多叶棘豆的叶绿体全基因组

The Complete Chloroplast Genome of Oxytropis myriophylla （Fabaceae）

摘要

多叶棘豆（Oxytropis myriophylla）隶属豆科蝶形花亚科棘豆属，全草可入药，为中等饲用植物。利用Illumina双末端测序平台，对多叶棘豆基因组进行高通量测序，通过组装和注释获得多叶棘豆的叶绿体全基因组信息。结果表明：多叶棘豆的叶绿体基因组总长度为122 252 bp，总GC含量为34.2%，缺失一个IR区域；多叶棘豆叶绿体基因组共编码110个基因，包括76个蛋白质编码基因，30个tRNA基因，4个rRNA基因，其中15个基因含有一个内含子，ycf3基因含有两个内含子。系统发育分析表明棘豆属为单系类群，棘豆属和Coluteoid分支聚为一支并与黄芪属构成姐妹类群。

Abstract

Oxytropis myriophylla belongs to genus Oxytropis DC. from subfamily Papilionoideae of the family Fabaceae， and its whole plant is used as a medicine and a medium grade forage plant. The high throughput sequencing of the complete chloroplast genome of O. myriophylla was conducted by the Illumina paired-end sequencing platform in the paper. The results of assembly and annotation of the genome showed that the total length of the chloroplast genome of O. myriophylla was 122 252 bp， and the total GC content was 34.2%； the genome lacked one IR region and encoded a total of 110 genes， including 76 protein-coding genes， 30 tRNA genes， and four rRNA genes， among which 15 genes contained one intron and the gene ycf3 contained two introns. The phylogenetic analysis revealed that Oxytropis DC. was a monophyletic group， which felled into same clade with Coluteoid and formed sister group with Astragalus L.. However， the phylogenetic position of O. myriophylla within the genus Oxytropis DC. still needs to be further studied.

Graphical abstract

关键词

叶绿体基因组 / 多叶棘豆 / 棘豆属 / 豆科

Key words

chloroplast genome / Oxytropis myriophylla / Oxytropis DC. / Fabaceae Lindl.

棘豆属（Oxytropis DC.）隶属于豆科（FabaceaeLindl.）蝶形花亚科（Papilionoideae DC.）^［1⁃2］。该属植物全世界约有310种，分布于非洲、亚洲、欧洲、北美洲。中国有133种，多分布于新疆维吾尔自治区和内蒙古自治区，也分布于青藏高原和西南横断山脉以及东北、华北等地^［3⁃4］。

多叶棘豆（Oxytropis myriophylla （Pall.） DC.）又名狐尾藻棘豆，为棘豆属中旱生草本植物，常生于砂地、草原、沙地、石质山坡、林缘坡地等地，分布在我国东北、华北以及西北部分地区，在蒙古和俄罗斯也有分布^［4⁃5］。多叶棘豆全草可入药，是著名中药材“鸡翎草”的原植物，具有清热解毒、消肿止血之功效，常用于治疗流感、咽喉肿痛、痈疮肿毒、淤血肿胀、出血等^［6］。在春季或枯萎后，马、牛、羊均采食，是中等饲用植物，也是具有潜力的牧草资源^［7］。目前有关多叶棘豆的研究多集中在化学成分及其生物活性^［8⁃9］、含量测定^{［10⁃11］}、 种子萌发^［12］等方面，尚未见有关多叶棘豆叶绿体基因组的报道。本文报道多叶棘豆的叶绿体基因组，以期为其物种鉴定、系统发育、植物资源的开发利用等提供新的证据和科学参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料

多叶棘豆的新鲜叶片样本采自内蒙古自治区呼和浩特市武川县，采集适量幼嫩叶片放入硅胶中干燥处理后，置于-20 ℃的冰箱保存备用，凭证标本（Li QQ 20220830082）存放在内蒙古师范大学植物标本馆（NMTC）。

1.2 实验方法

1.2.1 总DNA提取、测序和组装

通过CTAB法^［13］提取植物总DNA，利用诺禾致源（Novogene） Illumina NovoSeq双末端测序平台进行建库测序（双末端测序读长150 bp）。测序得到的结果首先使用Trimmomatic^［14］去除接头序列（adapters），然后将过滤后的原始序列（raw Reads）利用NOVOPlasty^［15］软件进行拼接组装，以二色棘豆（Oxytropis bicolor Bunge，Genbank登录号：MN255323）^［16］的rbcL序列作为种子序列，以其完整的叶绿体基因组序列作为参考序列，组装得到多叶棘豆叶绿体基因组。

1.2.2 叶绿体基因组注释和图谱绘制

参考Zhang等^［17］的注释方法，使用GeSeq^［18］、CPGAVAS2^［19］对 多叶棘豆叶绿体基因组序列进行注释，以二色棘豆（MN255323）、Oxytropis arctobia（MT409175）、Oxytropis spelendens（MT409174）作为参考基因组，注释完成后将结果导入Geneious Prime^［20］软件，检查起始密码子、终止密码子以及内含子和外显子等，必要时进行手动矫正，最终获得注释完整的多叶棘豆叶绿体基因组序列。使用在线工具OrganellarGenomeDRAW^［21］绘制多叶棘豆叶绿体基因组环状图谱。

