构建转天冬酰胺酶基因菌株及其固体发酵产酶培养基优化

Construction of Trichoderma reesei Transasparaginase Strain and Optimization of Solid Fermentation Medium

摘要

构建一株转L-天冬酰胺酶基因的里氏木霉重组菌株，并采用固体发酵的方法研究其发酵产酶。首先以贝莱斯芽孢杆菌质粒为骨架重组天冬酰胺酶基因，验证其天冬酰胺酶的表达；随后探讨不同培养基配方（配方1和配方2）发酵产酶效果，通过单因素和正交试验优化其优势产酶培养基。结果表明：构建的里氏木霉可以正确表达天冬酰胺酶；在固体培养基配方1和配方2中，重组的里氏木霉菌株发酵产天冬酰胺酶分别为4.52 U/g和2.21 U/g，配方1产酶量远高于配方2。因此，以配方1作为优选配方，通过单因素及正交试验对其进一步优化。配方1中，当麦麸与玉米芯的比例为3∶1、初始含水量为1∶4.4、初始pH值为5.5时，该里氏木霉转L⁃天冬酰胺酶基因重组菌株发酵产酶活力为5.965 U/g，与原配方相比，优化后的固体培养基发酵产酶活力提高了24.22%。

Abstract

A recombinant strain of Trichoderma reesei with L-asparaginase gene was constructed and its fermentation for enzyme production was studied by solid fermentation method. Firstly， the expression of asparaginase gene was verified by recombinant plasmid of Bacillus Velez. Then， the effect of enzyme production through fermentation by different medium formulations （formula 1 and formula 2） was investigated. The dominant enzyme producing medium was optimized through single factor and orthogonal test. The results showed that the constructed Trichoderma Reesei expressed asparaginase correctly. In solid medium formula 1 and formula 2， the asparaginase production of the recombinant Trichoderma Reesei strains was 4.52 U/g and 2.21 U/g， respectively， indicating that the enzyme production by formula 1 was much higher than that by formula 2. Therefore， formula 1 was selected as the candidate formula， which was further optimized by single factor and orthogonal test. For formula 1， when the ratio of wheat bran to corn cob was 3∶1， the initial water content was 1∶4.4， and the initial pH was 5.5， the enzyme production activity of the L-asparaginase recombinant strain was 5.965 U/g， which was increased by 24.22% compared with the original formula.

Graphical abstract

关键词

L-天冬酰胺酶 / 里氏木霉 / 正交试验优化 / 固体培养

Key words

L-asparaginase / Trichoderma reesei / optimization of orthogonal test / solid medium

L-天冬酰胺酶（L-asparaginase）可催化L-天冬酰胺水解产生L-天冬氨酸和氨，在医疗及食品工业中有多种用途。临床上将其作为一种化疗药物，在治疗儿童急性淋巴细胞白血病方面有显著的疗效^［1］。在食品加工中，L-天冬酰胺酶可降低高温时产生的致癌物质丙烯酰胺含量，既不影响食品的风味和观感，又保证了高温油炸食品的安全性^［2⁃3］。L-天冬酰胺酶存在于动物、植物和微生物中，根据来源不同，L-天冬酰胺酶可分为Ⅰ型和Ⅱ型^［4］。其在动植物体中含量极少，直接提取方法复杂且难以保证生物活性。利用微生物发酵生产L-天冬酰胺酶，操作简便，产酶率高，是天冬酰胺酶大规模工业化生产以满足应用需求的重要生产方式。

里氏木霉（Trichoderma reesei）是一种丝状真菌，该菌株作为模式菌株，逐步应用于各种蛋白质产品的工业化生产中^［5］。里氏木霉具有极强的合成和分泌蛋白质的能力，且培养条件简单，易于基因改造。通过基因重组技术，构建里氏木霉重组菌株，用于异源蛋白表达及工业化生产，拓宽了里氏木霉的应用范围。以里氏木霉作为表达系统已成功表达了漆酶、甘精胰岛素、人源α-半乳糖苷酶等多种蛋白质产品^［6⁃8］。本研究以里氏木霉TU6为出发菌株，转入黑曲霉来源的L-天冬酰胺酶基因，构建产酶重组菌株。

