红景天苷对高糖血管平滑肌细胞增殖及氧化应激的影响

Effect of Salidroside on Proliferation and Oxidative Stress of Vascular Smooth Muscle Cells with High Glucose

摘要

采用红景天苷和线粒体分裂抑制剂Mdivi-1处理高糖（high glucose， HG）与低糖（low glucose， LG）条件下的血管平滑肌细胞（VSMCs） 24 h，探究红景天苷对高糖诱导的VSMCs增殖、活性氧物质（ROS）生成以及线粒体自噬的影响，并探讨其潜在的作用机制。在验证红景天苷抑制ROS的生成、抑制HG诱导的VSMCs增殖实验中，再设置HG红景天苷组和红景天苷+H₂O₂组。Mfn2-siRNA用于抑制Mfn2的表达，构建携带Drp1基因的过表达质粒（pcDNA3.1-Drp1），并转染至高糖环境下的VSMCs以实现Drp1过表达。结果表明，红景天苷和Mdivi-1能够抑制VSMCs的增殖、动力蛋白相关蛋白1（Drp1）的表达和氧化应激，并上调线粒体融合蛋白2（Mfn2）的表达（P<0.05），红景天苷能抑制HG条件下VSMCs线粒体自噬，外源性ROS可能部分逆转对VSMCs增殖的抑制作用。基于体外研究，红景天苷可以通过维持线粒体动力学稳态和调节氧化应激水平，抑制HG诱导的VSMCs增殖和线粒体自噬，Mfn2是其潜在的关键蛋白。

Abstract

To investigate the effect of salidroside on high glucose-induced proliferation of vascular smooth muscle cells （VSMCs）， reactive oxygen species （ROS） production， and mitophagy， as well as to explore its potential mechanism of action， this paper treats VSMCs in high glucose （HG） and low glucose （LG） conditions with salidroside and mitochondrial fission inhibitor Mdivi-1 for 24 h. In the experiments verifying that salidroside inhibits ROS production and HG-induced VSMC proliferation， additional groups （the HG+salidroside group and salidroside+H₂O₂ group） are set up. Meanwhile， Mfn2-siRNA is adopted to inhibit the expression of Mfn2， and the overexpression plasmid carrying the Drp1 gene （pcDNA3.1-Drp1） is constructed and transfected into VSMCs in high glucose condition to achieve Drp1 overexpression. The results show that salidroside and Mdivi-1 can inhibit the proliferation of VSMCs， the expression of dynein-related protein 1 （Drp1）， and oxidative stress， while upregulating the expression of mitochondrial fusion protein 2 （Mfn2） （P<0.05）. Additionally， salidroside can inhibit mitophagy of VSMCs in HG condition， and exogenous ROS may partially reverse the inhibitory effect on VSMC proliferation. Based on in-vitro studies， salidroside can inhibit HG-induced VSMC proliferation and mitophagy by maintaining mitochondrial dynamics homeostasis and regulating oxidative stress levels， and Mfn2 is a potential key mechanism-related protein.

Graphical abstract

关键词

红景天苷 / 血管平滑肌细胞 / 线粒体自噬 / 氧化应激 / 高糖环境 / 细胞增殖

Key words

salidroside / vascular smooth muscle cell / mitophagy / oxidative stress / high-glucose condition / cell proliferation

在全球范围内，尽管已有大量的基础和临床研究，但心血管疾病仍是目前危害公共健康的重要原因之一^［1-2］。糖尿病作为冠心病的显著危险因素，大幅提升了心血管疾病的发生率，且缺血性心血管并发症所致死亡占所有与糖尿病相关死亡的75%^［3］。这类心血管并发症通常涉及血管内部多种细胞和亚细胞水平的变化^［4］。在糖尿病患者中，血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）在心血管病理学变化的过程中起着至关重要的作用^［5］。Papachristoforou等^［6］研究提示，氧化应激对糖尿病患者中动脉血管组织的重塑起到关键作用，不仅影响VSMCs的增殖和凋亡平衡，还涉及细胞外基质的合成。由 高糖环境引发的内部氧自由基累积，通过影响多种细胞通路和抑制一氧化氮和酶活性，最终促进平滑肌细胞的增殖^［7］。目前有研究推测，上述机制可能与葡萄糖自氧化、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate， NADPH）氧化酶的过度激活^［8］、蛋白质的非酶糖基化^［9］、 多元醇途径活性增加、蛋白激酶C激活^［10］及抗氧化系统清除活性减弱有关，但其具体作用机制尚未完全阐明。

