铁死亡相关基因在头颈癌中的表达及临床意义

Expression of Ferroptosis-related Genes in Head and Neck Cancer and Its Clinical Significance

摘要

采用生物信息学方法探索与头颈鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）组织中铁死亡相关的基因，并探讨其与免疫细胞浸润及患者预后的相关性，为HNSCC患者提供新的分子靶点。通过GEO数据库检索筛选得到基因微阵列数据集GSE228393，对GSE228393数据集进行GEO2R分析获得差异表达基因；通过TCGA获取HNSCC的高通量测序数据，利用R语言进行差异分析，利用FerrDb数据库检索得到铁死亡相关基因与GSE228393及TCGA数据库差异基因取交集，对交集基因进行GO与KEGG功能富集分析获取相关信号通路，并进行蛋白互作分析、生存分析以及免疫浸润分析。结果表明，有6个铁死亡相关基因FADS1、CA9、PDK4、IDO1、NOX4、AR在数据集中差异表达，且与HNSCC患者的总生存期（overall survival，OS）及免疫细胞浸润密切相关；功能富集分析表明基因功能主要富集在细胞程序性死亡的正向调控；KEGG通路主要富集在HIF⁃1信号通路；差异表达的基因在HNSCC中有一定突变率。基于肿瘤生物信息学的分析发现，铁死亡相关基因在HNSCC组织中的表达水平与正常组织有差异，且表达水平与免疫细胞浸润及肿瘤预后具有相关性，可作为HNSCC预后标志物以及基因治疗靶点。

Abstract

This study explored the ferroptosis-related genes in head and neck squamous cell carcinoma （HNSCC） tissues with the help of bioinformatics and investigated their correlation with immune cell infiltration and patient prognosis， aiming to provide new molecular targets for HNSCC patients. The gene microarray dataset GSE228393 was obtained through retrieval and screening on the GEO database and then subjected to GEO2R analysis to make clear differential expression genes. High-throughput sequencing data of HNSCC were obtained from TCGA， and differential analysis was conducted using R language. Ferroptosis-related genes were retrieved from the FerrDb database， and the intersection was determined for their differential genes with GSE228393 and the TCGA database. GO and KEGG functional enrichment analyses were performed on the common genes to obtain relevant signaling pathways， followed by protein-protein interaction analysis， survival analysis， and immune infiltration analysis. The results showed that six ferroptosis-related genes， namely FADS1， CA9， PDK4， IDO1， NOX4， and AR， were differentially expressed in the dataset and closely related to the overall survival （OS） and immune cell infiltration in HNSCC patients. Functional enrichment analyses revealed that the gene functions were mainly enriched in the positive regulation of programmed cell death. The KEGG pathways were mainly enriched in the HIF-1 signaling pathway. The differentially expressed genes had a certain mutation rate in HNSCC. Based on tumor bioinformatics analysis， the study found that the expression levels of ferroptosis-related genes in HNSCC tissues differed from those in normal tissues， and their expression levels were correlated with immune cell infiltration and tumor prognosis. Therefore， they can serve as prognostic markers and gene therapy targets for HNSCC.

Graphical abstract

关键词

HNSCC / 生物信息学 / 免疫浸润 / 铁死亡 / 公共数据库

Key words

HNSCC / bioinformatics / immune infiltration / ferroptosis / public databases

HNSCC是世界上第六大最常见的恶性肿瘤^［1⁃2］，通常由口腔、咽和喉部的黏膜上皮发展而来，目前主要采用手术切除进行治疗，然后根据疾病进展阶段进行辅助放疗或化疗加放疗。虽然HNSCC的治疗方法在不断进展突破，但由于其生长特点为侵袭性生长、容易远处转移及预后不佳等原因，HNSCC的5年生存率未见明显改善^［3⁃4］。因此，早期诊断和有效评估预后对改善HNSCC生存率具有重要意义，深入研究HNSCC发生和发展的分子机理，并找到导致肿瘤进展和不良预后的相关生物标志物非常必要。

