基于电荷相互作用高效负载EGCG的明胶微球制备与性能研究

Preparation and Properties of EGCG-Loaded Gelatin Microspheres Based on Charge Interaction

摘要

表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是绿茶茶多酚中最主要的活性成分，因其具备优异的抗氧化、抗炎和抗菌性能，在生物医学领域展现出广阔的应用场景.然而，EGCG存在生物活性高、易降解及带负电等特性，导致其难以被纳米载体高效负载.为此，本研究基于“电荷匹配”的负载方式构建一种高效负载EGCG的纳米缓释体系.利用去溶剂法分别制得带正、负电荷的A、B型明胶微球，并对比二者对EGCG的负载性能.研究发现，在生理条件（pH 7.4）下电正性的A型明胶微球能够实现对EGCG的负载效率高达56%，而B型明胶微球的负载效率仅约37%.载药后，A型明胶微球的ζ-电位由正转负，直接证实了静电相互作用是其高效负载EGCG的主导作用机制.体外释放曲线进一步显示，A型明胶载药微球具有更平缓的释放曲线；细胞实验初步表明，明胶微球以及载EGCG微球均具有良好的生物相容性.综上，基于“电荷匹配”策略，带正电荷的A型明胶微球可作为负载EGCG的高效、安全的载体之一.

Abstract

Epigallocatechin-3-gallate （EGCG）， as the most important active ingredient in green tea polyphenols， has shown broad application scenarios in the biomedical field in recent years due to its excellent antioxidant， anti-inflammatory and antibacterial properties. However， EGCG is difficult to be efficiently loaded into nanocarriers due to its high biological activity， easy degradation and negative charge. In this paper， a nano-release system for efficient loading of EGCG was constructed based on the ‘charge matching’ loading method. A and B type gelatin microspheres with positive and negative charges were prepared by desolvation method， and the loading properties of EGCG were compared. It was found that under physiological conditions （pH 7.4）， the electropositive A-type gelatin microspheres could achieve a loading efficiency of EGCG as high as 60%， while the loading efficiency of B-type gelatin microspheres was only about 40%. The ζ-potential of type A gelatin microspheres changed from positive to negative after drug loading， which directly confirmed that electrostatic interaction was the dominant mechanism for its efficient loading of EGCG. The in vitro release curve further showed that the drug-loaded microspheres of A-type gelatin had a more gentle release curve. Cell experiments showed that gelatin microspheres and EGCG-loaded microspheres had good biocompatibility. This study illustrates the important value of the ‘charge matching’ strategy in drug delivery， and verifies that positively charged A-type gelatin microspheres are one of the carriers for efficient loading of EGCG.

Graphical abstract

关键词

明胶微球 / 表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG） / 电荷相互作用 / 药物负载 / 控制释放

Key words

gelatin microspheres / epigallocatechin-3-gallate（EGCG） / interaction between charges / drug loading / controlled release

表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）作为绿茶茶多酚最主要活性成分，因其优异的抗氧化、抗炎和抗菌性能在生物医学领域受到了广泛关注^［1-2］.然而，因EGCG的不稳定性通常需要将其负载在载体中构建缓释体系，并且因其较强的负电性极大地限制了其在载体中的高效负载^［3］.因此，开发能够高效搭载并控制释放EGCG的递送系统成为当前研究的热点之一^［4-5］.在众多载体中，明胶因其优异的生物相容性、可降解性及可修饰性而被美国药品监督管理局（FDA）认定为“一般公认安全”的基质材料，是构建药物递送系统的载体材料的理想选择^［6］.

根据明胶制备工艺的不同，明胶被分为A型明胶（酸法处理）和B型明胶（碱法处理）^［7］.不同制备方式导致了两者的等电点存在显著差异：A型明胶的等电点约为7，而B型明 胶的等电点则相对较低，约为5^［8-9］.这一差异导致在人体生理pH（约7.4）环境下，A型明胶分子表面带正电荷，而B型明胶分子表面带负电荷.值得注意的是，大多数药物分子（包括EGCG）在生理pH条件下亦表现出特定的电荷特性^［10］.基于这一特性，利用载体与药物之间的静电相互作用成为一种实现药物高效负载的有效策略^［11-12］.

