聚乙烯降解菌Amycolatopsis orientalis ZEL-1的诱变育种及降解性能研究

Mutagenesis Breeding and Degradation Performance of the Polyethylene-Degrading Bacterium Amycolatopsis Orientalis ZEL-1

摘要

东方拟无枝酸菌ZEL-1（Amycolatopsis orientalis ZEL-1）是一株可高效降解聚乙烯（polyethylene，PE）的功能菌株.为提升ZEL-1的PE降解率，本研究采用紫外（UV）、微波、吖啶橙（AO）和盐酸羟胺对ZEL-1分别进行单一诱变及复合诱变，并对突变菌株的生长特性和PE降解性能进行系统研究.结果表明，UV和AO诱变条件下的ZEL-1菌株正突变率较高，分别达到17.24%和19.05%.在此基础上，采用UV辐照50 s+AO质量分数为0.02%的复合诱变处理，可使ZEL-1的正突变率提升至25.71%，并显著增强了其对PE的降解能力.综合评估突变菌株生长特性及PE膜片失重率等指标，筛选获得复合诱变突变株UV-AO-1为最优菌株，其处理后的PE膜片在30 d内的失重率较原始菌株提高了140.05%.培养60 d后，UV-AO-1菌株处理的PE膜片的力学性能大幅降低，其水接触角、拉伸强度和断裂伸长率均明显低于原始菌株.综上，本研究通过诱变条件优化，获得了一株ZEL-1的突变菌株，较原始菌株PE降解能力显著增强，为高效PE降解菌株的选育及其在塑料污染生物治理中的应用提供了新思路.

Abstract

Amycolatopsis orientalis ZEL-1 is a functional strain capable of efficiently degrading polyethylene （PE）. To enhance its PE degradation efficiency， ZEL-1 was subjected to single and combined mutagenesis using ultraviolet （UV） irradiation， microwave irradiation， acridine orange （AO）， and hydroxylamine hydrochloride. The growth characteristics and PE degradation performance of the mutant strains were systematically analyzed. The results showed that ZEL-1 exhibited relatively high positive mutation rates under UV and AO induction， reaching 17.24% and 19.05%， respectively. Based on this， combined mutagenesis using UV （50 s） and 0.02% AO further increased the positive mutation rate to 25.71% and significantly enhanced the PE degradation ability of ZEL-1. Through comprehensive evaluation of strain growth characteristics and PE film weight loss， the composite mutant strain UV-AO-1 was identified as the optimal strain， and the PE films treated with this strain exhibited a 140.05% higher weight loss rate within 30 days compared with those treated with the original strain. After 60 days of cultivation， the mechanical properties of PE films treated with UV-AO-1 were greatly reduced， with water contact angle， tensile strength， and elongation at break all markedly lower than those of the original strain. In conclusion， a mutant strain with significantly improved PE degradation capacity was obtained through combined UV （50 s） and 0.02% AO mutagenesis， providing new insights for the selection of highly efficient PE-degrading strains and their application in the bioremediation of plastic pollution.

Graphical abstract

关键词

诱变育种 / 东方拟无枝酸菌 / 聚乙烯 / 生物降解

Key words

mutagenic breeding / amycolatopsis orientalis / polyethylene / biodegradation

聚乙烯（polyethylene，PE）因其化学性质稳定、质地轻、延展性高、电绝缘性能优良且生产成本低廉，被广泛应用于包装、农用地膜及建筑等领域，是目前全球生产与应用最为广泛的高分子化合物之一^［1-2］.PE分子主链主要由惰性C—C键构成，在自然环境条件下极难降解^［3］.大量废弃的PE因处置不当而长期积累于水体和土壤等环境介质中，进而引发严峻的环境问题，例如被生物体误食并造成生理损伤甚至死亡、破坏土壤结构与理化性质等危害^［4-5］.此外，在机械磨损、风化、紫外线及热辐射等多重因素影响下，PE易进一步破碎成为微塑料（microplastics，MPs）^［6］.而PE-MPs具有粒径小、比表面积大和疏水性强等特征，不仅能够进入食物链引发迁移和累积，威胁人类健康，还可作为载体吸附重金属及有机污染物，从而放大其整体毒性，进一步加剧生态风险^［7］.

