基于高通量测序技术对馆藏明代古尸体表真菌群落的研究

Study of Fungal Community on the Surface of Ancient Corpses in the Ming Dynasty Based on High-throughput Sequencing Techniques

摘要

基于Illumina MiSeq测序技术分析了常州博物馆馆藏出土的一具明代古尸体表霉斑、霉点处的真菌群落结构与多样性。结果显示，古尸体表共计检出2个门，8个纲，9个目，10个科，10个属，以及49个扩增子序列变异体（ASV）。该古尸体表霉变处的优势类群为曲霉属，相对丰度为89.79%~99.88%，其中隶属于曲霉属的ASV1为霉变点位处的优势物种，相对丰度为55.78%~90.98%，初步鉴定是一种超越耐旱极限的帚状曲霉，在古尸体表霉斑、霉点处占绝对优势，可能是造成霉变的主要微生物。鉴定古尸在保存过程中产生的霉腐微生物，有助于提高霉变防治的针对性，为古尸的长久保存提供参考和依据。

Abstract

Based on Illumina MiSeq sequencing technology， this study explored the fungal community structure and diversity in mildew spots on the surface of an ancient corpse of the Ming Dynasty which is preserved in Changzhou Museum. A total of 2 phyla， 8 classes， 9 orders， 10 families， 10 genera， and 49 amplicon sequence variants （ASVs） were detected. Aspergillus is the predominant group with a relative abundance of 89.79%-99.88%. ASV1， which belongs to Aspergillus， is the dominant species in the mildew spots with a relative abundance of 55.78%-90.98%. It is preliminarily identified as Aspergillus penicillioides that exceeds the drought tolerance limit， exhibiting absolute dominance in the mildew spots on the surface of the ancient corpse， which may be the main microorganism causing mildew. Identification of microorganisms causing mildew and rot which are produced during the preservation of ancient corpses is helpful to improve the pertinence of mildew prevention and provide reference and a basis for their long-term preservation.

Graphical abstract

关键词

古尸 / 霉变 / 真菌 / 曲霉属 / 高通量测序

Key words

ancient corpse / mildew / fungus / Aspergillus / high-throughput sequencing

古尸是稀有的人类物质文化财富，是珍贵的可供研究实物标本，对当地文化历史的研究和展示具有重要意义。对于古尸的研究，主要在考古学、历史学、体质人类学、古病理学以及解剖生理学等方面，通过医学结合多学科的综合研究，揭示古尸保存不腐的原因和机理^［1⁃2］。古尸能够在地下完整保存百年乃至上千年之久，主要原因是古尸所处的特殊环境。结合墓地环境考察的研究发现，深埋、密封、低温以及优质的制棺木材，是古尸能够保存不腐的基本条件和关键因素^［3］。至宋、元、明时期，墓以灰隔为主体，形成高度密封的墓室环境，同时辅助木炭、石灰、草木灰、云母、细砂等作为干燥剂，加之各种渗透性、挥发性比较好的樟脑、檀香、乳香、没药、丁香等香料，使得部分古尸在下葬之初，就已具有灭菌防腐的效果^［4］。

古尸是有机质类文物，环境中的微生物会在古尸体表附着、生长和繁殖，进而形成菌斑影响其原本的外观。此外，微生物生长过程中的代谢活动造成古尸一定程度上的腐烂，从而影响古尸的长期保存。造成古尸霉腐的微生物主要有真菌（以酵母菌和霉菌为代表）和细菌^［5］。其中，霉菌大量存在于土壤中，可利用古尸组织的纤维素和木质素作为碳源和能源。古尸的埋葬环境、土壤性质的差异会造成古尸体表霉腐的微生物类群差异较大。因此了解古尸体表腐烂、霉变处的主要微生物类群，可提高霉变防治的针对性，为后续的“对症下药”提供靶标和依据。

随着微生物学的不断发展，微观生命科学研究领域的不断成熟，文物保护学科也需要借助前沿科技，跨学科、跨领域尝试新的研究^［6］。高通量测序技术（High⁃throughput sequencing）相比之前的室内培养、指纹图谱技术及第一代测序技术具有明显的优势，如测序速度快、通量大，可获得更多的物种分类信息以及功能基因数据。因此，利用高通量测序技术可高分辨率地解析古尸体表的特征微生物类群，为古尸的长期保存提供参考。

