基于分子标记技术的羊草遗传多样性研究进展

Research Progress on Genetic Diversity of Leymus chinensis Based on Molecular Marker Technology

摘要

羊草具有耐旱、耐寒、耐盐碱、耐牧等特点，是我国重要的牧草和生态草。羊草在维持我国北方草原生态系统稳定、生物多样性、草地生产力等方面扮演重要角色，在推动我国草地畜牧业健康发展中发挥重要作用。羊草遗传多样性研究对于合理开发利用和保护羊草种质资源、推动牧草育种及种质创新具有重要意义。对近年来AFLP、RAPD、ISSR、SSR和SNP等分子标记技术在羊草遗传多样性研究中的应用进行总结，对未来研究进行展望，以期为羊草遗传多样性保护和优良基因转化利用提供参考。

Abstract

Featuring resistance to drought， coldness， saline alkali， and grazing， Leymus chinensis is important forage and ecological grass in China. It plays an essential role in both maintaining the stability， biodiversity， and productivity of the grassland ecosystem in northern China and promoting the healthy development of animal husbandry on grassland in China. The research on the genetic diversity of L.chinensis is of great significance for conducting the rational development， utilization， and protection of L.chinensis germplasm resources， as well as promoting forage breeding and germplasm innovation. This paper summarized the application of molecular marker technologies such as AFLP， RAPD， ISSR， SSR， and SNP in the study of genetic diversity in L.chinensis in recent years. It pointed out the prospect for future research to provide references for the genetic diversity protection and transformation and utilization of excellent genes in L.chinensis.

关键词

遗传多样性 / 分子标记 / AFLP / RAPD / ISSR / SSR / SNP

Key words

genetic diversity / molecular marker / AFLP / RAPD / ISSR / SSR / SNP

羊草［Leymus chinensis （Trin.）Tzvel.］又名碱草，隶属禾本科赖草属。赖草属是被子植物门小麦族下的属，该属植物广泛分布于北半球寒温带，在我国主要分布于西北地区，为多年生草本植物^［1］。在赖草属系统进化的多穗组（最原始）、少穗组（较进化）和单穗组（最进化）中，羊草大多被划分为较进化的少穗组，其演化层次居少穗组偏下的位置^［2］。赖草属植物的起源经历了异源多倍化过程，拟鹅观草属植物可能通过重复杂交参与了赖草属植物物种形成。新麦草属的Psathyrostachys juncea可能作为赖草属植物物种形成的Ns基因组祖先供体。伴随着赖草属植物的分化，不同的新麦草属植物参与了赖草属植物多倍化事件；赖草属Xm基因组的起源可能涉及新麦草属的Ns基因组、冰草属的P基因组、旱麦草属的F基因组、拟鹅观草属的St基因组以及一个未知来源的基因组^［3］。羊草基因组分成Ns和Xm两个亚基因组，这两个亚基因组在约16.79 MYA前分化，并在约4.18 MYA前发生多倍化，从而形成异源四倍体羊草^［4］。杨艳婷^［5］通过与小麦族已测序的18个羊草近缘种系统发育比较分析发现，羊草与小麦（Triticum timopheevii）和冰草（Agropyron cristatum）亲缘关系较近，与大麦（Hordeum vulgare）较远。

羊草是欧亚大陆草原区东部草甸草原及干旱草原的重要建群种。羊草的广布性使其生长环境复杂多变，由于对生境的长期趋异适应，不同地理种群羊草之间在形态（叶色、穗型、叶片宽窄等）、生理（光合生理、抗旱生理、耐盐碱胁迫等）和分子遗传特征等方面均发生了明显分化^［2］。遗传多样性是羊草耐旱、耐寒和耐盐碱等抗逆特性的遗传基础。由于北方草原区气候暖干化^［6］、过度放牧、土壤盐渍化和生境脆弱等原因，我国羊草草原发生了不同程度退化，羊草遗传多样性面临威胁。羊草遗传多样性研究对于羊草亲缘关系鉴别、进化方向预判、广谱适应性奥秘的揭示、优良种质和基因资源的挖掘与利用具有重要意义。