传统的PE塑料废弃物处理方式（如填埋、焚烧等）普遍存在二次污染风险大或处理成本高等局限^［8］.相较之下，生物降解技术成本低且对环境友好，被认为是非常有前景的绿色处理方法.大量微生物已被证明能够降解PE.例如，使用芽孢杆菌（Bacillus sp.）处理PE薄膜，其水接触角在20 d后减小10.8°^［9］.从海岸塑料碎片中分离出的食烷菌（Alloalcanivorax sp.）和戈登氏菌（Gordonia sp.）均能使PE薄膜表面出现裂纹和蚀坑^［10］.尽管越来越多的PE降解菌被筛选出，但是菌株的PE降解效率仍相对较低，在实践应用中难以满足产业需求.因而，高效降解菌的选育仍是PE生物降解的主要研究方向^［11-12］.

诱变育种是利用诱变剂诱导目标遗传突变，进而选育新品种的技术，主要包括物理诱变和化学诱变^［13］.其中，物理诱变主要通过紫外辐射（ultraviolet radiation，UV）、微波辐射和射线等方式造成DNA损伤，如形成环丁烷嘧啶二聚体或6-4光产物（即相邻嘧啶间的光化学交联损伤）及其杜瓦共价异构体；化学诱变则多通过烷化剂、嵌合剂和碱基类似物等诱变剂引起DNA烷基化或形成碱基加合物，从而导致突变^［14-15］.诱变育种作为微生物育种的重要手段之一，已被应用于功能微生物的性能改良，尤其在高分子材料降解菌株的选育中展现出良好应用前景.已有研究表明，诱变技术可显著提升微生物对多种高分子化合物的降解能力.例如，使用UV诱变获得能够高效降解聚乳酸（polylactic acid，PLA）的固氮细菌（Azotobacter sp.）DS2004-a，且该菌株的PLA解聚酶活性较原始菌株提升16.51%^［16］.硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）被用于尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）DSCF-8的诱变实验，结果表明突变菌株D8B14可对聚丁二酸丁二醇酯［poly（butylene succinate），PBS］的降解率提升34.49%^［17］.由此可见，通过物理或化学诱变方式能有效提升塑料降解菌株的降解效率.

放线菌是土壤中的优势微生物类群，具有较强的有机质降解能力，研究者们发现其在降解PE方面同样拥有巨大潜力.例如，白色嗜盐多孢放线菌（Haloactinopolyspora alba）D-1在培养28 d后对PE降解的失重率达到3.34%^［18］.本团队前期分离得到了一株可高效降解PE的放线菌菌株——东方拟无枝酸菌ZEL-1（Amycolatopsis orientalis ZEL-1）^［19］.研究表明，该菌株对中低分子质量的PE具有较好的降解效果，对不同重均分子量（M_w）的PE-MPs（M_w=2 000、5 000、100 000）的60 d降解率分别达到35.81%、22.14%和12.19%；然而，该菌株对高分子质量PE的降解能力相对较弱，对PE膜片（M_w>100 000）的60 d降解率仅为5.57%.为了进一步提高ZEL-1的PE降解能力并拓宽应用范围，本研究以ZEL-1为原始菌株，采用2种物理诱变方式（UV、微波）和2种放线菌常用的化学诱变剂吖啶橙（acridine orange，AO）、盐酸羟胺的单一诱变，并进一步开展复合诱变改良.通过对突变株生长状况以及PE降解性能等指标的综合评价，筛选出降解能力显著提升的优良突变株，并对其降解特性进行分析，为高效PE生物降解菌株的构建及其在塑料污染治理中的应用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Amycolatopsis orientalis ZEL-1由四川师范大学生命科学学院（微生物与分子生物实验室）保藏和提供；吖啶橙、盐酸羟胺、可溶性淀粉、K₂HPO₄·3H₂O、KH₂PO₄、KNO₃、MgSO₄·7H₂O、FeSO₄·7H₂O、NH₄NO₃、ZnSO₄·7H₂O和MnSO₄·H₂O均购自成都市科龙化工试剂厂，琼脂粉购自Bio Sharp（试剂均为化学分析纯）；PE粉末（M_w=2 000、5 000、100 000）、膜片（M_w>100 000）均来源于中国石油化工股份有限公司茂名分公司.