1 材料与方法

常州博物馆现藏明代男尸，2004年出土于常州市广成路明墓，出土墓志可确定墓主为常州人，明代登州同治毕宗贤^［7］。该古尸出土时均呈湿尸态，且保存良好，皮肤有弹性，部分关节依旧可转动。尸体解剖后用福尔马林溶液做防腐处理并进行干燥，现呈鞣尸状态。尸身前胸与颈部有黄色菌斑，腹部出现裂纹。本研究拟通过对古尸体表的霉斑、霉点采样，基于微生物分子生态学技术，扩增ITS1基因并测序，以期探究以下内容：（1）鉴定古尸体表真菌群落的多样性、组成与结构；（2）分析霉斑、霉点处真菌群落与保存完好部分的群落异同特征。

1.1 样品采集与保存

根据古尸目前的保存状况，于尸颈部黄色斑块（M1）、腹部开裂（M2）和膝盖黑色斑块（M3）处分别采集1份样本，另取尸体表面保存完好部分采集一份样本作为对照（M0），见图1。用消杀后的镊子采集0.2 g的样品于50 mL无菌离心管中，置-80 ℃冰箱中保存。

1.2 DNA提取和高通量测序

使用DNeasyPowerSoil Kit DNA提取试剂盒（Qiagen，47014）从0.2 g样品中提取DNA。用Nanodrop2000检测基因组DNA 质量、浓度、纯度。测定合格的样品在-80 ℃下储存。

采用ITS（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2（5′-TGCGTTCTTCATCGATGC-3′）对真菌的ITS1区进行扩增。利用琼脂糖凝胶电泳法检测扩增产物的单一性和特异性，使用Agencourt AMpure XP核酸纯化磁珠进行产物纯化。利用Illumina MiSeq测序平台进行高通量测序。

首先，基因组DNA质量检测。高质量完整度好的基因组DNA是文库扩增和构建的前提。第二，对样本进行目的区域检测扩增。对于合格的样本检测区域进行高保真PCR扩增，设置3个重复实验，同时以标准的真菌基因组DNA Mix作为阳性对照。第三，对各个样本添加特异性标签序列。利用带有Index序列的引物，通过高保真PCR向文库末端引入特异性标签序列，使得下游上机测序时可以对多个样本进行混合，后续生物信息学处理能够区别带有不同标签序列的样本。扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测后，应用核酸纯化磁珠对扩增产物进行纯化，得到一个样本的原始文库。第四，文库定量及混合。根据琼脂糖凝胶电泳的初步定量结果，对已经带有各自Index标签的样本文库浓度进行适当稀释后，利用Qubit对文库进行精确定量。根据不同样本的测序通量要求，按相应比例（摩尔比）混合样本。第五，文库质量检测。混样后的文库通过Agilent 2100 Bioanalyzer检测测序文库插入片段的大小，确认在120~200 bp之间无非特异性扩增，并准确定量测序文库浓度。最后，Illumina上机测序。采用双端测序策略对文库进行测序，后续进行生物信息学分析。

数据下机后，从中拆分出各样本数据，通过使用FLASH^［8］对每个截去Barcode 和引物序列的样本reads进行拼接，得到原始Tags 数据；利用Qiime 1.9.1软件^［9］对Tags进行质控，使用物种注释数据库对Tags序列^［10］进行比对检测，并去除其中的嵌合体序列，得到有效数据。利用Uparse 7.0.1001软件^［11］将所有序列以97%的一致性聚类成为扩增子序列变异体（ASV），用Mothur方法与SILVA132^［12］的SSUrRNA数据库^［13］，分析ASV中出现频数最高的代表序列从门到属进行物种注释（设定阈值为0.81）。

1.3 统计分析

使用R软件（Version2.15.3）计算真菌群落的α多样性，包括物种丰富度和香农（Shannon）指数；使用Origin 2020软件进行柱状图绘制。使用R软件中的Venn Diagram包和pheatmap包，分别绘制韦恩图和热图来探究样本间物种组成的差异性。

