机械瓣膜置换术后华法林稳定治疗剂量预测模型研究

Development of a prediction model for the stable therapeutic dose of warfarin after mechanical valve replacement

摘要

目的 通过检测多基因多位点及结合临床变量，构建人工机械瓣膜置换术后患者华法林给药的优化模型，以提升模型精确度和理想预测百分比。 方法 对522例入选患者的临床资料进行追踪和详细记录，并通过Sanger基因测序法测定基因多态性。通过对多元线性回归分析，探讨基因多态性和临床数据变量对华法林日稳定剂量的影响。在逐步回归过程中，筛选并剔除了具有多重共线性的变量，从而构建了预测华法林稳定剂量的计算模型。利用理想的预测百分比评估临床效用的表现。 结果 最终有297例患者加入到模型的推演和验证中，新模型为：Y^=0.048-0.012（年龄）+1.512（体表面积）-0.812（rs9923231 AA）+1.811（rs9923231 GG）+1.581（rs1057910 AA）-1.090（rs1057910 AG）-0.159（rs699664 AA）。模型可解释60.2%的个体化用药差异。 结论 GGCX（rs699664）可能是华法林剂量潜在的预测因子，本研究建立的模型有望在临床实践中指导中国汉族人群的华法林个体化用药。

Abstract

Objective : This study aimed to develop an optimized model for warfarin dosing in patients post-artificial mechanical valve replacement by analyzing multi-gene polymorphisms alongside clinical variables to enhance model accuracy and predictive capability. Methods Clinical data from 522 patients were meticulously tracked and recorded， with gene polymorphisms identified through Sanger sequencing techniques. The impact of gene polymorphisms and clinical variables on the daily stable dose of warfarin was assessed using multiple linear regression analysis. During the stepwise regression process， multicollinear variables were systematically screened out to construct a computational model predicting stable warfarin doses. Clinical efficacy performance was evaluated based on the desired predicted percentage. Results A total of 297 patients were included for model inference and validation purposes. The newly developed model is expressed as follows： Y^=0.048-0.012（age）+1.512（BSA）-0.812（rs9923231 AA）+1.811（rs9923231 GG）+1.581（rs1057910 AA）-1.090（rs1057910 AG）-0.159（rs699664 AA）. This model accounts for approximately 60% of the variance observed in individualized drug dosing requirements. Conclusion GGCX（rs699664） may serve as a potential predictor for determining warfarin dosage； our newly established model holds promise for guiding personalized warfarin administration within clinical practice among the southern Chinese population.

Graphical abstract

关键词

华法林 / 基因多态性 / 稳定治疗剂量 / 药物遗传学算法 / 中国人群

Key words

Warfarin / Gene polymorphism / Stable therapeutic dose / Pharmacogenetic algorithm / Chinese population

华法林通过竞争性抑制维生素K的肝循环代谢，影响Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子的生成而产生抗凝效果。在人工瓣膜置换术后，患者需终身服用华法林以进行抗凝治疗^［1］。然而，华法林的安全用药范围狭窄，治疗效果的个体差异较大，用药过量或不足可能导致严重的出血或血栓栓塞^［1-2］。因此，实行个性化用药至关重要。2009年，国际华法林药物遗传学联合会（International warfarin pharmacogenetics consortium，IWPC）基于临床变量和药物遗传变量，建立了目前最为著名的华法林给药预测模型^［3］，为寻求精准且快速的预测方法提供了理论依据。

VKORC1是维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1基因，单核苷酸基因多态性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）能影响VKORC1的转录水平，从而对华法林的药效动力学过程产生影响^［2，4］。在现有回归模型中，位于启动区的-1639G＞A（rs9923231）和位于内含子的1173C＞T（rs9934438）是最常出现的变量，这2种多态性与降低华法林用药剂量有关^［5］。CYP2C9是催化S-华法林向其活性代谢产物转化的酶，其常见的SNP包括*2（rs1799853）和*3（rs1057910），这些多态对华法林剂量需求有重要影响，能解释约9.6%～20.6%的个体化用药差异^{［1-2，5-6］}。

CYP1A2是细胞色素P450超家族成员之一，其SNP rs2069514可解释约3.7%的个体化用药差异^［2］。GGCX编码的γ-谷氨酰羧化酶是维生素K循环中的关键酶，其作用是将无活性的维生素K依赖性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ前体羧化后成为有活性的凝血因子，其SNP rs699664是影响华法林药物剂量的重要因素^［7］。UGT1A1编码的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（Uridine diphosphate glucuronide transferase，UGT）是催化华法林二期生物转化的关键酶，其SNP rs887829可解释约5.5%的个体化差异^［8］。然而CYP1A2、GGCX、UGT1A1参与华法林给药预测建模的研究仍较少见。