近年来有研究显示，参与线粒体动态调节的蛋白质与VSMCs增殖之间密切相关，这为心血管疾病的治疗提供了新的潜在靶点^［11］。线粒体通过其动态变化来保持细胞环境的稳态，这一复杂的调控过程受到线粒体融合与分裂相关蛋白质的精细调节，如线粒体融合蛋白1（mitofusin 1， Mfn1）、线粒体融合蛋白2（mitofusin 2， Mfn2）和dynamin相关蛋白1（Drp1）等，但目前仍缺乏直接证据支持线粒体动态变化参与高糖诱导的VSMC增殖机制的观点。

红景天苷作为传统中药饮片红景天的主要有效成分^［12］，因其被证实能对各种物质引起的氧化损伤具有保护作用而成为心血管领域研究热点。已有多项研究表明其对神经系统^［13］、心脏^［14］、肝脏^［15］以及血管系统具有显著的保护作用。进一步研究表明^［16］，红景天苷通过促进腺苷酸活化蛋白激酶（Adenosine 5'-monophosphate （AMP）-activated protein kinase，AMPK）/沉寂信息调节因子1（Sirtuin-1， SIRT1）途径减轻氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞损伤。Davies等^［17］研究发现红景天苷可以有效中和由次氯酸引起的严重氧化损伤。但在糖尿病状态下红景天苷对VSMCs保护效应的机制尚未有更全面明确的证据。鉴于此，本研究通过分析红景天苷在高糖诱导下VSMCs增殖的抑制作用，并验证红景天苷维持线粒体动力学稳态和调节氧化应激水平的调控机制，以期明确红景天苷在心血管疾病治疗中的作用机理和潜在价值，为临床应用提供更明确的理论依据和新方向。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与分组

血管平滑肌细胞通过酶解法从6~8周龄雄性Sprague-Dawley大鼠（购自广州源嘉医药技术开发有限公司）的主动脉中分离。细胞在DMEM杜氏改良培养基（DMEM/F12，购自Thermo Fisher Scientific公司）中培养，在5% CO₂和37 ℃条件下孵化24 h。使用10 µmol/L和25 µmol/L Mdivi-1或0.3 mmol/L和0.5 mmol/L红景天苷处理VSMCs。将VSMCs分别用10 µmol/L和25 µmol/L Mdivi-1（购自Sigma-Aldrich）或0.3 mmol/L和0.5 mmol/L红景天苷（购自上海源叶生物科技有限公司）在低糖（low glucose， LG；5 mmol/L，SIgma-Aldrlch^®）或高糖（high glucose， HG；25 mmol/L， Sigma-Aldrlch^®）环境中处理24 h。对于在HG环境下处理的VSMCs，进一步用25 mmol/L的H₂O₂处理2 h，以提高ROS水平，或用Mfn2-siRNA进行干扰。实验分为LG 红景天苷0.3 mmol/L组和0.5 mmol/L组；LG Mdivi-1 10 µmol/L组和25 µmol/L组；HG红景天苷0.3 mmol/L组和0.5 mmol/L组；HG Mdivi-1 10 µmol/L组和25 µmol/L组。在验证红景天苷抑制ROS的生成抑制高糖诱导的VSMCs增殖中，再设置HG红景天苷组和红景天苷+H₂O₂组；为了验证红景天苷通过调控Drp1和Mfn2表达影响氧化应激，通过Mfn2-siRNA抑制Mfn2的表达，构建携带Drp1基因的表达质粒pcDNA3.1-Drp1，确保其能够在细胞内高效表达Drp1蛋白。

1.2 仪器设备

酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）酶标仪（型号Sunrise）购自Teacan公司；激光共聚焦显微镜（型号FV1000）购自Olympus公司；发光凝胶成像系统（型号Gene Gnome XRQ）购自SYNGENE公司；光学显微镜（型号BX51）购自Olympus公司；免疫组化仪（型号3110）购自日立诊断产品有限公司；激光扫描共聚焦显微镜（CLSM，型号EVOS M5000）、E-Gel sizeselect凝胶电泳系统（型号E-Gel^® SizeSelect™ Gels）、BrdU试剂盒（型号eBioscience^TM 8817-6600-42）均购自Thermo Fisher Scientific公司；RNA提取试剂盒、cDNA合成逆转录酶试剂盒均购自TaKaRa Bio公司；恒温培养箱（型号SPX-70，苏州三清仪器有限公司）；ABI PRISM 7500实时荧光定量PCR仪系统（购自Thermo Fisher Scientific公司）；ChemiDoc™ XRS+成像系统（购自Bio-Rad Laboratories公司）；流式细胞仪（购自碧迪医疗器械（上海）有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 RNA干扰和转染