随着分子生物学技术的发展，遗传多样性研究方法不断完善，从形态学、生理生化和细胞学（染色体）水平，逐渐发展到分子水平。分子标记（molecular genetic markers）是DNA水平遗传多态性的直接反映。目前，DNA分子标记技术已有数十种。本文对近年来AFLP、RAPD、ISSR、SSR和SNP等分子标记技术在羊草遗传多样性研究中的应用进行了总结，就研究中存在的问题进行了讨论，并对未来研究进行了展望，以期为羊草遗传多样性保护和优良基因转化利用提供参考。

1 AFLP标记技术

扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）是限制性酶切片段的选择性扩增，采用少数几对引物的多种组合即可获得大量遗传信息，是十分有效的指纹图谱技术。AFLP标记具有多态性高的特点，利用放射性标记在变性聚丙烯酰胺上可检测到50~100个甚至更多扩增片段，多态性片段可达50%左右。AFLP是揭示变种水平遗传变异的可靠分子标记^［7］。

Liu等^［8］从内蒙古等五省区市采集了27份羊草种子，并种植于温室中，每个基因型选取10株，采用十六烷基三甲基溴化铵（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取了30 d龄羊草叶片DNA，共扩增出537个AFLP条带，其中多态性片段329个（占61.3%）。徐夙侠^［9］从新疆等五省区采集了53份羊草，提取叶片DNA，E11M47引物组合，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离基因组ALFP多态片段，共产生2 108个条带，其中多态性条带505条（24.0%），野生种309条（14.7%），栽培种196条（9.3%）。此外还发现，不同生态型羊草虽表型有很大差别，但遗传基础是相似的，生态型之间的遗传变异比生态型内小得多，认为自交不亲和性和环境条件共同导致了羊草种群遗传分化^［10］。Liang等^［11］采集了中国东北四个自然种群的羊草，用8个引物组合共扩增出489个AFLP带，不同种群之间经向基因流较纬向基因流更为频繁，认为风向和候鸟在种群间基因流中发挥了作用。宫磊^［12］从松嫩平原采集了两个自然羊草种群和1个栽培羊草种群中不同叶色羊草69个单株，用12对AFLP引物，共扩增出593条可重复条带，其中148条（24.96%）为多态性条带，发现两种叶色羊草发生了显著遗传分化，较黄绿型羊草，灰绿型羊草具有更高的种群内遗传多样性，且人工栽培后分化加剧。张剑锋^［13］对松嫩平原4个灰绿型天然羊草种群的48个单株，用改良的CTAB法提取叶片DNA，用18对引物扩增出1 021条AFLP谱带，其中多态性谱带260条（25.5%），发现羊草种群内变异高于种群间和地区间变异。

随着人为干扰对草地影响的加剧，分子标记技术已成为人为干扰对草地植物遗传多样性影响研究的重要手段。李丽丽^［14］利用AFLP技术研究东北样带松嫩平原、呼伦贝尔草原、锡林郭勒草原羊草在放牧和不放牧处理下的遗传多样性，认为地理隔离是导致不同地理种群遗传变异的主要原因，长期放牧导致的环境异质性和基因流是导致同一地理区域不同羊草种群遗传变异的主要原因。于英杰^［15］采集羊草叶片，用AFLP结合甲基化敏感扩增多态性（MSAP）和反转录转座子的序列特异性扩增多态性（SSAP）技术，研究增温、施氮、增温+施氮对羊草遗传多样性的影响，发现三种处理引起了羊草表观遗传变异。

2 RAPD标记技术

随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphism DNA， RAPD）是第一代分子标记技术，以基因组DNA为模板，以一个随机的寡核苷酸序列为引物，通过PCR扩增，产生不连续DNA产物，用于检测DNA多态性。RAPD技术具有方便易行、费用低、不需同位素、模板DNA用量少等优点，在安全和实验操作上优于AFLP分子标记。