目前研究发现铁死亡是一种依赖于Fe²⁺的新型细胞死亡形式^［5⁃7］，与自噬和细胞凋亡不同，铁死亡是一种铁依赖性和活性氧（ROS）依赖性细胞死亡，其特征主要是细胞学变化，包括线粒体嵴减少或消失、线粒体外膜破裂和线粒体膜浓缩。因此，抑制肿瘤细胞的铁死亡防御机制促使其发生程序性死亡，为肿瘤治疗提供了新思路。目前关于铁死亡相关基因在HNSCC中的表达及潜在机制研究尚未被证实。本研究通过利用相关公共数据库及R语言，对铁死亡相关基因在HNSCC中的差异表达和生存数据进行分析，阐明差异表达的铁死亡相关基因在HNSCC中的预后价值。

1 材料与方法

1.1 资料来源及差异基因筛选

根据美国国立生物技术信息中心GEO数据库 （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov.geo） ^［8］得到GSE228393数据集并利用GEO2R分析获取∣logFC∣>1、P<0.05的基因集。利用R语言对TCGA数据库^［9］504例HNSCC组织样本及44例正常组织样本进行差异基因筛选，获取∣logFC∣>2、P<0.05的基因集。717个铁死亡相关基因来源于FerrDb数据库^［10］（http：//www.zhounan.org.ferrdb）。将上述基因集取交集获取在HNSCC中差异表达的铁死亡相关基因。本研究涉及数据资料来源于公开数据库，无须医学伦理学再审查。

1.2 GO和KEGG功能富集分析

利用cBioportal^［11］获取差异基因的共表达基因，选取相关性显著的前10位基因，采用Metascape^［12］（http：//metascape.org）在线工具进行GO（gene ontology）功能注释和KEGG（Kyoto encyclopedia of genesand geonmes）信号通路富集分析。

1.3 蛋白互作网络（protein-protein interaction，PPI）构建

采用String 11.0^［13］数据库（https：//cn.string-db.org）构建差异基因的PPI网络。

1.4 关键基因在HNSCC的预后表达

利用Kaplan-Meier （K-M） Plotter^［14］（http：//kmplot.com/analysis/）评估差异表达的基因在HNSCC中的预后价值。P<0.05差异具有统计学意义。

1.5 TIMER数据库评估

TIMER（http：//timer.comp-genomics.org/）数据库是一种评判免疫细胞浸润及其对疾病影响的分析网站^［15］。使用TIMER数据库，预测并评估差异表达的铁死亡相关基因与HNSCC患者免疫细胞浸润之间的相关性。

1.6 关键基因的验证

在GEPIA2数据库^［16］（http：//gepia.cancer-pku.cn）中验证核心基因在HNSCC组织和正常组织中差异表达。

2 结果分析

2.1 DEGS的筛选

设定筛选条件∣logFC∣>1、P<0.05，从GSE228393中筛选出差异基因1 097个；设定筛选条件∣logFC∣>2、P<0.05，从TCGA中筛选出差异基因1 169个。与FerrDb取交集获取6个共同表达差异基因FADS1、CA9、PDK4、IDO1、NOX4、AR，如图1所示。

2.2 铁死亡相关差异基因在HNSCC中的表达情况

基于GEPIA数据库的结果显示差异表达基因在HNSCC组织与正常组织中表达的热图（图2）。利用UALCAN数据库基于共同表达基因分析结果显示，与正常组织相比，HNSCC组织中FADS1、CA9、IDO1和NOX4高表达（P<0.05），PDK4和AR低表达（P<0.05）（图3）。在GEPIA中评估了差异表达基因和HNSCC患者病理分期之间的相关性，如图4所示，共同表达铁死亡相关基因的表达量在HNSCC的4个病理分期中无显著差异（P>0.05）。

2.3 铁死亡相关差异基因在HNSCC中的预后价值

通过Kaplan-Meier Plotter数据库探讨差异表达基因改变的预后价值，与总体生存期显著相关的基因共2个，其OS曲线如图5所示。结果表明IDO1和AR高表达的HNSCC患者具有更高的生存率（P<0.05）。