针对Mfn2的引物序列为5'-CAAGCACUUUGUCACUGCCAAGAAA-3'（正向）和5′-UUUCUUCGGCAGUGACAAAGUGCUUG-3'（反向），负对照乱序siRNA引物序列为5'- CCUCUUACCCAGUUACAAUUUAUA-3'（正向）和5'-UAUAAAUUGUAACUGAGGUAAGAGG-3'（反向）。按上述条件培养2 d后，按1×10⁶细胞数量的VSMCs播种于6孔板。1 d后，约90%密集度的细胞与小干扰RNA（siRNA）及作为转染效率对照的EGFP pCDNA质粒共转染，使用Lipofectamine™ 2 000转染试剂（购自Thermo Fisher Scientific公司）按说明书进行操作。转染后1 d更换培养基，细胞在5% CO₂的37 ℃恒温培养箱中继续培养2 d。

1.3.2 细胞增殖检测方法

收集不同分组的对数生长期的VSMCs，经过胰酶消化后离心。将细胞悬液接种到96孔板，每孔加入约5 000个细胞，在37 °C、5% CO₂条件下培养12 h。用0.01 mmol/L PBS清洗3次，除去未贴壁细胞。每孔加入10 μL的CCK-8溶液，轻轻摇晃培养板以确保均匀混合，避免产生气泡。将培养板放回培养箱，在37 ℃下孵育1~4 h。使用酶标仪在450 nm波长处测定每孔的光密度。

1.3.3 免疫荧光染色

取高糖诱导的VSMCs、0.5 mmol/L红景天苷处理VSMCs及对照组VSMCs，吸去原有培养基，使用PBS洗去死亡细胞；固定、透化、封闭后，加入 BSA 稀释的BNIP3抗体，4 ℃孵育48 h；PBS洗涤后，加入PBS稀释的Cy3标记的羊抗小鼠 IgG 及羊抗兔IgG-FITC室温孵育1 h；PBS洗涤后，封片液进行封片，置于激光共聚焦荧光显微镜下观察荧光发生情况并拍片记录。

1.3.4 蛋白免疫印迹（Western Blot）检测分析

红景天苷和Mdivi-1处理24 h后，细胞在1 mmol/L苯甲基磺酰氟的放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液中裂解，并在4 °C下离心10 min以提取总蛋白。使用比色法测定蛋白浓度后，将蛋白样品经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳并转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。膜先用5%脱脂奶粉封闭，再以抗Drp1（1∶500）、抗Mfn2（1∶500）和 抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（1∶1 000）抗体在4 °C过夜孵育。洗涤后，膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，再次洗涤并用增强化学发光法（ECL）检测信号，使用Bio-Rad的ChemiDoc™ XRS+系统进行成像和分析。蛋白相对表达水平通过Image J软件（V 2.1.4.7）分析条带的灰度值，并将目标蛋白的灰度值标准化为内参蛋白GAPDH的灰度值进行计算。

1.3.5 逆转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR）

从VSMCs提取总RNA，使用RNA提取试剂盒和cDNA合成逆转录酶试剂盒将1 000 ng RNA转录成cDNA。利用Beacon Designer™设计的引物（表1），通过ABI PRISM 7500系统进行RT-qPCR分析，GAPDH基因作为内参。为确保实验的准确性，本研究共重复进行3次。

1.3.6 活性氧ROS和烟酰胺腺苷二磷酸（NADPH）氧化酶活性的检测方法

活性氧类（ROS）采用DCFH-DA荧光探针装载待检测细胞后，选择流式细胞仪FITC荧光通道检测，以确定总的氧化应激水平。按照1∶1 000用无血清培养液稀释二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA），使终浓度为10 mmol/L。将不同分组的细胞收集后，悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为1×10⁶~1×10⁷/mL，37 ℃细胞培养箱内孵育20 min。每隔3~5 min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA，最后于共聚焦显微镜下观察并拍照，采用Image J软件（V 2.1.4.7）将积分光密度值（IOD）作为检测结果。NADPH氧化酶活性的检测采用NADP+ /NADPH检测试剂盒，在反应过程中NADP+被还原为 NADPH，NADPH将WST-8还原成橙黄色甲臜（formazan），在450 nm左右有最大吸收峰。