1.2 仪器与设备

恒温培养摇床THZ-300（中国上海-恒科学仪器有限公司）、紫外诱变箱（中国北京赛百奥科技有限公司）、微波炉（中国佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司）、紫外分光光度计UV-2 000（中国成都万科实业有限公司）、超微量核酸蛋白测定仪（德国Analytikjena公司）、光学接触角测量仪Theta Lite（瑞典Biolin公司）和万能材料试验机INSTRON 3 367（美国Instron公司）.

1.3 实验方法

1.3.1 培养基制备

高氏I号培养基（液体），各成分质量浓度如下：可溶性淀粉20 g/L、NaCl 0.5 g/L、K₂HPO₄·3H₂O 0.5 g/L、KNO₃ 1 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L、FeSO₄·7H₂O 0.01 g/L和蒸馏水.

以PE为唯一碳源的基础培养基（液体），各成分质量浓度如下：KH₂PO₄ 0.7 g/L、K₂HPO₄·3H₂O 0.5 g/L、NH₄NO₃ 1.0 g/L、NaCl 0.005 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L、FeSO₄·7H₂O 0.002 g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.002 g/L、MnSO₄·H₂O 0.001 g/L、PE 2 g/L（质量分数为0.2%）和蒸馏水.

上述两种液体培养基在制备相应固体培养基时，在其基础上分别添加质量浓度20 g/L的琼脂粉.

1.3.2 菌悬液制备

从-80 ℃甘油保藏管中取出ZEL-1菌种进行活化与纯化，随后接种于高氏Ⅰ号固体培养基，在28 ℃条件下培养3~5 d.培养结束后，用无菌生理盐水洗脱培养基表面的菌苔并收集于锥形瓶中，在28 ℃、180 r/min条件下振荡2 h，使菌体充分分散.采用血球计数板对菌体数量进行计数，并根据计数过程中产生的稀释倍数加入相应比例的无菌生理盐水，将菌液浓度调整至1.0×10⁸ 个/mL备用.为确定后续实验所需的菌液浓度，对菌悬液进行梯度稀释至10⁻⁸个/mL，每个稀释度取200 μL均匀涂布于高氏Ⅰ号固体培养基上，每组设置3个平行组.培养3~5 d后统计菌落数，选择平均菌落数约为300 CFU的稀释倍数作为后续致死率计算的工作稀释浓度.

1.3.3 紫外诱变实验

在无菌条件下，将制备好的菌悬液按预实验确定的稀释倍数进行稀释，分别取2 mL菌液置于10组无菌平皿中，采用λ=254 nm的紫外光进行诱变处理，设置不同照射时长（0~90 s，间隔10 s），其中0 s组作为空白对照，每组实验设置3个重复组.其他过程均在红光条件下进行，每隔10 s用无菌涂布棒进行翻搅，紫外照射结束后，样品立即避光，冰浴24 h.随后分别取200 μL诱变处理后的菌液涂布于高氏I号固体培养基中，于28 ℃避光培养5~7 d，计算致死率，如式（1）.另外将剩余菌液接种至以PE（M_w=5 000）为唯一碳源的液体培养基中，28 ℃避光培养15 d，培养结束后，再取200 μL菌液按前述相同稀释倍数进行稀释，并涂布于以PE（M_w=5 000）为唯一碳源的固体培养基中，28 ℃培养15 d，计算正突变率，如式（2）.

