内蒙古大青山国家级自然保护区土壤细菌群落研究

Soil Bacterial Communities in Daqingshan National Nature Reserve of Inner Mongolia

摘要

选取内蒙古大青山国家级自然保护区6种典型生境开展夏秋两季野外调查，利用高通量测序提取土壤细菌，通过α多样性分析、NMDS分析、RDA分析等探究土壤细菌的群落多样性、分布格局及与土壤环境因子的相关性。结果表明：（1）测序共获得土壤细菌OTU 38 856个，放线菌门、变形菌门、酸杆菌门为优势物种，占比71.26%，常见物种共7个，占比25.56%；（2）土壤细菌的多样性和均匀性随着海拔的升高呈先增加后降低的趋势，土壤细菌群落结构存在显著差异（P<0.05）；（3）土壤有机碳、速效磷、速效钾和土壤含粉量是影响研究区土壤细菌群落分布的关键环境因子。通过分析大青山国家级自然保护区土壤细菌群落组成情况，为干旱半干旱区山地森林土壤生态系统服务功能评价提供参考。

Abstract

Field surveys were conducted in six typical habitats of the Daqingshan National Nature Reserve， Inner Mongolia during summer and autumn. High-throughput sequencing was adopted to extract soil bacteria， and α-diversity analysis， NMDS analysis， and RDA analysis were applied to explore the community diversity， distribution pattern of soil bacteria， and the correlation with soil environmental factors. The results show that a total of 38，856 soil bacterial OTUs are obtained. Specifically， Actinobacteria， Proteobacteria， and Acidobacteria are the dominant species， accounting for 71.26% of the total， while there are seven common species， making up 25.56%. Additionally， the diversity and evenness of soil bacteria first increase and then decrease with the rising altitude （P<0.05）， with significant differences in the soil bacterial community structure. Soil organic carbon， available phosphorus， available potassium， and soil silt content are the key environmental factors affecting the distribution of soil bacterial communities in the study area. By analyzing the composition of soil bacterial communities in the Daqingshan National Nature Reserve， this paper provides references for the evaluation of soil ecosystem service functions in mountain forests of arid and semi-arid regions.

Graphical abstract

关键词

土壤细菌 / 群落结构 / 海拔梯度 / 环境因子

Key words

soil bacteria / community structure / altitude gradient / environmental factor

土壤细菌是土壤微生物的主要群体，是土壤生态系统物质循环和能量流动的主要参与者，在维持土壤生态系统过程和功能中，包括参与地球化学物质循环、污染物降解、环境剧烈变化的缓冲等，发挥着关键作用^［1⁃3］。土壤细菌对环境变化敏感，土壤理化性质是土壤细菌生存和繁衍的关键调节因子，调控细菌群落的多样性^［4］。近年来，对土壤细菌的研究在高原^［5⁃6］、山地^{［4，7⁃9］}、丘陵^［10］、荒漠^［11］、森林^{［12⁃13］}、种植园^［14］等不同生境开展，主要集中在土壤细菌多样性、群落结构和功能、与环境因子的相关性以及碳源利用等方面^{［15⁃18］}。

内蒙古大青山国家级自然保护区位于阴山山脉中部，是一条连接东北、华北、西北动植物区系的过渡带和大通道，具有独特的人文价值和丰富的生物资源，并且位于干旱、半干旱区南缘的生态交错带，生态系统脆弱且敏感^［19］。山地生态系统因在较小的纬度和地理距离空间上存在海拔差异，导致气候和环境条件变化剧烈，为研究土壤生物分布格局提供了良好的试验条件^［20］。以往我国山地森林生态系统土壤生物研究主要集中在东北和西南等地，而对内蒙古大青山国家级自然保护区半干旱山地森林土壤细菌群落组成特征和功能多样性的研究鲜有报道。

本研究选择内蒙古大青山国家级自然保护区6种典型植物类型的土壤细菌，研究土壤细菌群落特征，分析土壤细菌群落结构分布规律及其与土壤因子的关系，探究土壤细菌空间分布规律，从而为半干旱区山地森林土壤生态系统、生态系统服务功能评价以及可持续发展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

内蒙古大青山国家级自然保护区位于内蒙古自治区包头市、呼和浩特市至乌兰察布市卓资县以北的阴山山脉中部，地理位置为40°34′~41°14′ N，109°47′~112°17′ E，最高峰九峰山海拔2 338 m，属典型的大陆性半干旱季风气候，冬季寒冷漫长，夏季温和，年平均气温7.9 ℃。全年降水多集中在7-9月，年平均降水量355.3 mm。全年光照充足，热量资源较为丰富，年平均日照时数3 105 h。