上述检测实验在至少3个独立生物重复中，各自至少包含2次的技术重复，以确保检测数据的准确性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，结果以平均值±标准差的形式表示，两组间的比较应用独立样本t检验，多组间的差异先采用单因素方差分析（ANOVA）进行总体检验，然后对比较结果采用Bonferroni多重比较校正，以控制Ⅰ型错误风险。

2 结果分析

2.1 红景天苷抑制HG诱导的VSMCs增殖

HG环境对照组的增殖水平高于LG环境对照组（P<0.01），表明HG环境可高效诱导VSMCs的增殖 （图1）。在高糖环境中，0.3 mmol/L和0.5 mmol/L红景天苷对VSMCs均显示出显著抑制作用（P<0.05），且0.5 mmol/L红景天苷的抑制效果更强（P<0.01），呈明显的浓度依赖性。10 µmol/L和25 µmol/L Mdivi-1同样达到显著的VSMCs增殖抑制效果（P<0.01），也呈浓度依赖性。而0.5 mmol/L红景天苷与10 µmol/L Mdivi-1在抑制效果上无显著差异（P>0.05），但均显著弱于25 µmol/L组Mdivi-1（P<0.01）。

2.2 红景天苷抑制HG条件下VSMCs线粒体自噬

BNIP3是一种定位于线粒体外膜的多功能蛋白，它可以作为促凋亡蛋白或促线粒体自噬受体发挥作用。荧光显微镜下观察（图2）发现，BNIP3标记的线粒体自噬抗体均为红色荧光，与正常组比较，高糖组细胞红色荧光表达数量显著增加（P<0.05），说明高糖后细胞线粒体自噬发生增加。经过红景天苷处理后，BNIP3红色荧光表达显著减少（P<0.05），从而抑制线粒体发生自噬。

2.3 红景天苷下调Drp1和上调Mfn2表达

不同环境对蛋白和mRNA水平的表达如图3所示。从图3A-B可知，0.3 mmol/L红景天苷处理下，Drp1和Mfn2蛋白相对表达水平相对于HG-control组无显著差异（P>0.05），而0.5 mmol/L红景天苷处理下相对于HG-control组差异极显著（P<0.01），且与0.3 mmol/L处理相比差异也具有显著的统计学意义（P<0.05）。从图3C-D可知，Drp1和Mfn2 mRNA相对表达量相对于HG-control组差异极显著（P<0.01）。各处理组中，25 µmol/L Mdivi-1处理的效果最为显著（P<0.01）。Western Blot结果（图3E）提示红景天苷和Mdivi-1处理明显下调Drp1蛋白和mRNA表达，同时上调Mfn2表达。

2.4 红景天苷抑制HG诱导的VSMCs氧化应激

在HG条件下，VSMCs内ROS的产生和NADPH氧化酶活性显著增加（P<0.05），如图4所示。与HG-control组相比，红景天苷和Mdivi处理均显著降低了ROS水平和NADPH氧化酶活性（P<0.05），且呈剂量依赖。

2.5 红景天苷通过抑制ROS水平抑制HG诱导的VSMCs过度增殖

为了确定ROS水平与红景天苷对HG诱导的VSMCs过度增殖效果之间的关联，向培养的VSMCs中添加25 µmol/L H₂O₂以提高ROS水平，结果如图5所示。由图5可知，红景天苷处理可显著抑制HG诱导的VSMCs增殖（P<0.01），而进一步添加外源性ROS可部分抵消这一抑制作用，HG+H₂O₂+红景天苷组VSMCs增殖与HG+红景天苷组相比显著增加（P<0.05），提示红景天苷可能通过降低细胞中的ROS水平，实现对HG诱导的VSMCs过度增殖的抑制效果。