\mathrm{致死}\mathrm{率}=\left(\mathrm{1}-\frac{\mathrm{诱变}\mathrm{后平}\mathrm{板菌}\mathrm{落数}}{\mathrm{空白}\mathrm{对照}\mathrm{组平}\mathrm{板菌}\mathrm{落数}}\right)\times \mathrm{100}\%，（1）

\mathrm{正突}\mathrm{变率}=\frac{\begin{array}{l}\mathrm{预期}\mathrm{突变}\mathrm{菌落}\mathrm{数}\\ (\mathrm{透明}\mathrm{圈直}\mathrm{径大}\mathrm{于原}\mathrm{始菌}\mathrm{株})\end{array}}{\mathrm{对照}\mathrm{组在}\mathrm{培养}\mathrm{基中}\mathrm{的菌}\mathrm{落数}}\times \mathrm{100}\%.（2）

1.3.4 微波诱变实验

微波炉工作频率为2 450 MHz，最大输出功率800 W.设置不同功率（240、400、640和800 W）与作用时间（30、60、90、120、180 s）的组合条件对菌悬液进行微波诱变处理，空白对照组不作微波处理.诱变过程中进行冰浴处理，每15 s换冰一次以减弱微波产生的热效应.微波作用时间采用累计方式计算，每处理完一组，样品立即避光冰浴24 h.诱变完成后计算致死率和正突变率，评价微波作用功率与时间对ZEL-1的诱变效果.

1.3.5 吖啶橙诱变实验

配制质量浓度为10 g/L（质量分数为1%）的AO母液，并用0.22 μm有机相滤膜过滤.以母液为基础，配制含AO终质量分数分别为0、0.002%、0.004%、0.005%、0.01%、0.02%和0.04%的高氏I号液体培养基.向每组培养基中加入200 μL菌悬液进行诱变，其中AO质量浓度为0的组（不添加AO）为空白对照组.将培养基置于28 ℃、200 r/min摇床避光培养3 d，冰浴24 h后离心收集菌体，用无菌生理盐水反复洗涤以去除诱变剂.最后，用10 mL生理盐水重悬，在15 mL无菌试管中梯度稀释到10^-5个/mL.诱变完成后计算致死率和正突变率，评价AO质量浓度对ZEL-1的诱变效果.

1.3.6 盐酸羟胺诱变实验

配制质量浓度为20 g/L（质量分数为2%）的盐酸羟胺母液，并进行过滤.以母液为基础，配制含盐酸羟胺终质量分数分别为0、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%和0.1%的高氏I号液体培养基.每组培养基加入200 μL菌悬液进行诱变，其中盐酸羟胺质量浓度为0的组（不添加盐酸羟胺）为空白对照组.其余处理步骤基本同1.3.5所述方法，仅将梯度稀释终点调整为10^-3个/mL.诱变完成后计算致死率和正突变率，评价盐酸羟胺质量浓度对ZEL-1的诱变效果.

1.3.7 复合诱变实验

根据前述单一诱变实验结果，确定最佳诱变条件与剂量后，采用紫外-吖啶橙（UV+AO）复合诱变方式进一步诱变处理.以UV诱变获得的优势突变株作为出发菌株进行AO复合诱变，以未经任何诱变处理、菌体浓度相同的原始出发菌株菌悬液作为空白对照.诱变完成后计算致死率和正突变率.