此外，相关临床变量对华法林的需求量也能造成重要影响，非遗传因素可解释约9.4%～22%的个体化差异^［2，4］。降低华法林需求量的因素包括：高龄、缺少运动、低维生素K饮食、某些伴随药物如胺碘酮、辛伐他汀、倍他乐克、血管紧张素转换酶抑制剂（Angiotensin-converting enzyme inhibitors，ACEI）等，而体重、体表面积、血栓疾病史、吸烟史则可增加华法林的用药剂量。

鉴于上述遗传和临床变量，学者们建立了基于多元线性回归技术的药量计算模型来预测华法林日稳定剂量^{［1-3，9-12］}，但在我国实际应用于临床工作的此类模型却罕见。因此本研究旨在通过检测多基因多位点及结合临床变量，构建中国汉族人工机械瓣膜置换术后患者华法林给药的优化模型。现报告如下。

1 资料与方法

1.1　研究对象

研究受南昌大学第二附属医院伦理委员会批准（NO.2016〔027〕），招募2016年8月到2020年1月就诊于南昌大学第二附属医院心脏大血管外科行人工机械瓣膜置换术且术后均接受了华法林治疗的患者，共422例。患者知情同意并自愿加入本研究。纳入标准：⑴年龄18～70周岁；⑵术前凝血功能、血小板计数正常；⑶签署知情同意书；⑷华法林剂量能追踪管理至少3个月；⑸华法林达到稳定剂量［连续6次以上监测国际标准化比值（International normalized ratio， INR）维持在1.8～2.5之间^［2，13］］。排除标准：⑴肝肾功能异常、慢性肾功能不全、慢性肝炎、肝硬化等慢性肝肾疾病；⑵合并血液系统疾病者；⑶未能遵医嘱服用华法林或未能坚持随访者；⑷临床数据收集不全或组织标本DNA测序有缺陷者；⑸发生出血事件或死亡者；⑹随访复查心脏彩超发现心房或瓣膜血栓者；⑺合并服用抗血小板药、非甾体抗炎药者；⑻纯素食主义者。

1.2　分组

将患者随机分成2组，组别1为建模组，在进行验证抽样后，将剩余样本纳入本组，用于建立计算模型；组别2为验证组，从总体样本中采用随机抽样方式抽取30%对建模组进行验证和计算理想预测百分比（定义为：预测剂量在实际剂量±20%以内^［13］）。

1.3　临床资料收集

收集患者的性别、年龄、身高、体重、体表面积、华法林日稳定维持剂量、吸烟史、合并疾病（如高血压、糖尿病、血栓病史）、合并用药（如胺碘酮、ACEI、倍他乐克）。体表面积（m²）=0.006 1×身高（cm）+0.012 8×体重（kg）-0.152 9，华法林日稳定剂量为连续6次以上监测INR维持在1.8～2.5之间时患者口服的华法林剂量，在此期间华法林的剂量未发生变化。6次以上的监测在门诊随访完成，华法林用药剂量稳定者于出院第3 d、第7 d、第14 d、第21 d、第35 d和第50 d返院复查随访，随访2个月。有患者因其华法林治疗剂量不稳定，间隔2～3 d就需要返院，随访时间可能会更长。深静脉血栓（Deep vein thrombosis，DVT）、脑梗死、短暂性脑缺血发作（Transient ischemic attack，TIA）及肺栓塞（Pulmonary embolism，PE）均被归为血栓疾病史。本研究所涉及的ACEI主要包括苯磺酸氨氯地平和缬沙坦。

1.4　DNA提取及基因测序

应用DNA提取试剂盒（MagMAX FFPE DNA Ultra，美国赛默飞公司）提取DNA样本，针对需要测定的SNP分别设计正反2条引物，然后通过PCR技术扩增。基因测序采用Sanger测序法，测序结果由Chromas软件或SeqMan软件打开，序列比对由SeqMan软件完成。

1.5　遗传变量收集

对最终筛选入组的样本进行遗传变量收集，具体SNP包括：VKORC1（rs9923231、rs9934438、rs7196161和rs7294）、CYP2C9（rs1057910）、CYP1A2（rs2069514）、GGCX（rs699664）和UGT1A1（rs887829）。