固体发酵以廉价的农林废弃物，如麦麸、稻草粉等作为培养基质，是霉菌类微生物发酵产酶的适用方法^［9］。本研究以构建成功的转L-天冬酰胺酶基因的里氏木霉重组菌作为产酶菌株，选择初始pH值、初始含水量以及培养基中麦麸和玉米芯的比例作为探究因素，通过单因素试验及正交试验，对以农林废弃物为主要成分的固体培养基进行优化，以期提高里氏木霉转L-天冬酰胺酶基因重组菌株的产酶效率，为其用于工业化生产，提供一定的研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大肠杆菌Escherichia coli strain Trans1-T1（购自北京全式金生物技术有限公司）用作重组质粒的构建。里氏木霉TU-6菌株为尿嘧啶缺陷型菌株（本实验室保存），作为L-天冬酰胺酶的重组表达宿主。以质粒pEASY-blunt T simple（购自北京全式金生物技术有限公司）为骨架构建天冬酰胺酶表达质粒。

PDA培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂粉20 g/L，自然pH。里氏木霉发酵的基础培养基（MM培养基）：硫酸铵5 g/L，磷酸二氢钾15 g/L，硫酸镁0.6 g/L，氯化钙0.6 g/L，七水合硫酸亚铁0.005 g/L， 一水合硫酸锰0.001 6 g/L，七水合硫酸锌0.001 4 g/L，氯化钴0.002 g/L，pH=5.3。LB培养基：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L氯化钠。

1.2 试验方法

1.2.1 黑曲霉来源天冬酰胺酶基因表达载体的构建

黑曲霉来源天冬酰胺酶基因全长1 221 bp，包含两个内含子和6个His标签，可表达367个氨基酸。本研究选用了里氏木霉cbh1启动子信号肽基因以及cbh2基因的终止子构建表达元件。利用已制备的包含pyr4筛选基因、cbh1启动子信号肽基因和cbh2终止子序列的pEASY-blunt T simple质粒为模板，以pEASY-F、pEASY-R为引物，PCR扩增载体片段。以黑曲霉基因组为模板，以包9+含21 bp overlap（表1中下画线标出的序列）的ASN-F、ASN-R为引物，PCR扩增黑曲霉来源的天冬酰胺酶基因片段。利用上述黑曲霉天冬酰胺酶基因片段两端与载体片段之间21 bp的overlap，使用无缝拼接试剂盒将天冬酰胺酶基因片段与载体骨架进行连接，完成黑曲霉来源的天冬酰胺酶基因表达载体的构建。

1.2.2 表达载体的里氏木霉转化

制备原生质体^［10］将10 μg pEASY-ASN质粒加入原生质体溶液中；混匀加入50% PEG 4000缓冲液，混匀后冰上保温，重新混匀后，加入50% PEG 4000缓冲液，再混匀；加入山梨醇溶液，混匀后与融化的软洋菜培养基混合，铺于转化底层培养基平板，30 ℃培养96~168 h。

1.2.3 转化子的筛选和鉴定

利用UniversAll组织DNA萃取缓冲液粗提转化子的基因组， 挑取少量菌丝于萃取缓冲液内，涡旋后95~98 ℃加热10 min；再次涡旋后离心；-20 ℃保存备用。

以粗提体系中的上清为模板，以F-identify、R-identify为引物，通过PCR鉴定天冬酰胺酶基因的表达盒是否成功整合到基因组上。

将阳性转化子与阴性菌株TU-6的孢子分别接种至含有2%葡萄糖的MM培养基中，28 ℃、400 r/min预培养36 h后转接至含有1%微晶纤维素的MM培养基中进行诱导发酵，培养120~144 h后SDS-PAGE分析蛋白表达情况。

1.2.4 转L-天冬酰胺酶基因菌株发酵产酶初始固体培养基的筛选

初始固体培养基配方1为3 g稻草粉，1 g麦麸，1 g玉米芯，0.1 g乳糖，0.015 g磷酸二氢钾，22 mL水，调节pH值至4.5左右。

初始固体培养基配方2为3.5 g麸皮，1.5 g稻草粉，0.05 g硫酸铵，0.005 g磷酸二氢钾，0.005 g氯化钙，12.5 mL水，自然pH。

稀释后测定其OD₇₀₀，计算孢子悬液的浓度^［11］，再分别接种至培养基配方1和配方2中，于30 ℃恒温培养168 h。发酵结束后，加入去离子水，37 ℃振摇并离心，上清即为酶液，用Nessler试剂测定酶活。

1.2.5 L-天冬酰胺酶的酶活力测定

以Nessler试剂法检测天冬酰胺酶活力^［12］，L-天冬酰胺酶活力定义为：在37 ℃和pH=5.4的条件下，1 min内分解L-天冬酰胺产生1.0 μmol氨所需的酶量为1 U^［13］。发酵浸出液的L-天冬酰胺酶的酶活力与固体培养基干料质量之比为每克固体发酵培养基对应的L-天冬酰胺酶酶活。