1.3.8 复筛实验

将各组正突变菌株利用无菌牙签柱平板影印至以PE（M_w=100 000）为唯一碳源的固体培养基中，28 ℃避光培养7~10 d，测定菌落直径.从各诱变组中分别选取3株生长表现较好的突变株（菌落直径前三），挑取单菌落，于高氏I号固体培养基中28 ℃、避光培养3~5 d.制备菌浓度为10⁸ CFU/mL（即每毫升菌悬液中含约10⁸个可形成菌落的活菌）左右的菌悬液，吸取1 mL接种于以混合PE为唯一碳源的培养基中，置于28 ℃、180 r/min培养15 d后，测定总蛋白含量.同时，每24 h于600 nm波长下测定菌液的光密度（OD₆₀₀），以原始菌株作为空白对照.此外，将菌株接种在以PE（膜片）为唯一碳源的液体培养基中，于28 ℃、180 r/min培养30 d，测定膜片失重率，如式（3）.综合生长表型PE降解性能，对突变菌株进行筛选，获得降解性能最优的诱变菌株.菌落直径前三的优势单菌落.从各诱变组中分别选取3株生长表现较好的突变株.

\mathrm{P}\mathrm{E}\mathrm{失重}\mathrm{率}=\left(\mathrm{1}-\frac{\mathrm{P}\mathrm{E}\mathrm{降解}\mathrm{后质}\mathrm{量}}{\mathrm{P}\mathrm{E}\mathrm{原始}\mathrm{质量}}\right)\times \mathrm{100}\%.（3）

1.3.9 优势菌株降解性能验证

在以PE（膜片）为唯一碳源的液体培养基中培养原始菌株与优势菌株60 d，培养结束后，对膜片的力学性能及表面亲水性进行评价.采用万能材料试验机测定膜片的拉伸强度和断裂伸长率，拉伸速率参照GB/T 1040；同时，采用光学接触角测量仪测定膜片水接触角，水滴体积为20 μL.

1.3.10 数据处理

采用SPSS 17.0进行数据统计分析；采用Origin 2022进行绘图.

2 结果与分析

2.1 不同诱变方式对菌株诱变效果的影响

2.1.1 紫外诱变组

以致死率和正突变率为评价指标，分析了不同诱变方式对Amycolatopsis orientalis ZEL-1的诱变效果.如表1所示，在UV处理中，ZEL-1的致死率随诱变时间的增加而逐渐升高，呈现明显的剂量依赖性致死效应.在UV照射10 ~ 50 s内，正突变率呈上升趋势，并在50 s时达到正突变率最大值17.24%；当UV照射至60 s时，正突变率下降，80 s及以上未获得正突变株.UV辐射70 s条件下，尽管致死率高达97.12%，仍检测到16.67%的正突变株，说明高强度UV仍可能产生有利突变，但不具有稳定性.一般认为，致死率约为90%时诱变较为有效，因此选择50 s作为优选UV诱变时长.

2.1.2 微波诱变组

微波诱变ZEL-1的实验结果见表2.总体来看，随着微波功率和处理时间的增加，菌株致死率呈持续升高趋势.在正突变率方面，不同微波功率梯度下的变化趋势存在明显差异.在微波功率240 W和400 W条件下，菌株正突变率整体较低且波动明显.但在400 W条件下处理90 s和180 s时菌株正突变率相对较高，其中90 s时，正突变率达到7.69%，同时致死率为73.19%，表现出较好的诱变效果.当微波功率提高至640 W时，菌株致死率明显升高，最高达97.93%（微波处理180 s），而正突变率整体偏低，仅在120 s时达到8.00%；而在微波功率为800 W条件下，菌株诱变效果最为显著，在处理90 s和120 s后正突变率显著提高，并在120 s获得最高正突变率为14.29%.

2.1.3 吖啶橙诱变组

AO诱变实验结果（表3）显示，不同剂量AO处理对菌株致死率和正突变率均产生明显影响.总体来看，随着AO诱变剂量的增加，菌株致死率逐渐升高，而正突变率呈现波动变化.在AO质量分数为0.002%和0.004%的条件下，菌株正突变率分别为2.29%和9.90%，诱变效果较为有限.当AO剂量增加至0.005%时，菌株致死率升至57.43%，但正突变率降为0，这可能是由于该剂量下产生的突变类型以不利突变为主.在AO质量分数为0.01%条件下，菌株致死率和正突变率分别提升至71.12%、16.67%，诱变效果明显增强.当AO剂量进一步提高至质量分数为0.02%时，菌株致死率达到88.77%，同时获得最高正突变率19.05%，为本试验最佳诱变条件.然而，当AO质量分数增至0.04%时，菌株致死率达到100%，且未获得任何正突变体，说明AO剂量过高会导致菌株完全失活，不利于突变体筛选.