本研究采用去溶剂法^［13］分别制备了高、低2种交联度的A型和B型明胶微球，并系统地评估了其形貌、粒径、降解性能及在不同pH条件下的带电情况.通过筛选，确定了结构最为稳定的最优载体.进一步以EGCG为模型药物，对比分析了A、B型明胶微球在载药前后的ζ-电位变化、载药量及载药效率，验证了“电荷匹配”策略的有效性.最后，通过体外释药行为研究和CCK-8细胞毒性实验，综合评估所构建载药系统的药物缓释性能与生物相容性.本研究不仅旨在开发一种高效的EGCG递送系统，更期望通过系统性的对比分析，阐明“电荷匹配”机制在药物载体设计中的关键作用.

1 材料与方法

1.1 实验试剂

表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）购自sigma-aldrich（USA），戊二醛（质量分数25%）购自上海阿拉丁生化技术有限公司（中国），A型明胶、B型明胶购自源叶生物科技有限公司（中国），无水乙醇来源于成都科隆化学试剂厂（中国）.使用 Milli-Q水净化系统（merck millipore，美国）在实验室自制去离子水.

1.2 载EGCG明胶微球的制备与表征

1.2.1 不同交联度A型和B型明胶微球的制备与表征

将1.25 g A型明胶溶解于25 mL去离子水中，将溶液的pH值调节至9.随后，将该溶液加入在超声处理下的50 mL无水乙醇中（记为溶液A）.同时，准备75 mL按相同比例混合的水和乙醇溶液，并分别加入0.2 mL（低交联度）和0.5 mL（高交联度）的戊二醛（记为溶液B）.将溶液A加入溶液B中，搅拌3 h后静置过夜.最后，调整溶液的pH值至7，进行离心处理并用乙醇洗涤，干燥后即可获得最终产物.B型明胶微球的制备过程如下：首先将B型明胶溶液加入超声乙醇中，同时将pH值调节至7，其余步骤则与A型明胶微球的制备过程保持一致.分别制备了高交联度A型明胶微球（HAP）、低交联度A型明胶微球（LAP）、高交联度B型明胶微球（HBP）和低交联度B型明胶微球（LBP）.随后，利用扫描电镜（SEM，zeiss sigma 360，德国）对微球的形貌进行观察，并通过Image J软件进行粒径统计分析.在PBS中对A、B型明胶微球分别进行了有酶和无酶降解实验.酶降解实验中，将5 mg明胶微球加入25 mL含有质量浓度400 ng/mL I型胶原酶的PBS溶液中，分别于6、12、24、48和72 h收集剩余微球，干燥后称质量.无酶降解实验中，将5 mg明胶微球加入25 mL PBS溶液中，分别于第0.5、1、4、7、14和21天收集剩余微球，干燥后称质量.按下列公式计算剩余质量百分数：

剩余质量百分数（%）=A_i /A₀*100，

式中：A₀是明胶微球的初始质量，A_i 是每个时间点的残余质量.

为评估细胞增殖活性，将骨髓间充质干细胞（BMSCs）以每孔6×10³个细胞的密度接种于96孔板.待细胞贴壁后，移除培养基，向每个孔中分别加入100 μL完全培养基或分别使用含微球AP、BP质量浓度为0.01、0.10和1.00 mg/mL的培养基以及含AEP质量浓度为0.1、0.5和1.0 mg/mL的培养基培养骨髓间充质干细胞，每组设置5个复孔.各组培养基每48 h更换1次.培养1、3、5 d后，使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖活性，并记录450 nm处的吸光度值.

1.2.2 载EGCG微球的制备及表征

将200 mg干燥后的A型明胶微球加入40 mL EGCG溶液（12.5 mg/mL）中搅拌过夜，离心干燥后得到载EGCG微球AEP.将200 mg B型微球加入40 mL EGCG溶液（12.5 mg/mL）中搅拌过夜，离心干燥后得到载EGCG微球BEP.明胶微球不同pH下的ζ-电位以及载药前后的ζ电位通过zetasizer nano ZS（malvern panalytical，UK）测定，并通过紫外分光光度计计算A、B型明胶微球分别对EGCG的搭载能力以及释放情况.首先通过记录搭载EGCG前后溶液的吸光度变化情况计算搭载EGCG的质量，而后分别将5 mg AEP、BEP浸泡在10 mL PBS溶液中，分别在第0.5、1、3、7和14天取样液通过紫外分光光度计记录吸光度值，计算得到每个时间节点的溶液浓度和EGCG质量.