2.6 红景天苷抑制HG环境下VSMCs线粒体分裂相关因子表达对外源ROS的敏感性不强

为验证红景天苷的保护作用是否仅限于内源性ROS的调控来缓解VSMCs线粒体分裂，在红景天苷处理后的HG培养细胞中引入25 µmol/L H₂O₂。观察红景天苷在外源性ROS存在下是否仍能调控Drp1和Mfn2的表达。如果红景天苷在外源性H₂O₂存在下仍能抑制Drp1的表达并促进Mfn2的表达，则表明红景天苷的保护机制可能不仅仅依赖于降低内源性ROS，还涉及其他途径。如果红景天苷在外源性H₂O₂存在下失去其调控能力，则表明红景天苷主要是通过降低内源性ROS水平来实现其保护作用。如图6所示，加入H₂O₂后，红景天苷对Drp1蛋白和mRNA表达的抑制作用稍有减弱，并略微减少了对Mfn2蛋白和mRNA表达的促进作用，但均无显著差异（P>0.05）。Western Blot结果类似，可见红景天苷抑制HG高糖环境下VSMCs线粒体分裂相关因子Drp1和Mfn2表达对外源ROS的敏感性不强，这表明红景天苷可能通过降低内源性ROS水平来实现其保护作用，对外源性ROS的抗氧化能力有限。

2.7 红景天苷通过调控Drp1和Mfn2表达抑制HG诱导的VSMCs氧化应激

为进一步阐明红景天苷抑制HG诱导的VSMCs线粒体分裂增殖中Drp1和Mfn2表达与VSMCs胞内氧化应激水平变化之间的关联，分别添加融合蛋白2-小干扰RNA（Mfn2-siRNA）来沉默Mfn2表达，构建携带Drp1基因的过表达质粒（pcDNA3.1-Drp1）并随后进行红景天苷干预。红景天苷通过上调Mfn2表达来降低NADPH氧化酶活性，进而减少ROS的产生。当Mfn2被抑制时，红景天苷对NADPH氧化酶活性的抑制效果被部分逆转，导致NADPH氧化酶活性增加。NADPH氧化酶活性在Mfn2-siRNA子组和HG组之间差异显著（P<0.05）（图7A），而ROS水平则无差异（P>0.05）（图7B）。结果提示红景天苷可能通过上调Mfn2表达来降低ROS水平，部分是通过抑制NADPH氧化酶活性实现的。Drp1的过表达显著增加了NADPH氧化酶活性和ROS水平，与HG组相比，二者之间没有显著差异（P>0.05）（图7C-D）。这说明红景天苷能够部分抑制Drp1过表达引起的NADPH氧化酶活性和ROS水平的增加，表明红景天苷通过调节Drp1的表达来减轻氧化应激和NADPH氧化酶活性。结合Mfn2表达抑制的结果，进一步支持了红景天苷通过调控线粒体动力学相关因子（包括上调Mfn2和下调Drp1）来发挥其抗氧化作用的机制。

3 讨 论

糖尿病（DM）是冠状动脉心脏病的一个风险因素，显著增加了心血管疾病的发生率。血管平滑肌细胞的增殖是形成动脉内膜增厚和动脉硬化的关键步骤。已知高血糖会直接影响VSMCs的表型和功能，加速心血管并发症的进展。因此，有效抑制VSMCs的增殖，可能有助于延缓或防止动脉粥样硬化疾病的发展。红景天为多年生草本植物，主要生长在高海拔、高寒、干燥、缺氧和昼夜温差大的地区，具有极强的环境适应能力和生命力^［18］。中国很早就有应用红景天的经验，在《四部医典》和《本草纲目》中均有记载^［19］。红景天苷是从红景天中提取的苯丙酯类物质，气香甜、味苦涩。已有研究表明其在改善 内皮功能和延缓动脉粥样硬化方面的有效性。Alameddine等^［20］通过Goto-Kakizaki糖尿病大鼠模型验证发现，红景天苷显示出了对血管扩张的有益效果，还有对内皮细胞和血管平滑肌细胞的作用。但并未探究其潜在机制。本研究通过评估红景天苷是否能够在体外抵抗高糖诱导的VSMCs增殖、ROS产生以及线粒体动态失衡，探讨了可能的潜在机制，鉴于红景天苷对Drp1和Mfn2表达的影响，发现红景天苷可能具有预防糖尿病相关血管疾病的治疗潜力。

3.1 红景天苷抑制HG诱导的VSMCs增殖和线粒体自噬

研究中观察到在高糖条件下，VSMCs的增殖水平在没有任何处理的对照组中显著高于低糖环境的对照组，说明高糖环境有效促进了VSMCs的增殖。红景天苷在两个不同浓度（0.3 mmol/L组和0.5 mmol/L组）下均能显著抑制高糖诱导的VSMCs增殖，其中0.5 mmol/L红景天苷的抑制效果更为显著，并显示出明确的浓度依赖性。

