发炎症反应。这种炎症反应可导致局部组织细胞增生和修复，最终形成肺结节^［1］。近年来，肺结节病例量呈快速增长趋势。这主要是由于医学影像学技术的发展和人们健康意识的提高，使得越来越多的肺结节被发现。《美年健康2022年度健康体检大数据蓝皮书》显示，在纳入分析的近千万例2022年受检者中，肺结节检出率超过50%^［2］。肺结节压迫肺组织可导致气短、呼吸困难等症状，且部分肺结节可能恶性变为肺癌。因此，肺结节的防治具有重要意义。

目前，在肺结节的治疗与康复中以中药为主。其中，清热利湿、芳香化气类中药（如苦参、白芍、薏苡仁、白术、麻黄等）应用广泛^［3］。苦刺（Sophora davidii）与苦参一样，同为豆科槐属植物，主要分布于中国的云南省和贵州省，其根、叶、花及果实均可入药^［4-6］。苦刺的花（苦刺花）具有清热除湿、凉血解毒的功效，民间常被用于治疗咽喉痛、肺热咳嗽和其他呼吸系统疾病^［7］。研究发现，苦刺花提取物（Sophora davidii flower extract，SDFE）可以改善脂多糖刺激大鼠的病理特征（如白细胞浸润、肺水肿、肺损伤），显著下调促炎因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）表达，并通过MAPK/NF-κB信号通路对急性肺炎发挥保护作用^［8］。此外，SDFE可通过调节PI3K/AKT/MDM2/P53信号通路促进细胞凋亡，从而治疗非小细胞肺癌^［9］。提示SDFE既能治疗肺结节的主要诱因——肺部炎症，也能干预肺结节的恶化——肺癌。但因缺乏合适的动物/细胞模型，它能否防治肺结节尚无法确证。网络药理学是一种可基于生物信息学预测药物成分、靶点及通路的有效方法。本文拟基于网络药理学和分子对接技术预测SDFE防治肺结节的作用机制，为后续研究与药物开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1　获取化合物潜在作用靶点

课题组已采用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱联用仪对SDFE化学成分进行了分析，筛选出54种符合药物吸收、分布、代谢和排泄标准的化合物^［8-9］。利用SwissTarget Prediction数据库（http：//swisstargetprediction.ch/）对这些化合物的潜在作用靶点进行预测。

1.2　获取肺结节治疗靶点

在GeneCards数据库（http：//www.genecards.org）中，以“pulmonary nodule”为检索词进行检索，获取治疗肺结节的相关靶点。

1.3　获取交集靶点

在Draw Venn Diagram服务平台

（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），输入SDFE的潜在作用靶点和肺结节治疗靶点以进行交集。将两者的交集靶点作为SDFE治疗肺结节的潜在作用靶点。

1.4　构建蛋白相互作用（Protein-protein interaction，PPI）网络

将交集靶点上传到STRING 12.0在线平台（https：//string-db.org），选择“Homo sapiens”获得蛋白相互作用信息。STRING在线平台对靶点直接和间接的相互作用进行评分，选择评分＞0.7，在线生成PPI网络。

1.5　基因本体（Gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析

采用Omicshare在线服务平台（https：//www.omicshare.com/）及David V 6.7网络平台（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）转换靶点ID，并对交集靶点进行GO及KEGG通路富集分析。以P＜0.05为阈值，选择GO以及KEGG通路中最为显著性的前20个靶点绘制图形。

1.6　构建化合物-交集靶点-KEGG网络

将获取的交集靶点、KEGG富集分析结果以及化合物导入Cytoscape 3.7.1软件构建化合物-交集靶点-KEGG网络。

1.7　分子对接

通过Discovery Studio 2019客户端软件（http：//www.discoverystudio.net/），对核心化合物与核心靶点进行了分子对接及可视化操作。核心靶点的蛋白质数据库（Protein data bank，PDB）编号从美国蛋白质晶体结构数据库（RCSB PDB数据库，https：//www.rcsb.org/）中获取。小分子的SDF格式文件从ZINC数据库在线平台（http：//zinc.docking.org/）下载。将核心靶点的PDB编号输入到分子对接服务器上，然后上传小分子的结构数据文件。分子对接采用LibDock模式进行。利用Discovery Studio软件去除蛋白质（核心靶点）中的水和配体。添加氢原子后，点击“clean protein”对蛋白质进行处理，并进一步将其定义为受体。从受体腔中设置蛋白质的结合口袋，将对接模式设置为LibDock。所有参数均设置为默认值。最后将对接复合物进行可视化展示。