2.1.4 盐酸羟胺诱变组

盐酸羟胺诱变实验结果见表4.整体来看，随着盐酸羟胺质量分数的升高，菌株致死率逐渐增加，而正突变率呈现先升高后降低的趋势.在盐酸羟胺质量分数为0.6%和0.7%处理条件下，菌株正突变率较高.其中，在盐酸羟胺质量分数为0.6%下，获得的最高正突变率为10.24%，此时致死率为76.94%.该诱变方式在保证一定存活率的前提下可以获得相对较高的菌株正突变率，然而与其他诱变方式相比，正突变率明显较低，诱变效率仍相对有限.

2.1.5 复合诱变组

在单一诱变处理基础上，为进一步提高菌株突变效率，本研究选取前期筛选得到诱变效果较好的条件，即UV辐照50 s与AO质量分数为0.02%处理相结合进行复合诱变，其诱变效果如图1所示.上述复合诱变处理后菌株致死率为91.76%，正突变率为25.71%，明显高于各单一诱变方式.

2.2 正突变菌株的复筛结果

2.2.1 诱变菌株菌落直径分析

为进一步筛选具有较强PE降解潜力的正突变菌株，对不同诱变方式获得的正突变株进行复筛.首先，将突变株接种于以PE为唯一碳源的固体培养基中培养，通过测定菌落直径对其生长能力进行初步评价.结果表明，不同诱变方式获得的突变株在菌落生长能力上存在一定差异.其中，复合诱变组菌株的菌落直径整体最大（8.0～8.8 mm），明显高于其他诱变组菌株，表现出较强的生长优势，说明其可能具有更强的PE利用能力.

2.2.2 诱变菌株生长特性与代谢活性分析

将15株候选突变菌株接种于以PE为唯一碳源的液体培养基中培养，并通过OD₆₀₀值变化比较其生长特性（图2）.UV诱变组（图2（a））和AO诱变组（图2（c））整体生长状况略优于原始菌株，但其对数生长期均出现在培养第5 d，优势并不明显.微波诱变组（图2（b））和盐酸羟胺诱变组（图2（d））菌株的生长趋势与原始菌株基本一致.相比之下，复合诱变组（图2（e））的3株菌在培养第3 d后，即进入对数生长期，表现出更快的生长速度和更强的环境适应能力，表明其可能具有更高的PE降解潜力.总蛋白含量测定结果（图3）显示，培养15 d后原始菌株的总蛋白质量浓度为4.927 μg/mL，而所有诱变菌株的总蛋白含量均高于原始菌株.其中，复合诱变组菌株的总蛋白含量最高，较原始菌株提升了约3.30倍，表明其细胞生长和代谢活性显著增强.

2.2.3 诱变菌株的PE降解性能评价与优势菌株确定

通过PE膜片失重率评价候选突变菌株的实际降解能力（图4）.结果表明，培养30 d后，原始菌株处理组PE膜片失重率为4.07%，除盐酸羟胺诱变组外，其余诱变组菌株处理的PE膜片失重率均高于原始菌株.其中，复合诱变组菌株表现最为突出，30 d后PE膜片最高失重率达到9.77%，与原始菌株相比提高140.05%，并明显高于UV诱变组（6.67%）、微波诱变组（4.32%）和AO诱变组（7.10%）.综合菌株生长表现以及PE膜片降解能力，最终确定UV-AO-1为降解性能最优的正突变菌株，并将其作为后续研究的目标菌株.