在高糖环境中，未经红景天苷和Mdivi-1处理的正常情况下，线粒体可能出现过度的分裂或碎片化，导致形态上呈现更多的球形或断裂的小线粒体，而不是健康状态下的网状或长丝状结构^［21］。Kobayashi等^［22］研究提示，高糖环境会增加细胞的代谢压力，从而可能导致氧化应激增加，细胞应激响应活化。高糖通过促进线粒体分裂增加和融合过程减少，来破坏线粒体稳态进而影响线粒体的动态平衡，使得线粒体分裂过程增加，融合过程减少^［23］。这种情况下，线粒体的形态改变可能与多种病理状态相关，包括糖尿病引起的细胞损伤。已有多项研究证实，线粒体断裂是细胞功能障碍的关键指标^{［24⁃26］}，与多种病理过程相关，包括细胞死亡途径、代谢紊乱和细胞衰老。线粒体动力学的破坏，特别是通过异常的线粒体裂变，可导致有害的结果，如细胞凋亡、线粒体功能障碍和与线粒体相关疾病的发作。基于此推测，高糖诱导的线粒体碎片化，可能是VSMCs病理生理变化的驱动因素之一。Mdivi-1作为一种线粒体分裂抑制剂，能够直接抑制导致线粒体分裂的Drp1蛋白的活性，从而减少线粒体碎片化，促进线粒体网络的稳定和维持^［27］。而红景天苷作为一种抗氧化剂，可能通过减少氧化应激来影响线粒体动态，从而有助于保护线粒体网络免遭损伤。Gu等^［28］在一项红景天苷预处理显著改善脊髓缺血再灌注损伤后小鼠的功能恢复研究中证实，红景天苷通过抗氧化应激减少ROS的产生，从而降低线粒体膜通透性并造成线粒体损伤，还可以增强PINK1-Parkin信号通路，促进线粒体自噬，消除受损的线粒体。BNIP3是一种定位于线粒体外膜的多功能蛋白，它可以作为促凋亡蛋白或促线粒体自噬受体发挥作用。本研究发现，BNIP3 标记的线粒体自噬抗体均为红色荧光，与正常组比较，高糖组细胞红色荧光表达数量显著增加（P<0.05），说明高糖后细胞线粒体自噬发生增加。在经过红景天苷处理后，Bnip3红色荧光表达显著减少（P<0.05），从而抑制线粒体发生自噬。

3.2 红景天苷对VSMCsROS生成及氧化应激的抑制作用

目前有研究表明，高血糖诱导的氧化应激会引发显著的血管损伤^［29］，导致血管内的炎症状态，是动脉粥样硬化的主要驱动因素。高血糖状态下氧化应激作为一种关键的病理反应，在糖尿病引起的血管损害中起重要作用^［30］。Çadirci等^［31］发现当血糖和/或胰岛素水平升高时，VSMCs的增殖过程会被激活，同时细胞内氧自由基的产生与清除过程遭到干扰，引发ROS的积聚及NADPH氧化酶活性的提高。据此推测，采用抗氧化剂降低ROS水平，有望明显抑制NADPH氧化酶的活性，进而抑制VSMCs的异常增殖。虽然高糖条件下VSMCs增殖与ROS水平之间的调控机制尚未完全明晰，但ROS作为线粒体呼吸链中细胞代谢的关键产物，其水平调节被证实与线粒体动态蛋白的调控密切相关。

ROS是线粒体呼吸或代谢的副产物 ^［32］，ROS的产生与线粒体功能和动力学密切相关，影响细胞过程和信号通路。Guo等^［33］研究表明足状突细胞损伤、线粒体形态、mtDNA含量、线粒体呼吸链复合物活性、ROS生成和线粒体膜电位等标志物相互关联，突出了线粒体功能与ROS生成之间的相互作用。