保护区主要保护以边缘物种群落为代表的半干旱山地森林，其植被兼有华北森林植物区系特色及内蒙古高原草原特色。土壤由上而下依次为山地草甸土⁃灰色森林土⁃灰褐土⁃栗钙土，对应典型地带性植被类型依次为森林草甸⁃森林灌丛⁃灌丛草原^［21］。研究区对应的典型植被和土壤类型垂直分布如图1所示。

1.2 样品采集

2022年8月和10月，依据《内蒙古植物志》《内蒙古植物志（第二版）》以及九峰山管理站工作人员调研结果，沿着垂直地带性确定了具有代表性的6种典型植被类型（表1），每种植被类型选取6个重复样方（30 cm×30 cm），用五点混合法采集了0~<10 cm和10~20 cm土样，一部分置于-80 ℃的冰箱冷冻保存，委托内蒙古保森生物科技有限公司对土壤细菌进行高通量测序；另一部分土样风干后测定土壤理化性质。样地基本情况见表1。

1.3 样品处理

土壤细菌通过高通量测序后，对原始数据进行数据质控，通过序列拼接、过滤和去嵌合体后得到优化序列，然后进行OTU（物种分类单元）聚类及注释。

土壤理化性质按照《土壤农化分析》进行测定：土壤pH采用水浸提⁃玻璃电位法测定；有机质含量采用重铬酸钾氧化⁃油浴外源加热法测定；土壤速效氮采用碱解氮扩散法测定；速效磷采用碳酸氢钠浸提、钼锑抗比色法测定；速效钾采用乙酸铵浸提、原子吸收法测定；土壤颗粒组成采用吸管法测定。

1.4 数据处理和分析

结合文献［7］，采用ACE指数、Chao1 指数、Simpson指数和Shannon指数，分析土壤细菌群落丰富度和多样性。同时采用单因素方差分析比较不同植被类型土壤细菌多样性指数的差异。

利用CANOCO5.0软件进行非线性多维标度法（NMDS），分析比较不同植被类型土壤细菌群落组成结构的差异。NMDS排序分析选用Bray⁃Curtis计算土壤细菌群落结构组成之间的距离。Stress值小于0.2时，表示排序结果尚可；Stress值大于0.3，表示排序结果较差。

利用CANOCO5.0软件对土壤细菌进行去趋势对应分析（DCA），结果显示Lengths of gradient小于3，使用冗余分析（RDA），所有排序的显著性均由Monte Carlo随机置换（499 次，P<0.05）进行检验，以确定土壤环境对土壤细菌的影响。采用Pearson与曼特尔检验分析不同植被类型下土壤细菌群落组成之间的相关性。采用SPSS 20.0进行统计分析，采用Origin2022和CANOCO5.0绘图。

2 结果分析

2.1 土壤细菌群落组成

本研究共获得9 102 902条序列，根据97%的相似度共划分为38 856个OTU。经分类发现，研究区土壤细菌样品中包含35门111纲298目412科578属。从门水平上看，相对丰度大于10%的优势细菌门有3个，分别为放线菌门（Actinobacteriota）（33.78%）、变形菌门（Proteobacteria）（20.38%）、 酸杆菌门（Acidobacteriota）（17.10%）。相对丰度大于1%的常见细菌门有7个，分别为绿弯菌门（Chloroflexi）（7.62%）、芽单胞菌门（Gemmatimonadota）（5.88%）、疣微菌门（Verrucomicrobiota）（3.03%）、拟杆菌门（Bacteria）（2.46%）、拟杆菌门（Bacteroidota）（2.40%）、Methylomirabiloat（2.31%）、粘球菌门（Myxococcota）（1.86%）。相对丰度前10的土壤细菌门总相对丰度占比为96.82%（图2a），是大青山自然保护区土壤细菌群体的主体。

从科水平上看，相对丰度大于1%的常见细菌科有25个，总相对丰度占比为66.13%。相对丰度前10的土壤细菌科分别为火丝菌科（Pyrinomonadaceae）（6.29%）、芽单胞菌科（Gemmatimonadaceae）（5.46%）、67⁃14（4.94%）、盖勒氏菌科（Gaiellales；uncultured）（4.37%）、黄色杆菌科（Xanthobacteraceae）（3.49%）、微纳米杆菌科（Vicinamibacterales；uncultured）（3.46%）、维纳米杆菌科（Vicinamibacteraceae）（3.04%）、鞘杆菌科（Sphingomonadaceae）（2.93%）、独行杆菌科（Solirubrobacteraceae）（2.90%）、KD4⁃96（2.77%），总相对丰度占比为39.65%。相对丰度较低的土壤细菌科分别为MB⁃A2⁃108（2.54%）、拟杆菌科（Bacteria；uncultured）（2.46%）、微单孢子菌科（Micromonosporaceae）（2.33%）、梭菌科（Chthoniobacteraceae）（2.28%）、亚硝化单胞菌科（Nitrosomonadaceae）（2.22%）、罗库菌科（Rokubacteriales）（2.21%）、红杆菌科（Rubrobacteriaceae）（2.16%）、假诺卡氏菌科（Pseudonocardiaceae）（1.56%）、盖勒氏菌科（Gaiellales）（1.54%）、几丁质食菌科（Chitinophagaceae）（1.51%）、Gitt⁃GS⁃136（1.23%）、IMCC26256（1.18%）、诺心科（Nocardioidaceae）（1.14%）、酸微菌科（Acidimicrobiia；uncultured）（1.08%）、TRA3⁃20（1.03%），总的相对丰度占比为54.63%（图2b）。