本文统计分析结果以均数±标准差表示.用GraphPad Prism软件进行单因素方差分析和Tukey后验分析.统计学显著性定义为：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.000 1.

2 实验结果与分析

2.1 不同pH条件下A和B型明胶在乙醇中的析出行为

本研究采用去溶剂法制备明胶微球.A型与B型明胶的制备工艺存在差异，其等电点亦有所不同（A型约为7，B型约为5）.在等电点状态下，蛋白质分子的净电荷为零，静电斥力降至最低，从而导致其溶解度最小，易于析出^［14］.如图1所示，A型明胶在pH=7条件下、B型明胶在pH=5条件下均发生聚集析出现象，这验证了2种明胶等电位差异的特性.然而，这种聚集性析出并不适合用于明胶微球的制备.但当溶液的pH值远离等电点时，明胶分子因携带同种电荷而产生显著的静电斥力，从而保持其溶解状态，这使得无法制备微球^［15-16］.为避免过度聚集或溶解，实验确定了在pH=9时析出A型明胶、在pH=7时析出B型明胶为最佳条件，这样能有效平衡析出率与静电稳定性，非常适合制备明胶微球.

2.2 不同交联度的A型和B型明胶微球的形貌及降解性能

通过扫描电子显微镜分别观察了制备的高交联度和低交联度的A型和B型明胶微球的形貌，并对其粒径进行了统计分析，结果如图2所示.各组别的微球均呈现规则的球形，且粒径分布较为集中.从粒径统计结果来看，高交联度A型明胶微球（HAP）的平均粒径为162 nm，而低交联度A型微球（LAP）的平均粒径则为493 nm；高交联度B型微球（HBP）的平均粒径为122 nm，而低交联度B型微球（LBP）的平均粒径则达到549 nm；表明高交联度微球（HAP和HBP）的粒径均显著小于相应类型的低交联度微球（LAP和LBP）.在形貌特征上，高交联度微球（HAP和HBP）展现出更为完整的结构，且粒径分布更为均匀.相较之下，低交联度微球（LAP和LBP）不仅粒径显著增大，部分微球还出现了结构破损或表面皱缩等现象，这很可能是因为交联度不足，导致微球骨架强度降低^［17］.上述结果表明，提升交联度有助于形成结构更为稳定、粒径更小且分布更加均匀的明胶纳米微球.

随后，分别对微球在含有胶原酶及不含胶原酶的条件下进行了降解实验.如图3所示，在所有实验组中，微球的降解速率均呈现出对交联度的显著依赖性.无论是在PBS缓冲液（图3（a）和（b））还是含胶原酶的溶液（图3（c）和（d））中，高交联度微球（HAP和HBP）的质量残留率均明显高于相应的低交联度微球（LAP和LBP），这表明较高的交联度能够有效提升明胶微球的稳定性.特别值得关注的是，在含有胶原酶的环境（图3（c）和（d））中，所有微球均展现出比在PBS中更为迅速的降解现象，这一结果验证了胶原酶对明胶分子的特异性酶解作用^［18-19］.结合图1中SEM的观察结果，后续选取稳定性更高、均匀性更佳的高交联度微球进行药物搭载实验.

2.3 A和B型明胶微球带电情况及负载EGCG性能对比

为进一步探讨A型明胶微球（AP）与B型明胶微球（BP）作为药物载体的电荷特性，对其在不同pH环境下的ζ-电位进行了表征，并分析了载药前后的电位变化情况，结果如图4所示.图4（a）曲线清晰地揭示了AP与BP之间的等电位差异，这一差异直接导致在人体生理pH条件（约为7.4）下2种微球表现出相反的电荷特性：AP表面呈现正电荷（ζ-电位>0），而BP表面则呈现负电荷（ζ-电位<0）.

基于上述电荷特性，进一步探讨了负载EGCG对微球表面电位的影响（图4（b））.结果显示，负载EGCG后，AP的ζ-电位由负载前的约+10 mV转变为约-20 mV.这一变化证实了带负电的EGCG分子通过静电相互作用有效结合在带正电的AP表面，并成功中和了AP所带的正电荷.相反，原本带负电的BP（ζ-电位约为-14 mV）在负载EGCG后，其负电位进一步增强至约-24 mV.这可能是由于含酚羟基的EGCG通过非静电作用（如氢键、疏水作用）吸附于BP表面，从而进一步提升了其负电荷值^［20］.