1.2.6 转L-天冬酰胺酶基因菌株固体发酵产酶培养基的优化

优化包括单因素试验和正交试验。

（1）单因素试验

以筛选的优势培养基为基础，在其他条件恒定的情况下，分别改变培养基初始pH值（pH=4，4.5，5，5.5，6）、初始含水量（2.4 mL/g，3.4 mL/g，4.4 mL/g，5.4 mL/g，6.4 mL/g）以及培养基成分中麦麸与玉米芯的比例（全玉米芯，1∶3，1∶1，3∶1，全麦麸），每组3次重复试验，对里氏木霉转L-天冬酰胺酶基因菌株进行发酵产酶试验，以每克固体发酵培养基对应的L-天冬酰胺酶酶活为指标对培养基配方中的各因素进行评价，以探究此3种单因素对菌株产酶能力的影响。

（2）正交试验

根据单因素试验结果，确定以上3个单因素中最优的3个水平，并分别取最优水平上下1个水平作为探究指标，并按L₉（3³）的正交试验表，每组做3次重复进行试验，分析试验结果，获得里氏木霉发酵产 L-天冬酰胺酶的优化条件。正交试验方案见表2。

1.2.7 数据分析

单因素试验数据使用Excel整理，IBM SPSS Statistics 26分析，图表使用Excel制作。

2 结果分析

2.1 重组菌株转化子的筛选和鉴定

挑取8个转化子（分别命名为：ASN-1-8）粗提基因组，PCR鉴定天冬酰胺酶基因的表达框（图1），PCR产物进行测序分析。测序结果显示ASN-1-8的表达框与参考序列完全相同。

以出发菌株TU6为阴性对照，将以上转化子经摇瓶发酵后，发酵结果通过SDS-PAGE进行分析，结果如图2所示，8株转化子均有目的蛋白表达。对目的条带进行灰度分析见图3。由图3可知，编号为ASN-2的重组菌株目的条带平均强度最高，表明其表达L-天冬酰胺酶产量较高，故后续试验选择ASN-2重组菌株为产酶菌株，对其进行固体发酵产酶培养基的优化试验。

2.2 重组菌株初始发酵产酶固体培养基的筛选

将上述转化成功的菌株活化后分别接种至两种固体培养基中，结果如图4所示，重组菌株发酵产酶活力较高的是初始培养基配方1，达4.52 U/g，约为配方2的2倍。

该结果说明配方1更适于里氏木霉转L-天冬酰胺酶基因重组菌株的发酵产酶。配方1中的玉米芯可能含有可促进菌株细胞生长的因子，乳糖通常是里氏木霉基因表达系统的诱导因子之一。而配方2中，可能菌株不能很好地吸收和利用硫酸铵这种无机氮源，故其对菌株的生长和产酶都产生了不利的影响。后续将以初始培养基配方1为优势培养基，对其进行进一步的优化。

2.3 转L-天冬酰胺酶基因菌株固体发酵优势培养基单因素试验

2.3.1 麦麸与玉米芯的比例对重组菌株发酵产酶的影响

如图5所示，改变培养基中麦麸与玉米芯的比例，对菌株发酵产酶有影响。当麸芯比为1∶1时菌株发酵产酶的活力最高，达到1.312 U/g。

试验中固体培养基主要成分是麦麸与玉米芯，麦麸中有较丰富的蛋白质含量，可为菌株合成L-天冬酰胺酶提供原料。而在玉米芯中，可能含有可促进菌株细胞生长的因子，且其中的纤维素含量较高，纤维素也是木霉菌株基因表达系统的诱导因子之一，可诱导L-天冬酰胺酶基因表达，提高酶产量。因此，培养基中的麦麸和玉米芯，需要一个合适的比例，才能使菌株的产酶能力达到最大。

2.3.2 初始含水量对重组菌株发酵产酶的影响

如图6所示，当含水量为5.4 mL/g时，菌株发酵产酶的酶活力最高，达到1.759 U/g。

适宜的含水量有利于产酶菌株的生长和发酵产酶，但含水量过高时，会减少菌株对氧气的摄取，从而导致菌株生长和产酶均受到抑制。

2.3.3 初始pH值对转L-天冬酰胺酶基因菌株发酵产酶的影响

如图7所示，培养基初始pH值为5.5时，菌株发酵产酶的酶活力最高，为1.912 U/g。

pH主要通过影响生物体内的各种酶的活性影响其相应的生理过程，菌株的生长和产酶，都受pH影响。5.5是试验菌株发酵产L-天冬酰胺酶的适宜的pH值，而在其他pH条件下，菌株的发酵产酶能力都有所下降。