2.2 土壤细菌多样性

不同植被类型土壤细菌多样性如图3所示。从图3的a-b可知，6种典型植被类型土壤细菌群落ACE指数和Chao1指数都表现为高海拔（青海云杉群系和克氏针茅群系）的丰富度高于中海拔（蒙古栎群系和白桦群系），且中高海拔的丰富度均显著高于低海拔（黄刺玫群系和山樱桃群系）（P<0.05），表明土壤细菌丰富度随着海拔的增加呈增加趋势。从图3的c-d可知，6种典型植被类型土壤细菌群落Shannon指数和Simpson指数均表现高海拔青海云杉的多样性和均匀性最高，且显著高于低海拔的黄刺玫群系和山樱桃群系（P<0.05），表明土壤细菌的多样性和均匀性随着海拔增加呈先增加后降低的趋势。

通过NMDS进一步探究土壤细菌群落在不同海拔间的差异，Stress值为0.11，表明排序结果较好（图4）。土壤细菌群落中，NMDS1轴可将中高海拔的乔木和草本（蒙古栎群系、白桦群系、青海云杉群系、克氏针茅群系）与低海拔灌木（黄刺玫群系、山樱桃群系）的土壤细菌群落明显区分开，表明其土壤细菌的群落结构存在显著差异。

2.3 土壤理化因子对土壤细菌的影响

研究区相对丰度大于10%的优势土壤细菌门与土壤理化因子的RDA如图5所示。由图5a可知，第Ⅰ轴的解释度为33.15%，第Ⅱ轴的解释度为10.51%，前两轴累计解释量达43.66%，P值为0.002， 说明排序结果较好。放线菌门（Actinobacteriota）、绿弯菌门（Chloroflexi）和拟杆菌门（Bacteria）与Sand、Clay呈正相关；变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）、酸杆菌门（Acidobacteriota）、疣微菌门（Verrucomicrobiota）、粘球菌门（Myxococcota）与SOM、AN、AP、AK、Silt、pH呈正相关；芽单胞菌门（Gemmatimonadota）和Methylomirabiloat与SOM、AN、AK、Silt、Clay呈正相关。综上，与SOM、AN、AP、AK、Silt呈正相关的门水平土壤细菌较多，是影响土壤细菌门类群落分布的主要因素。

由图5b可知，第Ⅰ轴的解释度为28.15%，第Ⅱ轴的解释度为6.35%，前两轴累计解释量达34.50%，P值为0.002，说明排序结果较好。SOM、AN、AP、AK是4个较长的向量，可能是导致土壤细菌群落结构差异的关键理化因子。盖勒氏菌科（Gaiellales；uncultured）、独行杆菌科（Solirubrobacteraceae）、67⁃14与pH呈正相关；芽单胞菌科（Gemmatimonadaceae）、微纳米杆菌科（Vicinamibacterales；uncultured）、维纳米杆菌科（Vicinamibacteraceae）与SOM、AN、AP、AK、Silt呈正相关；黄色杆菌科（Xanthobacteraceae）与AK、Clay呈正相关；火丝菌科（Pyrinomonadaceae）、鞘杆菌科（Sphingomonadaceae）、KD4⁃96与Clay、Sand呈正相关。与门水平土壤生物群落分布的环境驱动因子相似，对科水平土壤细菌群落差异的最大驱动因子同样是AN，其次是SOM、AP、AK、Silt，与AN正向协同作用，与Sand则为反向作用。pH对土壤细菌群落结构影响最小，SOM、AN、AP、AK、Silt是驱动研究区土壤细菌群落结构的主要环境因子。