1.6　统计学处理

对研究对象的临床变量进行描述性统计学分析，其中数值变量用均数±标准差表示，华法林日稳定剂量非数值变量用占比频率表示。2个队列临床变量采用独立样本比较的t检验或非参数检验。对于基因多态性，均计算其基因型频率和等位基因频率，并行Hardy-Weinberg平衡的测定。测定方法为计算各基因型的实际频率，通过卡方检验或Fisher's确切概率法（有意义的α=0.05）计算χ²值及对应的P值，P＞0.05为差异无统计学意义而符合Hardy-Weinberg遗传平衡。此外，通过公式计算D'值和r²值评估各SNP之间是否存在连锁不平衡的现象。

使用多元线性回归分析基因多态性和临床数据变量的贡献度，逐步回归筛选并剔除引起多重共线性的变量，以此建立回归模型计算日稳定剂量。采用理想的预测百分比检验临床效用。所有资料使用SPSS 25.0软件进行分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1　患者一般资料比较

共募集了522例患者知情同意并自愿加入本研究。经严格筛查，剔除DNA降解严重、部分位点扩增失败以及未能定期随访等患者125例，最终297例患者纳入研究。297例患者中随机选取208例作为建模组，剩下89例作为模型验证组，2组患者一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。基因型及等位基因分布情况见表2。

^①血栓栓塞史包括：深静脉血栓、脑梗死、短暂性脑缺血发作及肺栓塞；^②ACEI药物包括：苯磺酸氨氯地平和缬沙坦。

2.2　基因型分析

基因分型结果证实所有SNP的等位基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡。在连锁不平衡的验证中发现VKORC1 rs9923231（-1639G＞A）与VKORC1的其他3个SNP：rs9934438（D'=0.815，r²=0.952）、rs7196161（D'=0.874，r²=0.943）和rs7294（D'=0.887，r²≥0.910）均表现出强烈的连锁不平衡，因此仅将rs9923231作为代表VKORC1的遗传因素加入到模型的推导程序中。

2.3　单因素线性回归分析下各变量与华法林稳定剂量的关系

单因素线性回归分析揭示VKORC1（rs9923231、rs9934438、rs7196161和rs7294）、CYP2C9（rs1057910）、GGCX（rs699664）、年龄、身高、体重、体表面积、胺碘酮对华法林日稳定剂量的影响差异有统计学意义，其余因素则差异无统计学意义。其中身高、体重、体表面积、rs7196161、rs7294和rs699664是正相关因素，可视为增加华法林的需求用量。而年龄、胺碘酮、rs9923231、rs9934438、rs1057910则是负相关因素，可视为减少华法林的需求用量。见表3。

2.4　华法林剂量相关性分析

VKORC1 rs9923231（-1639G＞A）AA组华法林日稳定剂量［（2.421±0.728） mg］低于AG组［（3.124±0.996） mg］（P=0.003）和GG组［（4.078±0.384） mg］（P=0.042）。VKORC1 rs9934438（1173C＞T）TT组华法林日稳定剂量［（2.406±0.739） mg］低于TC组［（3.125±0.904） mg］（P=0.04）和CC组［（3.996±0.354） mg］（P=0.016）。VKORC1 rs7196161和rs7294的AA组华法林需求量分别比GG组高出64.92%和64.85%。VKORC1 rs7196161每携带1个A等位基因，剂量需求量分别增加32.85%和24.14%，VKORC1 rs7294每携带1个A等位基因，剂量需求量分别增加28.75%和28.04%。CYP2C9 rs1057910 GG组华法林日稳定剂量［（1.875±1.591） mg］低于AG组［（2.178±0.682） mg］（P=0.044）和AA组［（2.586±0.825） mg］（P＜0.001）。此外，GGCX rs699664 GG组华法林日稳定剂量［（2.668±0.816） mg］高于AA组［（2.331±0.664） mg］（P=0.037）。rs9923231、rs9934438、rs7196161、rs7294、rs1057910、rs699664的各基因型华法林剂量差异如图1所示。

2.5　剂量计算模型

将全部参数放入回归模型中计算，通过逐步回归筛选并剔除引起多重共线性的变量得到的最终回归模型。最终建立的模型为：Y^=0.048-0.012（年龄）+1.512（体表面积）-0.812（rs9923231 AA）+1.811（rs9923231 GG）+1.581（rs1057910 AA）-1.090（rs1057910 AG）-0.159（rs699664 AA）。最终模型中包含的预测因子共解释了60.2%（R²=0.602）的个体化用药剂量差异，通过逐步回归选择法筛选剔除后留在模型中的变量见表4。剔除的变量数据包括：性别、体重、身高、血栓病史、胺碘酮、美托洛尔、ACEI、吸烟史、高血压病史、糖尿病病史、rs9923231 AG、rs1057910 GG、rs2069514 AA、rs2069514 AG、rs2069514 GG、rs887829 AA、rs887829AG、rs887829 GG、rs699664 GG和rs699664 AG。