2 结果

2.1　SDFE化合物与肺结节交集靶点

去除重复项后，通过SwissTarget Prediction平台确定了SDFE中54种活性化合物的624个潜在作用靶点。此外，从GeneCards数据库中检索到2 116个与肺结节相关的评分＞5的靶点。对化合物作用靶点和肺结节治疗靶点取交集后，发现40%的SDFE作用靶点与治疗肺结节有关。为了使结果更具可信度，选取了评分＞10的559个肺结节治疗靶点重新进行交集运算，如图1所示，共发现有92个化合物作用靶点与肺结节相关，定义这些靶点为交集靶点。

2.2　交集靶点的GO和KEGG通路富集分析

对92个交集靶点进行了GO和KEGG通路富集分析。图2列出了P值最为显著的20条GO，其中涉及生物过程（Biological process， BP）6条、分子功能（Molecular function， MF）7条，以及细胞组成（cellular component， CC）7条。SDFE对BP的影响主要涉及激酶活性正调控、多细胞生物发育、磷酸化等；以MF的影响主要涉及跨膜受体蛋白质酪氨酸激酶活性、蛋白质酪氨酸激酶活性；而对CC影响最为显著的是受体复合物。图3列出了富集程度最为显著的20条KEGG通路，其显示SDFE防治肺结节主要涉及癌症信号通路、PI3K-Akt信号通路、前列腺癌信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性信号通路，糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路等信号通路。

2.3　SDFE治疗肺结节的主要靶点及化合物

绘制92个交集靶点的PPI网络，如图4所示。按度值排序，PPI网络中的前10个关键靶点分别为ALB、TNF、AKT1、EGFR、MMP9、STAT3、IL1B、BCL2、CASP3和SRC。利用Cytoscape软件构建了化合物-交集靶点-KEGG通路网络图，如图5所示。按度值排序，前10个关键靶点分别为EGFR、ESR1、MMP9、MET、IGF1R、SRC、MMP2、KDR、AKT1和MMP3，其中EGFR、MMP9、SRC和AKT1为PPI网络图和化合物-交集靶点-KEGG通路网络图共有核心靶点。排名前10的核心化合物分别为巴马汀、美迪紫檀素、芫花素、松属素、7-甲氧基木犀草素、假荆芥内酯、柚皮素、香叶木素、木犀草素、苦参碱。其中与木犀草素和苦参碱存在关联且有对接潜力的共有靶点为EGFR、MMP9和SRC。

2.4　分子对接结果

对靶点（EGFR、MMP9和SRC）及其相应配体（木犀草素和苦参碱）进行分子对接。木犀草素与EGFR、MMP9的LibDock评分分别为148和133。苦参碱与MMP9和SRC的LibDock 评分分别为105和101。它们的可视化结果如图6A～6D所示。配体和受体之间存在多种相互作用力。木犀草素含有多个苯环、羟基和一个羰基，靶点与其结合方式是氢键和π键的相互作用力。而靶点与苦参碱的结合方式更多的是通过氢键和烷基。从图6E～6H可以看出，每个配体都很好地被包裹在由氢键构成的受体口袋内，深入口袋其中保持对接牢固。

3 讨论

传统中医没有“肺结节”的病名^［10］，根据其症状或体征，可归于哮喘、咳嗽、肺积等范畴^［11］。既往研究表明，肺结节患者常伴有多种症状，包括咳嗽、咳痰等呼吸系统表现^［12-13］。据报道，中药在治疗肺结节方面具有一定成效，用药后肺结节的直径、数目、恶性概率、临床症状及肺功能等指标有明显改善^［14］。清热除湿类药物的使用是中医治疗肺结节的一条重要治则。苦刺花具有清热除湿、凉血解毒的功效，民间常被用于治疗咽喉痛、肺热咳嗽和其他呼吸系统疾病。据报道SDFE有治疗肺炎作用和抗肺癌潜力^［8-9］。本研究推测其也可治疗肺结节，并采用网络药理学与分子对接技术进行了佐证。