2 结果分析

2.1 古尸体表真菌群落α多样性

群落中物种多样性代表了物种数量的多少，它是群落规模的重要体现^［12］。通过分析体表真菌群落的物种丰富度指数以及香农多样性指数评估古尸体表的真菌多样性。物种丰富度指数为群落中丰度大于0的物种数之和，其值越大表明群落中物种种类越丰富。香农多样性指数是用来估算样品中微生物多样性的指数之一，其值越大，表明真菌群落多样性越高^［13］。

由图2（a）可见，古尸体表大腿皮肤完好处（M0）、颈部黄斑处（M1）、腹部开裂处（M2）和膝盖黑斑处（M3）分别检测到分类单元扩增子序列变异（ASV）数目，即物种丰富度，分别为20、12、17和25。与空气、土壤等环境样本相比^{［14⁃15］}，古尸体表的物种丰富度较低。其中，M3处的真菌丰富度指数大于皮肤完好处（M0），M1和M2处的真菌丰富度指数低于对照区域（M0）。古尸体表4个采样点位ASV数目以及共有ASV数目如图2（b）所示。4个采样点位共有的ASV数仅有4个（8%），而M0、M1、M2和M4特有的真菌ASV总数分别有11个（22%）、2个（4%）、6个（12%）和16个（32%）。并且M3特征区域单独含有的ASV数目最多，群落组成较为丰富。

通过计算古尸体表的香农指数，3处特征区域真菌群落多样性均小于对照区域，其中M0（1.36）>M1（1.15）>M3（1.07）>M2（0.44）（如图3所示），说明腐坏区的生态位被优势类群占据，降低了其多样性。

2.2 古尸体表真菌门、纲、目、科水平上的群落组成

古尸体表4处采样点真菌门水平（Phylum）上共检出2个门，分别为子囊菌门和担子菌门（如图4所示）。体表主要类群为子囊菌门，在M0（大腿皮肤完好）、M1（颈部黄斑）、M2（腹部开裂）以及M3（膝盖黑斑）点位的占比分别为95.92%、99.99%、99.91%以及98.92%。此外，M0处担子菌门占比为3.95%。

在纲水平（Class）上，古尸体表4处采样点共检出8个纲。M1（颈部黄斑）、M2（腹部开裂）和M3（膝盖黑斑）处隶属于子囊菌门的散囊菌纲（Eurotiomycetes）处于绝对优势地位，其占比为99.99%、99.88%和98.75%（如图5所示）。而在M0（大腿皮肤完好）处，除了占比约86.61%的散囊菌纲（Eurotiomycetes）外，还有锤舌菌纲（Leotiomycetes）和微球黑粉菌纲（Microbotryomycetes），占比分别为9.06%和3.95%。

在目水平（Order）上，古尸体表4处采样点共检出8个目。M1（颈部黄斑）、M2（腹部开裂）和M3（膝盖黑斑）处散囊菌目（Eurotiales）处于绝对优势地位，而在M0（大腿皮肤完好）处，除了占比约86.61%的散囊菌目（Eurotiales）外，还有蝾螈目（Thelebolales）和锁掷酵母目（Sporidiobolales），占比为9.06%和3.95%（如图6所示）。

古尸体表4处采样位置的优势菌科的相对丰度如图7所示，热图中主要鉴定了前10个优势菌科，用于分析不同特征区域间真菌群落分布的变化。图7中显示，3处采样区域与对照区域的微生物丰度在位置上没有明显区别。由热图所呈现出的结果显示，在各个区域中占据绝对优势的科为曲霉科（Aspergillaceae）。除此之外，在大腿皮肤完好处还存在假散囊菌科（Pseudeurotiaceae）以及锁掷酵母科（Sporidiobolaceae）；在颈部黄斑处存在假毛球壳科（Trichosphaeriaceae）。

2.3 古尸体表特征部位优势菌属及ASV信息

在属（Genus）水平上，通过高通量测序共检测出10个真菌属，古尸体表3处特征区域相对丰度排名前5的真菌属见表1，主要包括Aspergillus（曲霉属）、Xerochrysium（蜡菊属）、Cladosporium（枝孢属）、Alternaria（链格孢属）以及Pseudeurotium（假散囊菌属）。特征区域颈部黄斑处（M1）真菌的优势菌群为曲霉属和蜡菊属，其相对丰度所占比例为89.79%、10.20%。特征区域腹部开裂处（M2）和膝盖黑斑处（M3）真菌的优势菌群为曲霉属。占比为99.88%和98.74%。