为定量评估A和B型明胶微球负载EGCG的性能，对其载药量与载药效率进行了系统性比较，结果如图5所示.A型明胶微球对EGCG的载药量约为56%，显著高于B型明胶微球的37%.同时，A型明胶微球的载药效率（约20%）也明显优于B型明胶微球.这一差异进一步验证了明胶微球电荷特性对EGCG负载的影响：带正电的A型微球能够通过强烈的静电吸引力高效负载带负电的EGCG分子；而带负电的B型微球与带负电的EGCG之间存在的静电斥力，则限制了其负载.这些结果表明，基于“电荷匹配”原则选择微球载体，是实现EGCG高效负载的有效策略.A型明胶微球在载药能力和载药效率方面均展现显著优势，使其成为一种极具应用潜力的EGCG递送系统，并且因为2种明胶微球对于药物的搭载主要依靠溶胀以及静电相互作用使得溶液中的EGCG载入微球中，从而小分子药物在载入微球内并在干燥后不会影响微球的粒径大小.

为评估载药微球的释药性能，考察了载EGCG的A型（AEP）和B型（BEP）明胶微球在PBS（pH 7.4）中的体外EGCG释放行为，结果如图6所示.2种微球均实现了EGCG在21 d内的缓慢释放.在整个释放周期内，AEP的累积释放率始终略低于BEP.这一现象与前面揭示的电荷特性密切相关，进一步验证了正负电荷载药策略的优势.A型明胶在生理pH环境下带正电荷，与带负电荷的EGCG分子之间存在显著的静电吸引力^［21］.这种吸引力不仅有效促进了前期的药物装载，还在释放阶段对药物扩散产生了牵引作用，使得药物从微球基质中释放的速率更加缓慢且平稳.相比之下，B型明胶微球与EGCG均带负电荷，分子间存在静电斥力，导致搭载的药物迅速扩散至释放介质中，从而使B型明胶微球的释放速率和累积释放量均高于A型明胶微球.

综上所述，A型明胶微球通过其与EGCG之间的静电吸引作用，实现了更为平稳的药物释放.这种缓和且持续的释放特性，对于维持稳定的血药浓度、提升药物治疗效果具有至关重要的作用.因此，从药物释放控制的角度考量，并结合其在载药量和包封率方面的优势，A型明胶微球无疑是优于B型明胶微球的EGCG递送载体.

2.4 明胶微球及载药明胶微球的细胞相容性

评估所制备明胶微球的生物相容性，采用CCK-8法检测了骨髓间充质干细胞与不同质量浓度（0.01、0.10、1.00 mg/mL）A型明胶微球（AP）和B型明胶微球（BP）共培养1、3、5 d后的细胞活力，结果如图7所示.在各浓度及时间点下，各组细胞活力均高于80%，表明2种微球均无明显细胞毒性.

为评估载药微球的生物相容性，采用CCK-8法检测了不同质量浓度（0.1、0.5、1.0 mg/mL）的A型明胶载药微球（AEP）对骨髓间充质干细胞存活率的影响，结果如图8所示.在各浓度条件下培养1、3和5 d后，细胞活力均维持在80%以上，表明AEP在0.1~1.0 mg/mL质量浓度范围内无明显细胞毒性，具有良好的生物相容性.

3 结论

本研究成功制备并对比了高交联度A型与B型明胶微球作为EGCG递送载体的性能.结果显示，在生理pH环境下，带正电的A型明胶微球通过与带负电的EGCG之间的强静电吸引作用，显著提升了载药量及负载效率，其载药后ζ-电位的反转现象直接证实了以“电荷匹配”为核心的EGCG高效负载机制.进一步的体外释放研究表明，A型明胶微球与EGCG之间的静电相互作用有效延缓了药物释放，使EGCG的释放过程更加平缓且持续.此外，细胞实验证实了2种明胶微球均具有良好的生物相容性.综上所述，本研究不仅验证了A型明胶微球作为EGCG递送载体的优越性，还阐明了一种基于药物带电特性合理设计递送系统的策略，为载药系统的开发提供了新的思路.

参考文献

[1] Cai T， Bu L J， Wu Y T， et al. Accelerated degradation of bisphenol A induced by the interaction of EGCG and Cu  in Cu  /EGCG/peroxymonosulfate process［J］.Chemical Engineering Journal，2020，395：125134.