PPI可揭示蛋白质之间是如何相互作用及影响彼此活性^［15］。经PPI网络和化合物-交集靶点-KEGG通路网络筛选，得到EGFR、MMP9、AKT1和SRC等重要核心靶点。课题组已对AKT1开展过相关研究^［9］，因此本研究选择EGFR、MMP9和SRC作为分析对象。EGFR、MMP9和SRC是癌症相关通路上的重要蛋白。苦刺花含有大量生物碱类及较多黄酮类成分，两类代表性成分分别有苦参碱和木犀草素。网络药理学结果亦表明，苦参碱和木犀草素为核心化合物。分子对接结果显示，苦参碱和木犀草素可通过多位点与EGFR、MMP9和SRC结合，呈现良好的亲和力（LibDock评分≥100）^［16］，从而影响其活性。例如，木犀草素经证实可通过结合EGFR的激酶结构域（尤其是ATP结合区域），竞争性抑制ATP的结合，从而阻断其自磷酸化和激酶活性^［17-18］。EGFR不仅是癌症相关通路信号通路的重要起始靶点之一，而且也是其子信号通路AKT/PI3K和SRC/STAT3的上游蛋白。木犀草素对EGFR相关通路的抑制，具有自上而下的重要作用。而苦参碱结合在MMP的催化锌离子附近，直接阻碍底物进入，从而抑制细胞外基质降解。苦参碱与SRC的TYR A：209的相互作用可稳定SRC的非活性构象，阻断癌症相关通路下游通路。因此，SDFE可通过苦参碱和木犀草素作用到EGFR、MMP9和SRC上，从而干预癌症相关通路及其子信号通路。

肺结节的形成与慢性炎症、细胞异常增殖及局部微环境失衡密切相关，而炎症反应-组织损伤-纤维化是肺结节发展的核心病理链^［19-20］。肺结节的初始诱因多与肺部感染或慢性炎症相关^［21］。炎症因子（如TNF-α、IL-6）的持续释放可促进成纤维细胞增殖和局部结节形成。网络药理学结果显示，SDFE的靶点能显著富集在NF-κB信号通路上，而分子对接证实木犀草素可与EGFR（炎症信号转导的关键受体）稳定结合。这与我们前期实验发现一致：SDFE能下调LPS诱导的肺炎模型中TNF-α、IL-1β表达，减轻肺水肿和白细胞浸润^［8］。提示苦刺花可能通过抑制炎症级联反应，阻断肺结节的始动环节。此外，SDFE还可通过癌症相关通路和PI3K/Akt通路抑制细胞增殖。如苦参碱曾被报道能通过PTEN/PI3K/Akt轴抑制肺上皮细胞异常增殖^［22］，而木犀草素可诱导细胞周期的G2/M期阻滞^［23］。这些作用可能延缓结节生长，降低恶性转化风险。在肺结节微环境中，MMP9介导的细胞外基质降解是结节增长的关键步骤^［24］。SDFE中的木犀草素与MMP9结合，可抑制其蛋白水解活性，减少A549细胞侵袭^［25］，提示木犀草素或可稳定结节边界，防止周围组织破坏。细胞对促纤维化介质的反应通常通过跨膜受体转导，并经由部分受SFKs（SRC家族酪氨酸激酶）调控的细胞内信号通路传递^［26］。木犀草素/苦参碱在多种环境下对SRC激化具有抑制作用^［27-28］，可抑制肺纤维化。

基于网络药理学分析，本研究发现SDFE可通过核心成分（木犀草素、苦参碱等）调控EGFR、MMP9和SRC等关键靶点，抑制癌症相关通路以及PI3K/Akt等通路，进而干预炎症反应-组织损伤-纤维化这一肺结节发展历程。本研究可为苦刺花防治肺结节机制的实验验证提供前瞻性数据，也为其功能性产品开发提供了理论依据。

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基金资助

国家自然科学基金地区项目(82260432)

赣南医科大学横向项目(HX202407)