在古尸体表检测出分类单元ASV数共49个，3处特征区域检测到分类单元ASV数分别为12、17和25。表2为3处特征区域相对丰度排名前5的ASV信息，颈部黄斑处（M1），ASV1相对丰度占比最多（55.78%）、其次为ASV2（28.72%）和ASV10（10.21%）。腹部开裂处（M2），ASV1相对丰度占比最大（90.98%），其次为ASV2（4.36%）。膝盖黑斑处（M3），ASV1相对丰度占比最（63.76%），其次为ASV4（20.20%）和ASV2（12.03%）。

由此可见，Aspergilluspenicillioides（帚状曲霉）是常州明代出土古尸体表占主导的一种真菌。有文献报道，A. penicillioides是一种可以生存于极端环境中的微生物，可以超越一般微生物的耐旱极限，最初分离于发霉的甘蔗、腌鱼和干辣椒^［16］。它是一种常见的霉菌，嗜盐、嗜旱和嗜渗透，还能在接近0 ℃的环境下生长，并能在厌氧状态下发挥作用。

2.4 讨论

文物霉菌污染的来源、种类、防治研究一直是文物保护工作者关注的重点之一，尤其是有机质类文物如古籍、书画，木漆器的棉、麻、丝、毛、皮等质地，本身就是霉腐微生物的良好营养源^［17］。文物上已经发现的霉菌有30余属200多种，博物馆文物库房常见的霉菌有根霉、曲霉、青霉、枝霉、球毛壳霉等。这些霉菌以有机质文物作为养分，分解利用文物本体，且在新陈代谢过程中产生的色素也会影响文物的外观状态^［18］。

对馆藏有机质文物表面霉菌污染、霉菌种类的相关研究甚多。马淑琴^［19］通过发霉书画文物作实验分析，发现霉菌种类有黑曲霉、黄曲霉和绿色木霉等；唐欢等^［20］通过采集的书画污染霉菌，发现主要为曲霉属，如黑曲霉、黄曲霉和米曲霉，还有部分根霉和木霉。通过定性^［21］和定量^［22］分析研究古书画上常见霉菌，发现霉菌对纸张的抗张力和耐折度等物理强度和化学成分均有不同程度的影响，且霉菌所处各个阶段的破坏作用也不尽相同。

无论是馆藏品还是出土饱水器物，霉菌的影响始终伴随。申艾君等^［23］对馆藏竹木漆器文物表面霉斑进行实验研究，鉴定出曲霉属和脉孢菌属等霉菌。雷琼团队^{［24⁃25］}通过分析不同墓葬出土的饱水漆木器和水样中的优势菌属，研究得出菌株的属类相当丰富，有芽孢杆菌、短杆菌、假苍白杆菌、梭杆菌等，单一细菌对木漆器的腐蚀作用有限，以菌群的形式对木材产生较大腐蚀，真菌及其与细菌协同作用的影响有必要进一步研究。肖嶙^［26］对出土饱水竹笥做微生物研究，结合培养性状，确定分离出的菌株分别属于聚多曲霉，青霉属，木霉属的绿色木霉。庄绪艳^［27］发现车马坑和棺木土壤中分布最为广泛的真菌为节生霉属和拉式被孢霉，真菌的数量虽不及细菌，但真菌中的某些霉菌分泌有机物如柠檬酸等，对木质等有机类文物具有较大的破坏作用， 不同种类的微生物对木材的腐蚀机理具有一定的差异性。最新的研究结果来自李静等^［28］对蒲江战国船棺葬船棺表面细菌群落结构特征的分析，通过船棺表面土壤检测，明显降解和严重降解的船棺表面土壤中存在大量与纤维素降解相关的细菌，而变形菌门是所有样品中的优势细菌门，丰富的潜在木材降解细菌为莫氏霉属，不同降解程度船棺表面土壤还存在大量与铁硫代谢相关的细菌。