2.4 铁死亡相关差异基因与HNSCC患者免疫细胞浸润的相关性

TIMER数据库结果显示差异表达的基因与HNSCC患者免疫细胞浸润密切相关（图6），其中FADS1、PDK4、NOX4、AR与CD8+T细胞浸润呈负相关（P<0.05），与巨噬细胞浸润呈正相关（P<0.05），与B细胞浸润呈负相关（P<0.05）；FADS1、PDK4、IDO1、NOX4、AR与CD4+T细胞浸润呈正相关（P<0.05）；FADS1、PDK4、IDO1、NOX4、AR与中性粒细胞浸润呈正相关（P<0.05）；IDO1、NOX4与树突状细胞浸润呈正相关（P<0.05）。

2.5 HNSCC中铁死亡相关差异基因的功能富集分析

利用cBioportal获取铁死亡差异表达基因的共表达基因，对关系显著的前10位基因利用GEPIA和Metascape分析其功能、通路富集，详见表1，图7。从图7可知，基因功能主要富集在糖酵解过程（glycolytic process）、转录共调解结合（transcription coregulator binding）、分子接头活性（molecular adaptor activity）、细胞程序性死亡的正向调控（positive regulation of programmed cell death）；KEGG通路主要富集在HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、癌症中的转录失调（transcriptional misregulation in cancer）、TOLL样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）。

2.6 HNSCC中铁死亡相关差异基因的基因改变分析

通过cBioportal数据库分析差异表达的基因在HNSCC患者中的突变情况，如图8所示，这些差异表达的基因均发生了不同比例的突变，其中IDO1、CA9突变率最高（6%），主要包括基因扩增和缺失；FADS1突变率最低（1%）。

3 讨论

头颈部鳞状细胞癌是一种包括口腔癌、口咽癌、下咽癌和喉癌等癌症在内的恶性肿瘤^［17］。HNSCC的主要治疗方法通常是手术联合放化疗，随着治疗方法的不断改进，HNSCC的总体生存率也得到相应的提高，但目前HNSCC仍是威胁人类健康的一个重大问题。因此，深入研究HNSCC的发病机制，阐明其发病的相关基因和通路对HNSCC早期诊断及精准治疗具有重要意义。

长期以来，虽然细胞死亡被分为细胞凋亡、坏死和自噬等类型，但细胞凋亡被认为是细胞程序性死亡的唯一途径。近些年研究发现，铁死亡是一种新型的细胞程序性死亡模式，不同于细胞凋亡、坏死等细胞形态，生化特征上也有明显不同，铁死亡的特征在于铁依赖性的脂质过氧化物累积，使得氧化还原反应平衡遭到破坏，进而引起细胞的程序性死亡^［18］。有研究表明ZC3H13通过m6A依赖性修饰，减少DUOX1介导的喉鳞状细胞癌细胞铁死亡^［19］。另有研究表明，铁死亡的发生显著减少了肿瘤微环境中髓源性抑制细胞（MDSC）和肿瘤相关M2样巨噬细胞的数量，同时肿瘤浸润CD4+T和CD8+T细胞增加^［20］。这些表明铁死亡可以通过逆转免疫抑制微环境来促进抗肿瘤免疫反应，铁死亡诱导剂是HNSCC中一种很有前途的治疗策略。

本研究通过对相关数据库分析结果的显示与正常组织相比，HNSCC组织中FADS1、CA9、IDO1和NOX4高表达（P<0.05），PDK4和AR低表达（P<0.05），根据相关研究发现^{［21⁃22］}，FADS1、IDO1、

NOX4作为铁死亡激动基因，CA9、PDK4、AR作为铁死亡抑制基因，可以通过激活相关信号通路促进或抑制细胞铁死亡，从而影响肿瘤的发生进程。Lee等^［23］发现间质型胃癌细胞中极长链脂肪酸延长蛋白5（ELOVL5）和脂肪酸去饱和酶1（FADS1）表达上调，导致铁死亡致敏。相反，这些酶在肠型GCs中被DNA甲基化沉默，使细胞对铁死亡产生抗性。另有研究发现^［21］，PDK4通过抑制丙酮酸的氧化和脂肪酸的合成对铁死亡存在代谢抗性。有多项研究显示，铁死亡的代谢调节与肿瘤的抑制作用相关，一些铁死亡正向调节因子的失活会导致肿瘤细胞对铁死亡产生抵抗，从而在一定程度上导致了肿瘤的发展。通过对铁死亡相关差异基因在HNSCC中预后价值的分析结果可知，IDO1和AR高表达的HNSCC患者具有更高的生存率（P<0.05）。以上研究结果表明，通过调节HNSCC中铁死亡相关基因的表达可以对肿瘤的进程进行干预，进而改善HNSCC患者的预后情况。