任文伟等^［16］和钱吉等^［17］收集了5个样点野生羊草种子，经萌发和栽培，提取幼叶DNA，采用RAPD技术，选用20个随机引物进行DNA随机扩增，共获得100个多态性片段，认为羊草不同地理种群之间存在遗传分化，相邻产地羊草遗传距离最近、遗传变异相对较小。崔继哲等^{［18⁃19］}选取9份不同叶色型羊草，RAPD分析发现149个多态性片段（96.1%），每份羊草均检测到特异性片段，黄绿型与灰绿型种群在10.1%的多态性片段上显著不同。汪恩华等^［20］从内蒙古等3省区收集了9份羊草种子，采用CTAB法提取实生苗幼叶基因组DNA，用21个引物共扩增出119个条带，其中多态性条带109个（82.61%），特异性标记10个，发现有性繁殖量越高的羊草，其遗传多样性越低，叶色越深、结实率越高的羊草，其遗传多样性越高。刘惠芬等^［21］运用RAPD技术对内蒙古典型草原不同生境8个羊草种群进行遗传多样性分析，采用24个随机引物共检测到224个扩增片段，其中多态性片段173个（77.2%），特异性片段22个（9.82%）。另以内蒙古5个羊草种群为研究对象，用31个随机引物共检测到496个扩增片段，多态性片段489个（98.6%）^［22］。孔祥军等^［23］从大安碱地采集天然羊草种子，萌发后提取叶片DNA，13对随机引物共扩增出98个条带，其中多态性条带88个（89.79%）。由于RAPD技术可发现特异性片段，可用于羊草种子鉴定。

3 ISSR和SSR分子标记技术

简单序列重复区间（inter simple sequence repeat，ISSR）通常为显性标记，且多态性和稳定性好，可用于构建以PCR为基础的分子图谱。目前，ISSR标记已用于绘制DNA指纹、遗传多样性分析、品种鉴定等领域。胡国富^［24］采集4个样地39份羊草叶片，用ISSR法对羊草遗传多样性进行研究，用8个引物对，共检测到47条扩增片段，其中多态片段41条（87.23%），发现羊草在种群内和种群间均发生了变异。成文革等^［25］以吉林羊草成熟种子为试验材料，应用ISSR进行体细胞无性系变异分析，结果表明，18株再生植株与亲本之间遗传相似性指数为0.974。周婵团队^{［26⁃27］}利用ISSR分子标记技术，对松嫩草原不同土壤生态型不同叶色的35个羊草渐变群进行遗传多样性分析，发现羊草叶色渐变群具有丰富的遗传变异，不同叶色羊草种群已产生分化，长岭地区灰绿色羊草种群遗传多样性最高，黄绿色羊草种群遗传多样性最低，遗传多样性在种群内高于种群间。熊乾^［28］利用ISSR分子标记技术，对松嫩草原破碎化斑块在水淹恢复演替过程中的羊草遗传多样性进行研究，发现羊草遗传多样性随斑块面积增大而变大，且斑块中心和过渡区羊草遗传多样性更高，认为生境破碎化使羊草遗传多样性降低。ISSR标记研究发现，内蒙古草原大针茅（Stipa grandis）和克氏针茅（Stipakrylovii）种群遗传多样性受放牧强度影响，中等放牧强度下遗传多样性最高，重牧条件下最低^［29］，但ISSR标记用于放牧对羊草遗传多样性影响研究尚未见报道。

简单重复序列（simple sequence repeat，SSR），又称微卫星（microsatellite），由于基本重复单元重复次数的不同而形成座位多态性，作为较理想的分子标记广泛应用于遗传图谱构建、种群遗传学以及系统发育研究中。SSR标记具有多种优点，如能同时检测多等位基因、信息量大、共显性表达、PCR操作简单、基因组覆盖率广泛、DNA用量非常少、稳定可靠等，是一种能高效、准确测定物种遗传变化的分子标记，有逐渐取代AFLP和RAPD标记等传统分子标记的趋势。SSR标记在羊草遗传图谱构建、亲缘关系分析、遗传多样性研究、多抗基因选择等方面具有广泛应用前景^［30］。