2.4 转L-天冬酰胺酶基因菌株固体发酵优势培养基正交试验优化

正交试验因素及水平设计方案如表3所示，由正交试验结果及其分析（表4-6）可知，3个因素对菌株发酵产酶的影响程度为：B>C>A，即初始pH值>初始含水量>麦麸和玉米芯的比例，优化后的培养条件为A₃B₃C₂，即麦麸与玉米芯的比例为3∶1、初始含水量为6.4 mL/g、初始pH值为5.5。在此优化条件下，进行菌株发酵产酶试验，产酶达5.965 U/g，高于正交试验中所有试验组的产酶结果，由此验证了该优化培养条件。该优化条件下的发酵产酶活力，也较初始培养基配方的发酵产酶高出24.22%。

3 讨论与结论

L-天冬酰胺在生物细胞生长和生命活动中有着重要的作用。在儿童急性粒细胞白血病中，由于肿瘤细胞合成天冬酰胺量不足，需要获得外源的天冬酰胺以满足其需求^［14］。L-天冬酰胺酶水解破坏了天冬酰胺，使肿瘤细胞因摄取天冬酰胺不足而被抑制，故天冬酰胺酶可作为化疗药物，在临床上有着显著的疗效，并在淋巴系统恶性肿瘤疾病治疗中大量使用。

虽然天冬酰胺酶疗效值得肯定，但是使用中仍有过敏反应明显、易产生抗药性等问题。因此，探索新来源的天冬酰胺酶，或设计新的酶蛋白分子结构，降低其免疫原性并增强其抗蛋白酶水解的能力是提高天冬酰胺酶应用价值的重要思路^［15］。本实验参考已有的重组里氏木霉及其构建方法^{［16⁃17］}，以尿嘧啶营养缺陷型标记基因pyr4为选择标记，将黑曲霉来源的L-天冬酰胺酶基因重组整合到里氏木霉菌株中。丝状真菌 里氏木霉是工业生产上常用的菌种，在同类真菌中具有安全性高、成本低、产物合成效率高等特点^［18］。近年来，利用里氏木霉表达系统合成的酶和蛋白质类生物产品很多，包括高产纤维素酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶等^{［19⁃21］}，将优选的天冬酰胺酶基因转到里氏木霉中并表达，也是获得新来源天冬酰胺酶的有效方法。在本研究中，成功构建了转黑曲霉来源天冬酰胺酶基因的里氏木霉菌株，并正确表达了具有酶活力的L-天冬酰胺酶，随后以此菌株作为出发菌株，利用农林废弃物作为培养基质，对其进行固体发酵产酶研究。在获得较优的基础培养基配方的基础上，经单因素试验和正交试验，进一步优化了该菌株发酵产酶的固体培养基。麦麸与玉米芯比例单因素试验中当麸芯比为1∶1时菌株发酵产酶的活力显著高于其他组别，达到1.312 U/g。说明在含水量4.4 mL/g、初始pH值为4.5的情况下，麦麸与玉米芯中的蛋白质、纤维素和生长因子的比例最佳。在含水量单因素试验中，固定了麦麸与玉米芯的比例为1∶1，初始pH值为4.5，结果显示固体培养基中含水量为5.4 mL/g的条件下产酶酶活显著高于其他组，分析其原因是真菌生长需要环境中有一定量的水，过少会抑制其正常生命活动而降低L⁃天冬酰胺酶产量，过多则会降低其氧气摄取，导致其菌体生长减缓，同样会降低酶产量。在探究初始pH值对产酶活力影响的试验中，初始pH值为5.5是最优的水平，显著高于其他4组试验组，说明在里氏木霉的发酵的过程中需要适宜的pH条件，过酸或过碱都会导致其产酶水平降低，导致酶活降低。正交试验结果表明在三种因素中对发酵产酶影响最大的是固体培养基的初始pH值，其次是含水量，最后是麦麸与玉米芯的比例。在不同因子水平组合中发现产量较高的组合一般出现于pH=5.5上下，在后续的验证试验中也得到了相似的结果。综上，在成功正确表达L-天冬酰胺酶的里氏木霉重组菌株的发酵试验中当培养基中麦麸和玉米芯比为3∶1、含水量为6.4 mL/g、初始pH值为5.5时，里氏木霉转天冬酰胺酶基因菌株发酵产酶的酶活力最高，达5.965 U/g，与原基础培养基配方相比，在优化后的培养基中，里氏木霉转天冬酰胺酶基因菌株发酵产酶的酶活力提高了24.22%。

本试验构建的转黑曲霉来源L⁃天冬酰胺酶基因的里氏木霉菌株安全性高，对发酵环境适应性强。利用农林废弃物作为其固体发酵培养基的主要基质，既环保，也极大降低了生产成本。优化后的培养基，一定程度上提高了产酶效率，为里氏木霉转天冬酰胺酶基因菌株在L-天冬酰胺酶工业化生产中的应用提供研究基础。

参考文献

[1] BATOOL T， MAKKY E A， JALAL M， et al. A comprehensive review on L-asparaginase and its applications［J］. Applied Biochemistry and Biotechnology， 2016， 178（5）： 900-923.