1.2.3 系统发育分析

为探讨棘豆属与其相关属之间的系统发育关系以及多叶棘豆在棘豆属内的系统发生位置，参照Zhao等^［2］的研究，从NCBI数据库下载豆科蝶形花亚科IRLC分支（Inverted repeat-lacking clade）的22个物种的叶绿体基因组序列，以黄花岩黄耆（Hedysarum citrinum Baker f.）、红花山竹子（Corethrodendron multijugum （Maxim.） B.H.Choi et H.Ohashi）、骆驼刺（Alhagi sparsifolia Shap. ex Keller et Shap.）、树锦鸡儿（Caragana arborescens Lam.）、中甸高山豆（Tibetia forrestii （Ali） P.C.Li）、无茎雀儿豆（Chesneya acaulis （Baker） Popov）作为外类群，与本研究获得的多叶棘豆叶绿体基因组序列共同构建系统进化树。参考苏春^［22］矩阵构建的方法，首先在Geneious Prime中提取共有蛋白质编码基因（protein-coding genes，PCGs），进行人工校验，删去长度较短和未提取完整的基因（7个）：accD、atpE、clpP、psbL、rpl23、ycf1、ycf2。使用Geneious Prime将剩余的69个蛋白质编码基因进行串联，接着用MAFFT^［23］对23条序列进行多重比对，最后利用TrimAL^［24］进行适当修剪，除去冗杂序列。基于最大似然法（Maximum likelihood，ML）和贝叶斯法（Bayesian inference，BI）进行系统发育分析，采用RAxML^［25］软件进行最大似然树的构建，核苷酸替代模型为GTRGAMMA，迭代次数为1 000，其余参数默认；基于PartitionFinder2^［26］选择最佳模型GTR+I+G，之后在MrBayes^［27］软件中进行贝叶斯分析，方法参照Guo等^［28］的研究。

2 结果与讨论

在二代高通量测序的基础上，通过生物信息学方法对多叶棘豆的叶绿体基因组进行组装和注释，最终获得多叶棘豆叶绿体基因组环状图谱（图1）。从图1可知，多叶棘豆的叶绿体基因组序列总长度为122 252 bp，总GC含量为34.2%。同大多数蝶形花亚科IRLC分支植物一样^［29］，棘豆属叶绿体基因组只有一个反向重复区域（inverted repeat，IR）。

多叶棘豆叶绿体基因组共编码了110个基因，包括76个蛋白质编码基因（PCGs），30个转运RNA基因（transfer RNA genes，tRNAs），4个 核糖体RNA基因（ribosomal RNA genes，rRNAs），见表1。其中9个 蛋白质编码基因（clpP、ndhA、ndhB、petB、petD、rpl2、rpl16、rpoC1、rps12）、6个tRNA基因（trnA-UGC、trnG-UCC、trnI-GAU、trnK-UUU、trnL-UAA、trnV-UAC）中各含有1个内含子，而ycf3基因含有2个内含子。多叶棘豆叶绿体基因组存在rps12反式剪接基因，其剪接方式与前人研究相似^{［29⁃30］}。通常多数被子植物叶绿体基因组中包含rps16、infA和rpl22基因^{［31⁃32］}，而在多叶棘豆的叶绿体基因组中发现这三个基因都已丢失。在多叶棘豆的叶绿体基因组中发现rps12和clpP基因内含子丢失的现象，这一现象在鹰嘴豆（Cicer arietinum）等蝶形花亚科IRLC分支植物中很常见^［33］。除此之外，atpF内含子在多叶棘豆中也已丢失，在同属植物二色棘豆中也发现了这种情况^［16］。

基于最大似然法和贝叶斯法构建的ML树和BI树如图2所示，其拓扑结构基本一致。系统发育树显示：共有四个大的分支，棘豆属物种和黄芪属（Astragalus L.）物种各聚为一支，Coluteoid分支（Lessertia DC.、Sphaerophysa DC.、Carmichaelia R.Br.、Phyllolobium Fisch.）的物种聚为一支，外类群聚为一支，且后验概率都为1，自展率都达到100%。研究发现，棘豆属为单系类群，棘豆属和Coluteoid分支聚为一支并与黄芪属构成姐妹类群，这一结果与前人研究一致^［22］。多叶棘豆和刺叶柄棘豆（Oxytropis aciphylla Ledeb.）聚为一小支，在BI树中后验概率为0.57，在ML树中自展值只有32%，对于多叶棘豆在棘豆属内的系统发生位置问题还有待进一步研究，本研究仅涉及棘豆属8个物种，后续研究中还需增加棘豆属物种数量，以期厘清棘豆属植物系统发生关系。

3 小结

本研究报道了多叶棘豆的叶绿体全基因组序列，解析了其结构、序列长度、GC含量、基因内容等基本特征，并基于叶绿体基因组序列构建了系统发育树，为将来棘豆属物种鉴定、资源开发利用、系统发育等研究奠定了基础。

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基金资助

内蒙古师范大学基本科研业务费专项基金资助项目“内蒙古豆科牧草种质资源的DNA条形码研究及数据库建立”(2022JBBJ012)

“内蒙古自治区高等学校蒙古高原生物多样性保护与可持续利用重点实验室建设”(2022JBTD010)