胡国富^［24］在4个样地采集了39份羊草嫩叶，用SSR法对羊草遗传多样性进行研究，5个座位共检测到11个位点，其中6个位点为共有，1个位点为灰绿羊草特有，1个位点为灰色羊草特有，几个基因座位上已发生明显变异。Yuan等^{［31⁃32］}对中国东北18个野生羊草种群遗传多样性进行研究，发现表型分化显著高于SSR分子水平分化；遗传多样性方面，野生羊草种群高于移栽种群，西部种群高于东部种群，灰绿型高于黄绿型；10.63%的变异存在于生态型之间，5.69%的变异存在于种群间，83.68%的变异存在于种群内部。同时发现SSR标记表现出的羊草遗传变异显著低于RAPD标记^{［31⁃32］}；相较其他广布种，羊草遗传变异较低^［30］。Guo等^［33］对松嫩平原3种叶色18个羊草种群360个单株提取干燥叶片基因组DNA，用15对SSR引物共检测到90个等位基因，灰绿型、绿型、黄绿型种群分别检测到84、86、86个等位基因，叶色型间、种群间、个体间差异分别解释总变异的2.34%、6.03%、91.63%，灰绿型和绿型的遗传多样性显著高于黄绿型，认为一定程度的基因流和环境因子的选择作用是羊草叶色渐变群遗传分化的重要原因。王嘉雯^［34］用12对SSR引物，从48份羊草中扩增出51个等位基因位点，其中41个为多态位点（80.39%）。Ahmed和Hou^［35］以166份资源圃羊草嫩叶为材料，用19对SSR引物共检测到133个等位基因，多态位点超80%。此外，SSR分子标记还被用于羊草不同基因型的鉴定和分型研究中^{［36⁃37］}。

4 SNP分子标记技术

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）是个体基因组上任何一个单核苷酸变异形成的DNA序列多态性。SNP标记需直接进行序列比对来发现差异，不需要通过电泳来测量片段长度，是第三代分子标记。检测SNP的最佳方法是新近发展起来的DNA芯片技术。SNP在遗传多样性分析、等位基因挖掘、高分辨率遗传连锁图谱构建、QTL定位、标记辅助选择、品种鉴定等方面有广泛应用，被认为是应用前景最好的遗传标记之一。SNP标记技术在羊草研究中的应用处于起步阶段。侯莉娟等^［38］利用SNP的HRM基因分型方法，用7对引物对48份羊草种质进行了基因分型，绘制指纹图谱，从羊草转录组测序数据中挖掘了41 843个SNPs，利用这些SNP与田间表型性状进行关联分析，发现与重要性状相关联的SNP标记。

5 总结与展望

近30年，分子标记技术快速发展，植物遗传多样性和系统发育研究从早期的酶标记技术，逐步发展到第一代AFLP和RAPD等分子标记，再逐渐发展出SSR和ISSR等二代标记技术，近年来第三代分子标记技术SNP也开始应用于羊草遗传多样性研究中，见表1。

羊草遗传多样性研究主要发现有：（1）羊草表型的变异高于分子水平的遗传变异；（2）居群内个体之间的变异高于居群间变异；（3）灰绿型羊草的变异高于黄绿型羊草；（4）遗传变异水平为不同叶色型>不同土壤生态型>不同基因型。作为在野外环境下以无性繁殖为主的克隆植物，羊草遗传多样性的形成原因可归纳为：（1）异花授粉特性，自交不亲和的杂合群体；（2）生境的多样性及生态因子的长期自然选择作用和羊草的长期进化趋异适应；（3）基因流；（5）自然突变；（6）人为选择等。

野生羊草对生物和非生物胁迫具有良好抗性，但由于其有性繁殖“三低”特性（抽穗率低、结实率低、发芽率低）、异源四倍体基因组和自交不亲和性^［39］，传统杂交育种很难实现其优良基因的快速转化利用。羊草基因组测序已完成^［4］，如何利用表型组学、基因组学等技术挖掘和利用关键基因，实现目标性状定向改良和分子设计新品种培育将是进一步研究的重点。本研究认为，应整合表型组学、环境因子、高通量基因组学等多组学手段，开展羊草适应性进化机制研究，以揭示羊草广谱适应性奥秘。

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基金资助

内蒙古师范大学基本科研业务费专项资助项目“基于克隆繁殖力的羊草优良种质筛选”(2022JBYJ029)

内蒙古师范大学学生科技创新资助项目“内蒙古地区羊草多器官碳、氮、磷计量特征研究”(2025XSKC14)

山西农业大学农业农村部饲草高效生产模式创新重点实验室开放基金课题资助项目“羊草不同器官多元素生态化学计量特征与土壤化学计量特征关系研究”(FR2023⁃02)