2.3 优势菌株UV-AO-1的PE降解性能分析

通过比较原始菌株与最优突变株UV-AO-1作用下PE膜片亲水性及力学性能的变化，对UV-AO-1的PE降解能力进行评价.结果（表5）表明，培养60 d后，UV-AO-1处理组PE膜片水接触角由78.50°降至38.75°，降低39.75°，较原始菌株处理组降低7.50°，说明膜片表面亲水性明显增强.在力学性能方面，UV-AO-1处理组PE膜片拉伸强度由44.68 MPa降至8.18 MPa，降低36.50 MPa，较原始菌株处理组降低3.37 MPa；断裂伸长率由588.78%降至45.77%，降幅达543.01%，较原始菌株处理组减少39.62%.上述结果表明，经过UV-AO-1作用后，PE膜片的力学性能明显下降，材料结构完整性受到显著破坏.综合亲水性及力学性能变化结果可知，优势菌株UV-AO-1对PE膜片结构的破坏作用强于原始菌株，表明其对高分子质量PE具有更强的作用能力，PE降解性能得到明显提升.

3 讨论

近年来，随着PE降解研究的不断深入，PE塑料废弃物的绿色、可持续生物降解技术已受到广泛关注.但是目前多数野生型菌株的PE降解效率仍然较低，难以满足工程化或规模化应用需求^［11］.因此，如何有效提升降解菌的PE降解能力，仍是当前塑料污染治理领域亟需解决的关键问题.尽管当前基于分子生物学的定向改造技术在提升降解菌能力方面已展示出一定潜力，但此类方法对菌株遗传背景与操作技术要求较高，且在环境应用中可能面临基因稳定性和生态安全性等问题.相比之下，诱变育种作为一种成熟、低成本且操作相对简便的策略，是快速提升菌株降解能力的有效途径.已有研究表明，诱变技术可有效筛选获得高效PE降解突变体.例如，经诱变选育获得的白浅灰链霉菌（Streptomyces albogriseolus）AO-UV-9对淀粉填充PE的降解能力较原始菌株提高3.98倍^［20］.另有研究诱变得到的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）XZ-60S对PE-MPs的降解效率提升53.65%^［21］.这些研究结果充分体现了诱变育种在PE降解菌改良中的应用潜力.

在前期研究中，本课题组发现Amycolatopsis orientalis ZEL-1菌株对中低分子质量PE具有较好的降解能力^［19］，但对高分子质量PE的降解能力较为有限.因此，本研究针对这一问题，系统比较了2种物理诱变方式（UV、微波）和2种化学诱变方式（AO、盐酸羟胺）对菌株遗传改良效果的影响.结果表明，在2种物理诱变方式中，UV诱变效果总体上优于微波诱变，尤其是在UV处理50 s和70 s条件下菌株正突变率分别达到17.24%和16.67%；在2种化学诱变方式中，AO的诱变效果优于盐酸羟胺，AO质量分数为0.02%时，菌株获得最高正突变率为19.05%.上述结果表明，不同诱变因子及作用强度对ZEL-1菌株的遗传改良效果存在显著差异，合理筛选诱变方式是获得高效突变体的重要前提.