本研究通过分析铁死亡相关差异基因与HNSCC患者免疫细胞浸润的相关性可知，差异表达的基因与HNSCC患者免疫细胞浸润密切相关。有研究发现铁死亡作为一种程序性坏死比凋亡更具有免疫原性^{［18，25⁃26］}。铁死亡通过传递趋化信号，从而在肿瘤部位具有招募和激活免疫细胞的能力，被认为是一个促炎过程，这为铁死亡诱导剂作为检查点抑制剂等抗肿瘤免疫治疗提供了新思路。

通过cBioportal获取铁死亡差异表达基因的共表达基因，在HNSCC中表达的功能富集分析发现，基因改变情况分析得出基因功能主要富集在糖酵解过程（glycolytic process）、转录共调解结合（transcription coregulator binding）、分子接头活性（molecular adaptor activity）、细胞程序性死亡的正向调控（positive regulation of programmed cell death）；KEGG通路主要富集在HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、癌症中的转录失调（Transcriptional misregulation in cancer）、TOLL样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway），提示铁死亡相关基因对HNSCC细胞的作用主要通过以上功能及通路实现。通过基因突变分析发现，差异表达的铁死亡相关基因与HNSCC进程密切相关。有研究表明基因组扩增可用于靶向治疗^［26］，本研究结果中IDO1、CA9突变率最高，为6%，主要包括基因扩增和缺失，表明IDO1、CA9可能作为未来HNSCC患者基因治疗的潜在靶点。

本研究通过对铁死亡相关基因在HNSCC中的表达进行差异表达分析，并进行功能和通路富集等分析，结果表明HNSCC一定程度上与铁死亡机制密切相关，有作为新的生物标志物和免疫治疗疗效评估标志物的潜力。本研究的局限性在于数据分析来自多个在线数据库，需要进一步的体内外实验验证。

参考文献

[1] VON WITZLEBEN A， WANG C， LABAN S， et al. HNSCC： Tumour antigens and their targeting by immunotherapy［J］. Cells， 2020， 9（9）： E2103.

[2] SOLOMON B， YOUNG R J， RISCHIN D. Head and neck squamous cell carcinoma： Genomics and emerging biomarkers for immunomodulatory cancer treatments［J］. Seminars in Cancer Biology， 2018， 52： 228-240.

[3] JOHNSON D E， BURTNESS B， LEEMANS C R， et al. Head and neck squamous cell carcinoma［J］. Nature Reviews Disease Primers， 2020，6（1）： 92.

[4] KITAMURA N， SENTO S， YOSHIZAWA Y， et al. Current trends and future prospects of molecular targeted therapy in head and neck squamous cell carcinoma［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2020， 22（1）： E240.

[5] JIANG X J， STOCKWELL B R， CONRAD M. Ferroptosis： Mechanisms， biology and role in disease［J］. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2021， 22（4）： 266-282.

[6] LI J， CAO F， YIN H L， et al. Ferroptosis： Past， present and future［J］. Cell Death & Disease， 2020， 11（2）： 88.

[7] TANG D L， CHEN X， KANG R， et al. Ferroptosis： Molecular mechanisms and health implications［J］. Cell Research， 2021， 31（2）： 107-125.

[8] BARRETT T， WILHITE S E， LEDOUX P， et al. NCBI GEO： Archive for functional genomics data sets：Update［J］. Nucleic Acids Research， 2013， 41： 991-995.

[9] WANG Z N， JENSEN M A， ZENKLUSEN J C. A practical guide to the cancer genome atlas （TCGA）［M］//Methods in Molecular Biology. New York： Springer， 2016： 111-141.