[2] 王鑫月，李洪军，李少博，等. 利用微生物及其产生的酶控制食品中丙烯酰胺的形成［J］. 食品与发酵工业， 2017， 43（7）： 265-270.

[3] LIU C， LUO L J， LIN Q L. Antitumor activity and ability to prevent acrylamide formation in fried foods of asparaginase from soybean root nodules［J］. Journal of Food Biochemistry， 2019， 43（3）：e12756.

[4] 曾杰. 优质L-天冬酰胺酶的开发与应用及重组表达研究进展［J］. 中国生物工程杂志， 2017， 37（11）： 123-131.

[5] MANDELS M， REESE E T. Induction of cellulase in Trichoderma viride as influenced by carbon sources and metals［J］. Journal of Bacteriology， 1957， 73（2）： 269-278.

[6] 李喜海. 丝状真菌里氏木霉异源表达Insulin Glargine的初步研究［D］. 济南：山东大学， 2021.

[7] 周哲浩. 重组里氏木霉固态发酵产漆酶及其在有机污染物治理中的应用［D］. 杭州：浙江大学， 2019.

[8] 邓木兰. 里氏木霉表达载体的构建及人源α-半乳糖苷酶的表达研究［D］.广州：广东工业大学，2020.

[9] 李立波. 固态发酵中不同微生物对玉米秸秆降解及腐殖质形成的影响［D］. 长春：吉林农业大学， 2017.

[10] 刘杜娟. 低纤维素酶背景里氏木霉表达宿主菌的构建［D］. 北京：中国农业科学院，2020.

[11] SCHÜTZ G， HALTRICH D， ATANASOVA L. Influence of spore morphology on spectrophotometric quantification of Trichoderma inocula ［J］. Biotechniques， 2020， 68（5）： 279-282.

[12] LONG S Q， ZHANG X， RAO Z M， et al. Amino acid residues adjacent to the catalytic cavity of tetramer L-asparaginase Ⅱ contribute significantly to its catalytic efficiency and thermostability［J］. Enzyme and Microbial Technology， 2016， 82：15-22.

[13] MUNEER F， SIDDIQUE M H， AZEEM F， et al. Microbial L-asparaginase： Purification， characterization and applications［J］. Archives of Microbiology， 2020， 202（5）： 967-981.

[14] UENO T， OHTAWA K， MITSUI K， et al. Cell cycle arrest and apoptosis of leukemia cells induced by L-asparaginase［J］. Leukemia， 1997， 11（11）： 1858-1861.

[15] OFFMAN M N， KROL M， PATEL N， et al. Rational engineering of L-asparaginase reveals importance of dual activity for cancer cell toxicity［J］. Blood， 2011， 117（5）： 1614-1621.

[16] 张岩峰，陈永丽，潘朝智.一种生产天冬酰胺酶重组里氏木霉的制备方法：CN116875619A［P］. 2023-10-13.

[17] 王玮，魏东，芝陈雨，等.一种用于生产天冬酰胺酶的重组里氏木霉及其构建方法和应用：CN113388532A［P］. 2021-09-14.

[18] SCHMOLL M. Trichoderma reesei［J］. Trends in Microbiology， 2022， 30（4）： 403-404.

[19] ZHENG F L， YANG R F， CAO Y L， et al. Engineering Trichoderma reesei for hyperproduction of cellulases on glucose to efficiently saccharify pretreated corncobs［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2020， 68（45）： 12671-12682.

[20] PANG A P， WANG H Y， LUO Y S， et al. Dissecting cellular function and distribution of β-glucosidases in Trichoderma reesei ［J］. mBio， 2021， 12（3）：e03671-20.

[21] ZOU G， JIANG Y， LIU R， et al. The putative beta-glucosidase BGL3I regulates cellulase induction in Trichoderma reesei ［J］. Biotechnology for Biofuels， 2018， 11：314.

基金资助

西南民族大学研究生创新型科研资助项目“里氏木霉转L-天冬酰胺酶基因重组菌株的构建及其固体发酵产酶培养基的优化研究”(ZD2022878)