综合既往研究发现，线粒体的分裂增加与ROS水平上升之间存在关联。本研究中观察到Drp1过表达虽然明显增加了ROS水平，但并未导致细胞增殖相应增加。本研究推测这与ROS的浓度效应有关，适中的ROS水平可作为促增殖信号，而过量ROS则可能诱发细胞应激反应，激活如p53介导的细胞周期停滞或凋亡机制^［34］。此外，红景天苷对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用可能不仅仅依赖于其抗氧化功能。在其他机制上，红景天苷可能调控线粒体自噬及细胞周期相关蛋白的表达，进而抑制异常增殖。已有研究表明，一些天然活性物质可激活AMPK/SIRT1通路，在调控细胞能量代谢的同时，改善线粒体动力学^［35］。因此，红景天苷通过激活AMPK/SIRT1上游信号通路，间接调控Drp1和Mfn2的表达，维持线粒体稳态并最终抑制高糖诱导的细胞增殖。本研究进一步发现，ROS水平的改变与VSMCs的增殖直接相关，并与线粒体动态的变化紧密相连。本研究中观察到红景天苷在高糖环境中抑制Drp1和促进Mfn2表达的效果，似乎不受外部ROS水平增加的影响。这可能表明红景天苷在调控这些基因表达方面起到了较为独立的作用，不依赖于ROS水平的变化。值得注意的是，红景天苷通过下调Drp1和上调Mfn2的表达，影响线粒体分裂和融合过程，且这种作用不易被外来ROS抵消。反之，通过抑制Mfn2的表达，可以部分逆转红景天苷对于抑制ROS生成的效果。据此可以推测，红景天苷通过直接作用于线粒体，降低ROS水平，从而在高糖环境中抑制VSMCs的过度增殖，为治疗糖尿病相关血管疾病提供了新的策略。

但需要指出的是，本研究中设定模拟的是急性高糖环境处理，而在慢性高糖条件下，即真实糖尿病长期慢性进展中，细胞可能通过内在补偿机制对Drp1与Mfn2的表达进行调节以维持线粒体稳态。即当急性应激诱导Drp1上调后，细胞会通过提高Mfn2的表达或活性，促进融合以修复或再生线粒体，恢复整体功能和能量代谢^［36］。这一补偿机制的分子基础已被证实，包括信号通路的反馈调控、AMPK和Sirtuins等代谢感应分子已被证明能够参与调控线粒体动力学，并可能在高糖或氧化应激条件下介导Drp1与Mfn2表达之间的反馈平衡，以维持线粒体稳态^［37］。在慢性高糖环境下，细胞经历长时间代谢异常，更容易激活这种补偿调控系统，即使外界因素持续改变单一蛋白的表达，细胞仍尝试通过调整另一方的表达来达到一个新的平衡状态。这种内在补偿机制有助于防止过度的线粒体断裂或融合失调，进而减轻细胞凋亡及功能障碍的风险。在抑制Mfn2和过表达Drp1的实验中，尽管NADPH氧化酶活性增加，但ROS水平没有显著变化，推断是因为其他抗氧化机制的补偿作用或实验的时间窗口不足以观察到显著的ROS水平变化。例如，ROS水平的动态变化可能需要更长时间或不同的检测方法来观察。Mfn2和Drp1表达的调控可能具有时间依赖性，进一步的实验可以通过时间序列分析来揭示红景天苷的具体作用机制。

综上所述，本研究在一定程度上补充了关于线粒体动态对高糖环境下VSMCs增殖影响的研究证据。首次在体外条件下证实了红景天苷能够抑制高糖条件下VSMCs的过度增殖，其抑制效果通过抑制线粒体裂变（下调Drp1和上调Mfn2）及氧化应激实现，研究表明红景天苷能够抑制Drp1对ROS水平的敏感性。值得注意的是，本研究所有数据均来自体外模型，存在一定局限性，将体外成果转化为临床应用仍面临严峻的药代动力学挑战。体内的复杂调控网络和长期病理状态可能引入其他补偿性机制，体内复杂的微环境及多种互作因素可能导致其生物利用度降低，并影响药物的时效性和安全性。因此，后续需要在类器官模型及临床前研究中进一步探讨并验证这些发现。此外，虽然当前结果表明红景天苷与高糖条件下减少的VSMCs增殖相关，但其背后的分子机制仍不清楚。因此，红景天苷在分子水平上的缓解效果尚不完全了解，需要进一步研究。

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基金资助

上海中医药大学产业发展中心医养结合科创资助项目“中药红景天对小鼠血管老化相关基于Ang Ⅱ通路细胞衰老的保护机制研究”(YYKC-2021-01-102)

“十四五”中医特色专科和中医急诊能力提升（第一批）项目计划资助项目“上海中医急危重症平台科学化管理”(ZYJZNLTS1-5)