[10] ZHOU N， YUAN X Q， DU Q S， et al. FerrDb V2： Update of the manually curated database of ferroptosis regulators and ferroptosis-disease associations［J］. Nucleic Acids Research， 2023， 51（D1）： D571-D582.

[11] GAO J J， AKSOY B A， DOGRUSOZ U， et al. Integrative analysis of complex cancer genomics and clinical profiles using the cBioPortal［J］. Science Signaling， 2013， 6（269）： D-1.

[12] ZHOU Y Y， ZHOU B， PACHE L， et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets［J］. Nature Communications， 2019， 10（1）： 1523.

[13] SZKLARCZYK D， KIRSCH R， KOUTROULI M， et al. The STRING database in 2023： Protein-protein association networks and functional enrichment analyses for any sequenced genome of interest［J］. Nucleic Acids Research， 2023， 51（D1）： D638-D646.

[14] NAGY Á， MUNKÁCSY G， GYŐRFFY B. Pancancer survival analysis of cancer hallmark genes［J］. Scientific Reports， 2021， 11（1）： 6047.

[15] LI T W， FU J X， ZENG Z X， et al. TIMER2.0 for analysis of tumor-infiltrating immune cells［J］. Nucleic Acids Research， 2020， 48（W1）： W509-W514.

[16] TANG Z F， KANG B X， LI C W， et al. GEPIA2： An enhanced web server for large-scale expression profiling and interactive analysis［J］. Nucleic Acids Research， 2019， 47（W1）： W556-W560.

[17] BHAT G R， HYOLE R G， LI J. Chapter two head and neck cancer： Current challenges and future perspectives［J］. Advances in Cancer Research， 2021， 152： 67-102.

[18] MOU Y H， WANG J， WU J C， et al. Ferroptosis， a new form of cell death： Opportunities and challenges in cancer［J］. Journal of Hematology & Oncology， 2019， 12（1）： 34.

[19] HUANG L L， CHEN G L， HE J， et al. ZC3H13 reduced DUOX1-mediated ferroptosis in laryngeal squamous cell carcinoma cells through m6A-dependent modification［J］. Tissue and Cell， 2023， 84： 102187.

[20] ZHAO Y Y， LIAN J X， LAN Z， et al. Ferroptosis promotes anti-tumor immune response by inducing immunogenic exposure in HNSCC［J］. Oral Diseases， 2023， 29（3）： 933-941.

[21] SONG X X， LIU J， KUANG F M， et al. PDK4 dictates metabolic resistance to ferroptosis by suppressing pyruvate oxidation and fatty acid synthesis［J］. Cell Reports， 2021， 34（8）： 108767.

[22] XIAO R X， WANG S S， GUO J， et al. Ferroptosis-related gene NOX4， CHAC1 and HIF1A are valid biomarkers for stomach adenocarcinoma［J］. Journal of Cellular and Molecular Medicine， 2022， 26（4）： 1183-1193.

[23] LEE J Y， NAM M， SON H Y， et al. Polyunsaturated fatty acid biosynthesis pathway determines ferroptosis sensitivity in gastric cancer［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2020， 117（51）： 32433-32442.

[24] PRONETH B， CONRAD M. Ferroptosis and necroinflammation， a yet poorly explored link［J］. Cell Death and Differentiation， 2019， 26（1）： 14-24.

[25] GARG A D， AGOSTINIS P. Cell death and immunity in cancer： From danger signals to mimicry of pathogen defense responses［J］. Immunological Reviews， 2017， 280（1）： 126-148.

[26] LIU Y E， WANG D， LI Z J， et al. Pan-cancer analysis on the role of PIK3R1 and PIK3R2 in human tumors［J］. Scientific Reports， 2022， 12（1）： 5924.

基金资助

内蒙古自治区自然科学基金资助项目“LncRNA GSEC竞争性结合miR-144调控CXCL8在口腔鳞癌中的作用及机制研究”(2024QN08053)

内蒙古自治区高等学校科学研究资助项目“数字化导板辅助精确治疗颧眶骨折的临床研究”(NJZY21634)

内蒙古医科大学联合资助项目“血清外泌体circRNA在口腔鳞癌中的差异性表达及其功能的研究”(YKD2023LH032)