3 讨论

3.1 土壤细菌群落组成差异

本研究发现，研究区相对丰度大于10%的优势细菌门有放线菌门（33.78%）、变形菌门（20.38%）、酸杆菌门（17.10%），总相对丰度占比为71.26%。这与多数干旱、半干旱区土壤细菌优势门类的研究结果相似。嘉陵江滨岸带土壤细菌的优势菌门有变形菌门、放线菌门、酸杆菌门，相对丰度占比60%左右^［22］；秦岭自然保护区红桦林相对丰度最大的土壤细菌分别是酸杆菌门、变形菌门和放线菌门，占比达70%以上^［13］；黄土高原森林植被的优势菌门有变形菌门、放线菌门、酸杆菌门，占比变化范围为50.57%~77.26%^［5］。通过对比发现，干旱、半干旱区土壤细菌的优势门类占比高于湿润、半湿润区，因此半干旱区的优势类群在生态系统物质循环与能量流动中作用更重要，对土壤细菌群落结构特征及生态学特征的影响更明显。植被群落特征的不同以及局部小气候差异可能是造成不同区域土壤细菌优势类群有差异的原因。

3.2 海拔对土壤细菌空间分布的影响

海拔梯度的变化会导致温度、光照、水分等多种环境因子的改变，引起山地区域小气候、土壤理化特征等梯度效应，进而影响土壤细菌生物量、活性及群落结构的变化^［7］。本研究发现，土壤细菌丰富度随海拔的增加呈增加趋势，多样性和均匀性随海拔增加呈先增加后降低的趋势（图3a—d）。中高海拔（青海云杉群系、白桦群系、蒙古栎群系、克氏针茅群系）的土壤细菌丰富度均显著高于低海拔（黄刺玫群系、山樱桃群系）。导致这种差异的原因可能是：（1）随着海拔上升，温降湿增，中高海拔较好的水热条件组合为土壤细菌提供了适宜的生长环境；（2）森林（青海云杉群系和白桦群系）、乔木（蒙古栎群系）和高山草甸（克氏针茅群系）有较厚的凋落物层，为土壤细菌的生长发育提供了必要的物质和能量来源。这与贺兰山东坡不同海拔土壤细菌群落特征的研究结果相似^［23］。而土壤细菌多样性与西北小檗生境20~40 cm土层细菌群落多样性趋势相同，温度降低有可能是导致随着海拔升高细菌群落种类呈递减变化的重要原因^［7］。根据目前的报道，土壤细菌多样性的海拔分布并未明确倾向于某种分布模式，而表现为无趋势、下降、单峰或者下凹型等多种海拔分布格局^［8］。

3.3 土壤环境因子与土壤细菌的关系

土壤有机质、含水率、pH、全氮、全磷对土壤细菌群落分布影响很大^［24］。在本研究中，有机碳、速效磷、 速效钾、土壤粉粒含量是影响研究区土壤细菌群落分布的重要因素（图5）。变形菌门是一种富营养型细菌，与土壤养分呈正相关，RDA分析也证明了变形菌门与有机碳、碱解氮、速效磷、速效钾、含砂量、pH呈正相关。酸杆菌门是一种寡营养型菌，对难分解的有机物具有较高的利用效率，说明6种植被类型中难分解的有机物较多，这可能是酸杆菌门相对丰度较高的原因^［8］。有研究报道，放线菌门成员具有较高比例的碳水化合物降解酶，促进土壤有机碳的矿化，在植物残体分解中发挥关键的生态生理作用^［25］。从图5可知，放线菌门与土壤含砂量相关性更高，说明黄刺玫群系、山樱桃群系、克氏针茅群系的放线菌门细菌不仅对样地土壤有机碳降解过程具有重要意义，还对土壤酶以及有机质的积累具有重要作用。本研究发现土壤pH对土壤细菌群落结构影响最小，这与我国典型山地土壤细菌群落结构特征及环境影响因子研究有一定差异^［9］。由此可推断，不同地区土壤环境因子对土壤细菌群落结构的影响不尽相同，土壤细菌对土壤环境的影响也不同，若要全面反映土壤环境因子与干旱、半干旱山地森林土壤细菌群落差异的关系，还需进一步展开研究。

4 结论

对内蒙古大青山国家级自然保护区土壤细菌群落特征进行研究，得到以下结论。

（1）优势细菌门包括放线菌门、变形菌门、酸杆菌门，总相对丰度占比为71.26%，常见细菌门总相对丰度占比为25.56%，对土壤细菌群落结构特征及生态学特征的影响显著，也对干旱、半干旱山地森林生态系统的研究有重要影响。

（2）不同植被类型的土壤细菌丰富度表现为青海云杉群系最高，显著高于低海拔的山樱桃群系和黄刺玫群系。土壤细菌群落分布结构受海拔影响。

（3）土壤有机碳、碱解氮、速效磷、速效钾和土壤含砂量是影响研究区土壤细菌群落分布的重要因素，碱解氮是关键环境因子，pH对土壤细菌群落分布的影响最小。

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基金资助

内蒙古自治区自然科学基金资助项目“内蒙古大青山大型土壤动物群落时空分布特征研究”(2020BS04007)

内蒙古自治区直属高校基本科研业务费资助项目“大青山国家级自然保护区生物多样性调查、监测与评估研究”(NCYWZ2006)