已有研究指出，在诱变育种过程中，单一诱变往往易产生疲劳效应，而复合诱变则可通过不同诱变因子的协同作用显著提高有益突变的富集效率^［22］.例如，UV-甲基磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate，EMS）复合诱变被用于木质素高效降解菌株的筛选，其选育出的皮特不动杆菌（Acinetobacter pittii）UEM2的木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶活性较原始菌株分别提高58.8%和51.7%，较单独UV诱变菌株分别提高36.4%和35.85%^［23］.利用UV-常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）复合诱变处理埃莎霉素Ⅰ产生菌（Streptomyces spiramyceticus，WSJ-IA），在诱变处理50 s时，菌株正突变率为22.52%和致死率为96.08%^［24］.上述研究结果表明，复合诱变有助于提高正突变株的获得效率，从而有利于筛选获得具有优良性状的突变菌株.因此，本研究在单因素诱变结果基础上，选择UV辐照50 s、AO质量分数为0.02%的条件，构建复合诱变体系，其菌株正突变率达到25.71%，明显高于单一诱变处理，同时对应的致死率为91.76%.在保证较高遗传多样性的同时避免了群体灭绝，为优势突变体的富集与筛选奠定了良好基础.复筛结果显示，复合诱变获得的突变株在以PE为唯一碳源条件下，表现出更强的生长与代谢优势.与原始菌株和单一诱变突变株相比，复合诱变组菌落直径整体较大（8.0～8.8 mm），明显高于其他诱变菌株.此外，复合诱变组菌株更早进入对数生长期，表明其在较高筛选压力下仍具有良好的生长适应性，并可能缩短对PE的适应与利用过程.总蛋白含量能够反映微生物整体代谢活性，在PE为唯一碳源的体系中，总蛋白含量的增加通常与降解关键酶等蛋白质（如烷烃羟化酶、漆酶和锰过氧化物酶）的合成与分泌增强，以及碳源转化效率的提升密切相关^{［19，25-26］}，而复合诱变组突变株的总蛋白含量较原始菌株提升了3.30倍，从代谢表型层面进一步印证了复合诱变突变株可能具有更高的PE降解潜力.

在微生物降解PE的过程中，PE表面会发生显著改性，包括疏水性降低（表现为水接触角的减小）以及拉伸强度和断裂伸长率等力学性能的下降.其中，疏水性的降低可增强降解酶对PE的吸附与催化能力.同时，随着分子链断裂和羟基、羰基等含氧官能团的引入，进一步提高膜片表面的亲水性，从而促进PE的持续降解^［27-29］.例如，已有研究报道，PE膜片在经赖氨酸杆菌（Lysinibacillus）ETX1孵育120 d后，其表面水接触角减小13.6°，亲水性显著增加，更有利于降解菌的附着^［4］.因此，本研究通过测定PE膜片的水接触角、拉伸强度及断裂伸长率等指标，对突变菌株的PE降解效果进行了综合评价.结果发现，筛选得到的最优突变株UV-AO-1的PE降解性能显著增强.UV-AO-1处理后的PE膜片失重率较原始菌株提升约140.05%，明显高于单独UV或AO诱变获得的较优突变株；同时，UV-AO-1处理组PE膜片的水接触角、拉伸强度和断裂伸长率分别降低16.22%、29.18%和46.40%.上述结果从多个层面共同表明，本研究所构建的UV-AO复合诱变策略在提升ZEL-1降解PE能力方面可能具有显著的协同增效作用.从诱变机制上看，UV可通过诱导DNA中嘧啶二聚体的形成引起碱基替换，而吖啶橙可插入相邻碱基间导致移码突变^［30］.二者的联合作用可能在基因组多个位点引发突变，从而对原始菌株的降解代谢网络产生系统性重编程.UV-AO-1降解PE能力的显著提升，可能正是这种多位点、多层次基因组扰动协同作用的结果，其具体分子机制仍有待通过转录组、代谢组等组学手段进一步深入解析.

4 结论

本研究构建了适用于Amycolatopsis orientalis ZEL-1的UV辐照50 s+AO质量分数为0.02%的复合诱变体系，并成功筛选获得一株高效PE降解突变株UV-AO-1.与原始菌株相比，UV-AO-1对PE膜片的失重率提高约140.05%，且其降解性能明显优于单一诱变获得的突变株；同时，经UV-AO-1处理后的PE膜片，水接触角、拉伸强度和断裂伸长率均显著降低.本研究为高效PE降解菌株的诱变选育及其在塑料污染生物治理中的应用提供了实验依据和技术参考.未来研究可在此基础上结合转录组、代谢组等组学手段，深入解析突变株PE降解能力增强的分子机制.

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基金资助

四川省自然科学基金面上项目(2025ZNSFSC0114)