学者们从天津博物馆^［29］、首都博物馆^［30］、三峡博物馆^［31］、荆州博物馆^［32］展厅和库房等文物保存小环境分离优势细菌样本，通过形态学、生理生化和分子生物学方法鉴定菌株，不同博物馆环境中微生物种类不尽相同，但有机质文物所处环境菌群更为丰富。天津博物馆通过实验分离的霉菌菌株主要为毛壳菌属、畸枝霉属、曲霉属、派伦霉属、枝孢属和Comoclathris，其中毛壳菌属数最多，该属是造成纸类和其他含纤维素材料生物降解的主要病害真菌之一。三峡博物馆分离的真菌以曲霉属为主，还包括毛霉属、青霉属、孢子丝菌属以及根霉属； 细菌则以微球菌属为主，还包括芽孢杆菌属、假单胞菌属、葡萄球菌属、和黄杆菌属等。首都博物馆与天津博物馆差别不大，临时展厅内的细菌菌落以微球菌属为主，其他优势菌种包括棒状杆菌、黄杆菌、芽孢杆菌和假单胞菌，真菌主要以曲霉属为主。而荆州博物馆展厅空气中分离到的真菌数量整体多于展柜，木漆器展厅空气中分离到的真菌数量和种类最多，枝孢属和小球腔菌属为优势菌属。

相较馆藏品表面和展厅环境微生物群落研究，目前对于古尸体表微生物群落的认识还很不充分。对新克罗（Chinchorro）木乃伊体表的微生物群落分析结果表明，木乃伊体表分离的细菌与人体皮肤的细菌群落相似，主要是芽孢杆菌、葡萄球菌和甲基球菌属，体表真菌主要为青霉菌和曲霉菌属^［33］。这些真菌导致的尸体霉变，主要是由于空气中真菌在体表定殖而导致的。Piñar等^［34］通过调查意大利巴勒莫的卡普奇尼地下墓穴（Capuchin Catacombs）中的空气和木乃伊微生物群落，证明了空气中的高浓度真菌孢子对人类遗骸的长期保存有重大影响，嗜盐物种是木乃伊体表和体内的主要微生物类群，这些微生物在蛋白水解和角蛋白水解方面具有较高的活性。基于以上研究结论以及本研究的结果可知，霉菌这一类耐高盐、耐干旱的微生物是导致古尸霉变的主要微生物类群，其主要来源是古尸存放环境中的空气。

3 结论

常州博物馆从墓穴形式、葬具结构、出土遗物等方面对出土古尸进行了详尽阐述，是研究明代常州地区生活、丧葬习俗的重要实物资料。古尸作为珍贵的古代人体标本，首先应该做好长期保存的工作，其次需要进行多学科综合研究。本研究通过分析古尸体表霉斑、霉点处的真菌群落，得出以下结论。

（1）通过分析体表真菌群落的物种丰富度指数以及香农多样性指数评估古尸体表的真菌多样性，发现古尸体表霉变处的真菌群落多样性总体低于皮肤完好处的多样性，与空气、土壤等环境标本相比，古尸体表物种的丰富度较低。

（2）在古尸体表共检出49个ASV，隶属于2个门，8个纲，8个目，10个科，10个属，种类较为常见，且微生物种类以条件性致病菌为主，正常条件下不会导致传染性疾病的发生。

（3）古尸体表霉变处的优势类群为曲霉属，该菌属隶属于子囊菌门，散囊菌纲，散囊菌目，曲霉科。其中丰度最高的帚状曲霉是一种超越耐旱极限的真菌，且嗜盐、嗜旱和嗜渗透。在体表霉斑、霉点处占绝对优势，可能是造成古尸霉变的主要微生物。

（4）鉴于古尸体表真菌群落的研究结果，建议在古尸保存和展示过程中，加强防霉工作，采取适当的除菌剂清理古尸表面，加强古尸保存容器的密封性和稳定性，对古尸保存环境中的温湿度、通风情况、光照强度等因素进行定期监测，定期对古尸进行除菌处理，以防止霉菌侵害、降低古尸遭受损害的风险，确保其长期保存和研究价值的持续。

（5）基于Illumina MiSeq测序技术的微生物检测方式在文物保护领域中属于一种新的尝试。该方法取样少，对文物本体伤害小，同时可灵敏获取结果。这种检测手段有利于准确鉴定微生物种类、优势类群，并为古尸的防霉治理提供更具针对性的参考和依据。由于该方法取样方便、操作简便，可以推广到对馆藏有机质文物的霉菌类微生物检测分析中，为文物保护工作提供新的技术手段和解决方案。

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