[2] Wei Y Q， Chen P P， Ling T J， et al. Certain （-）-epigallocatechin-3-gallate （EGCG） auto-oxidation products （EAOPs） retain the cytotoxic activities of EGCG［J］.Food Chemistry，2016，204：218-226.

[3] Yan X J， Zhang X L， Mcclements D J， et al. Co-encapsulation of epigallocatechin gallate （EGCG） and curcumin by two proteins-based nanoparticles： role of EGCG［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2019，67（48）：13228-13236.

[4] Wu H Y， Liu Y， Wang Y M， et al. Dynamic covalent prodrug nanonetworks via reaction-induced self-assembly for periodontitis treatment［J］.ACS Nano，2024，18（51）：34884-34901.

[5] Ahmed S. Green tea polyphenol epigallocatechin 3-gallate in arthritis： progress and promise［J］. Arthritis Research & Therapy，2010，12（2）：208.

[6] Shutava T G， Balkundi S S， Vangala P， et al. Layer-by-layer-coated gelatin nanoparticles as a vehicle for delivery of natural polyphenols［J］.ACS Nano，2009，3（7）：1877-1885.

[7] Balthasar S， Michaelis K， Dinauer N， et al. Preparation and characterisation of antibody modified gelatin nanoparticles as drug carrier system for uptake in lymphocytes［J］.Biomaterials，2005，26（15）：2723-2732.

[8] Paciello A， Amalfitano G， Garziano A， et al. Hemoglobin-conjugated gelatin microsphere as a smart oxygen releasing biomaterial［J］.Advanced Healthcare Materials，2016，5（20）：2655-2666.

[9] Zhang Z， He X X， Zeng C X， et al. Preparation of cassava starch-gelatin yolk-shell microspheres by water-in-water emulsion method［J］.Carbohydrate Polymers，2024，323：121461.

[10] 沈佳斌，朱怡蓉，杨金花，等. 高性能慢性伤口敷料的研究进展［J］. 四川师范大学学报（自然科学版），2025，48（2）：143-153.

[11] Hassani Besheli N， Martens M， Macías-Sánchez E， et al. Unraveling the formation of gelatin nanospheres by means of desolvation［J］.Nano Letters，2023，23（23）：11091-11098.

[12] 李吉东，刘江山. 纳米酶参与的仿生级联催化在生物医学中的应用［J］. 四川师范大学学报（自然科学版），2025，48（4）：440-456.

[13] Wang H N， Zou Q， Boerman O C， et al. Combined delivery of BMP-2 and bFGF from nanostructured colloidal gelatin gels and its effect on bone regeneration in vivo ［J］. Journal of Controlled Release，2013，166（2）：172-181.

[14] Baydin T， Aarstad O A， Dille M J， et al. Long-term storage stability of type A and type B gelatin gels： the effect of Bloom strength and co-solutes［J］.Food Hydrocolloids，2022，127：107535.

[15] Li Z， Gu L W. Effects of mass ratio， pH， temperature， and reaction time on fabrication of partially purified pomegranate ellagitannin-gelatin nanoparticles［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59（8）：4225-4231.

[16] Goudie K J， Mccreath S J， Parkinson J A， et al. Investigation of the influence of pH on the properties and morphology of gelatin hydrogels［J］.Journal of Polymer Science，2023，61（19）：2316-2332.

[17] 朱帝，李维，葛方兰，等. 丁苯酞-两亲碳质微球材料的制备与表征［J］. 四川师范大学学报（自然科学版），2023，46（5）：677-684.

[18] Solomonov I， Zehorai E， Talmi-Frank D， et al. Distinct biological events generated by ECM proteolysis by two homologous collagenases［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2016，113（39）：10884-10889.

[19] Wang X， Luo J， He L， et al. Hybrid pH-sensitive nanogels surface-functionalized with collagenase for enhanced tumor penetration［J］. Journal of Colloid and Interface Science，2018，525：269-281.

[20] Higdon J V， Frei B. Tea catechins and polyphenols： health effects， metabolism， and antioxidant functions［J］.Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2003，43（1）：89-143.

[21] Borah S， Bhuyan P M， Sarma B， et al. Sustainable dyeing of mulberry silk fabric using extracts of green tea （Camellia sinensis）： extraction， mordanting， dyed silk fabric properties and silk-dye interaction mechanism［J］.Industrial Crops and Products，2023，205：117517.

基金资助

国家自然科学基金面上项目(32371398)