2.6　剂量模型验证

预测剂量在实际剂量±20%范围内时被认为是理想预测（即模型验证有效），将验证组的数据和遗传信息代入到新建立的给药模型中，计算的结果与实际结果相比得出预测理想占69.7%（62例），预测偏低（预测剂量低于实际20%）占13.4%（12例），预测偏高（预测剂量高于实际20%）占16.9%（15例），模型倾向于高估低剂量的用量，而低估高剂量的用量。见表5。

3 讨论

华法林是双香豆素类抗凝血药，其被发现已有60余年，在过去的50余年里，香豆素类药物是当时临床医师唯一能用的口服抗凝剂^［14］，其广泛应用于治疗非瓣膜性心房颤动、机械瓣膜置换术后、深静脉血栓、肺栓塞等。然而，华法林存在多项劣势，如治疗窗窄、出血或血栓事件发生率高、需反复抽血增加患者痛苦等。随着新型口服抗凝药的出现，华法林在治疗心房颤动、深静脉血栓或肺栓塞方面逐渐被疗效相似的达比加群或利伐沙班所取代^［15］。而对于人工机械瓣膜置换术后的抗凝治疗，华法林仍是疗效最为可靠的抗凝药^［2］。因此，考虑到华法林用药个体的差异性和风险性，基于基因的计算模型被认为是比固定形式更加快捷、安全、经济的系统给药方式，建立人工机械瓣膜置换术后人群的给药预测模型具有重要意义。

本研究主要针对人工机械瓣膜置换术后的中国汉族人群，设计并评估了一个用于预测华法林稳定治疗剂量的回归计算模型。该模型包含遗传变量和临床变量，约可以解释60.2%的个体化用药差异，这与以往研究报道的60.2%^［16］、58.3%^［17］相同或类似，却超过IWPC发布的大型回顾性研究数据的结果（49.4%）^［3］，原因可能与本研究纳入人群种族单一及纳入了更多的遗传变量和临床变量等有关。

本研究对遗传因素进行分析，VKORC1的4个SNP（rs9923231、rs9934438、rs7196161和rs7294）被证实存在强烈的连锁不平衡，且rs9923231（启动子区域）和rs9934438（内含子区域）的变异会使华法林的需求量减少，而位于未翻译区的rs7196161和rs7294的变异则会使华法林的需求量增加，这与KRISHNA KUMAR D等^［16］和AL-MAHAYRI Z N等^［18］研究一致。考虑到VKORC1多SNP位点存在强烈连锁不平衡，本研究仅选用rs9923231作为代表加入到模型推演中，因此强烈推荐不宜对VKORC1做多位点测序，以避免不必要的资源浪费。此外，本研究还发现GGCX rs699664对华法林稳定剂量的影响差异有统计学意义，这与JIANG N X等^［7］研究一致。本研究将该SNP经过逐步筛选后保留在最终模型中，其可解释1.8%的个体化差异。GGCX rs699664可能是华法林剂量计算中重要的预测因子，未来仍需要更多的研究进一步验证。在验证研究中，模型倾向于高估低剂量组（＜2.0 mg·d^-1）的用量，而低估高剂量组（＞4.0 mg·d^-1）的用量，这种现象在其他研究中同样出现^{［2-3，11-12］}。

本研究的局限性在于无法评估患者的部分临床因素如运动量和饮食结构，而这些因素均可能对华法林稳定剂量造成影响^［2］。另外，CYP4F2 rs2108622在众多文献中被认为有重要的预测价值^{［1，19-20］}，然而我们在前期测序中，因其个体变异度小而未进行后续的实验。

总之，本研究研发了一个主要用于预测中国汉族人群人工机械瓣膜置换术后的华法林稳定剂量预测模型。初期研究表明模型对预测维持剂量是有用的，理想预测百分比较高。另外，本研究发现GGCX rs699664可能是华法林剂量计算重要的预测因子，未来需要更多的验证研究来证实这些结果。

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基金资助

江西省科技厅社会发展领域一般项目(20171BBG70067)

江西省卫生健康委员会科技计划项目(202210613)