PTA表达盒的构建及其对本氏烟草SGS3基因的干扰研究

Construction of PTA Expression Cassettes and Their Interference Study on the SGS3 Gene in Nicotiana benthamiana

摘要

RNA干扰作为植物抗病毒免疫的核心机制，其调控网络中SGS3（suppressor of gene silencing）基因在RDR6介导的双链RNA合成过程中扮演关键角色。为深入探究SGS3基因功能，对本氏烟草SGS3基因引入新型多靶点基因沉默系统——PTA（poly‒tRNA‒amiRNA）技术，并与传统单个amiRNA进行RNAi效率的系统性比较。首先针对SGS3基因的锌指（ZF）、XS和卷曲螺旋（coiled coil，CC）等三个结构域各设计合成一个特异性amiRNA，通过分子克隆技术构建pBI121‒SGS3‒amiRNA1/2/3重组表达载体。利用农杆菌介导的瞬时表达系统，对三个重组载体进行功能验证，结果显示amiRNA2对SGS3基因的沉默效率显著高于其他两个靶点。基于此，采用Golden Gate克隆技术，将上述三个amiRNA与三个tRNA串联组装，成功构建PTA‒SGS3表达盒，并整合至pBI121植物表达载体。通过与携带绿色荧光蛋白标记的大豆花叶病毒侵染性克隆SMV‒GFP共侵染本氏烟草，系统检测PTA系统的RNAi效率及抗病毒活性。RT‒qPCR分析表明，相较于单一amiRNA，PTA系统可使SGS3基因沉默效率提升44.8%，显著增强靶基因沉默效果。通过GFP荧光强度定量分析及DAB组织化学染色实验，发现经PTA表达盒侵染的本氏烟草中，SMV病毒积累量较单amiRNA处理组增加50.6%。

Abstract

RNA interference is a core mechanism of antiviral immunity in plants. The SGS3 （suppressor of gene silencing） gene plays a crucial role in the regulatory network of RNA interference during the RDR6-mediated synthesis of double-stranded RNA. To further investigate the function of the SGS3 gene， this paper introduced a novel multi-target gene silencing system—PTA （poly-tRNA-amiRNA） technology—into the SGS3 gene of Nicotiana benthamiana and conducted a systematic comparison of RNAi efficiency with traditional single amiRNA. First， the paper designed and synthesized a specific amiRNA targeting three structural domains of the SGS3 gene： zinc finger （ZF）， XS， and coiled coil （CC）， respectively. It constructed recombinant expression vectors pBI121-SGS3-amiRNA1/2/3 using molecular cloning techniques. Employing an Agrobacterium-mediated transient expression system， the paper performed functional validation of the three recombinant cassettes. The results show that amiRNA2 exhibits significantly higher silencing efficiency of the SGS3 gene compared to the other two targets. Based on this， Golden Gate cloning technology was utilized to assemble the three aforementioned amiRNAs with three tRNAs in tandem， successfully constructing the PTA-SGS3 expression cassette， which was then integrated into the pBI121 plant expression vector. By co-infecting N. benthamiana with Agrobacterium strains harboring the PTA construct and the SMV-GFP infectious clone， which carried a green fluorescent protein marker， the paper systematically assessed the RNAi efficiency and antiviral activity of the PTA system. RT-qPCR analysis indicates that， compared to a single amiRNA， the PTA system improves the silencing efficiency of the SGS3 gene by 44.8%， significantly enhancing the silencing effect on the target gene. Quantitative analysis of GFP fluorescence intensity and DAB histochemical staining experiments reveals that N. benthamiana infected with the PTA expression cassettes shows a 50.6% increase in SMV virus accumulation compared to the single amiRNA treatment group.

Graphical abstract

关键词

本氏烟草 / RNA干扰 / SGS3基因 / amiRNA / PTA表达盒

Key words

Nicotiana benthamiana / RNA interference / SGS3 gene / amiRNA / PTA expression cassette

RNA干扰（RNA interference，RNAi）作为一种重要的植物免疫机制，在抵御病毒侵染中发挥着关键作用。植物中RNAi主要由小干扰RNA（small interfering RNAs，siRNAs）和微小RNA（microRNAs，miRNAs）介导，通过严格调节植物发育，维持基因组稳定性及保护植物免受外源基因的入侵，发挥多重生物学功能^［1⁃2］。RNAi效应由内源或外源的长双链RNA（double⁃stranded RNA，dsRNA）诱导触发，这些dsRNA被RNase Ⅲ型RNA酶Dicer或Dicer样蛋白（DICER⁃like proteins，DCL）切割成21~24 nt的siRNA或miRNA^［3］，随后被Argonaute（AGO）蛋白加载，并结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA induced silencing complex，RISC），该复合物通过碱基互补配对识别靶标基因mRNA或DNA，特异性降解靶标mRNA或抑制翻译实现转录后基因沉默（post transcriptional gene silencing，PTGS），或通过影响DNA甲基化实现转录水平基因沉默（transcription gene silencing，TGS）^［4⁃5］。dsRNA的存在是转录后基因沉默（PTGS）的主要触发因素，其中大部分由RDR6与RNA结合蛋白沉默基因的抑制子3（SGS3）共同作用^［6⁃7］。SGS3是RNA沉默途径中的一个核心蛋白，尤其是在转录后基因沉默（PTGS）中扮演重要角色，其功能与RDR6的功能交织在一起^［8］。SGS3通常包含三个结构域，分别是锌指结构域（ZF）、与水稻基因X产物相似的XS结构域（XS）和卷曲螺旋结构域（CC）。其中，XS结构域参与RNA结合，而CC结构域参与同源二聚体形成，ZF结构域的功能尚不清楚^［9⁃10］。SGS3在RNAi介导的抗病毒机制中的作用尚不完全清楚。因此，本文研究本氏烟草SGS3基因在RNAi介导的抗病毒作用中对大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus，SMV）感染的作用。

人工小RNA（artificial microRNA，amiRNA）是另一种重要的RNA沉默工具。与siRNA不同，amiRNA技术是一种基于内源miRNA前体骨架的新型基因沉默技术。该技术通过将内源miRNA前体茎环结构中的miRNA/miRNA*序列替换为人工设计的amiRNA/amiRNA*序列，经生物体内加工后产生具有特定功能的人工miRNA，从而实现对靶基因表达的调控，可有效抑制靶标基因的表达^［11］。amiRNA技术具有唯一性、有效性和精确性，目前已在植物生长发育调控、作物遗传改良、代谢通路基因功能解析以及生物/非生物胁迫耐受性研究等领域展现出重要应用价值^［12］。

针对单个amiRNA仅能靶向干扰单一基因位点的局限性，本研究引用了一种基于amiRNA的PTA技术以提升基因沉默效率。该技术借助Golden Gate克隆技术同时组装多个片段，将多个tRNA片段与针对不同靶标序列设计的amiRNA序列串联，构建成PTA多顺反子表达盒。当进行转录时，tRNA两端的特异性识别序列被2个核糖核酸酶（RNaseP和RNaseZ）切割，同步释放出多个独立的amiRNA。这些amiRNA可分别靶向结合各自的特异性靶标位点，实现对同一基因多位点或多个不同基因的同时干扰，目前该技术仅应用于玉米黏虫和拟南芥，还未见其他相关报道^{［13⁃14］}。PTA技术通过整合多靶点沉默机制，突破了传统单靶点干扰的效率瓶颈，为复杂基因网络调控研究及多基因协同改良提供了高效工具。本研究针对本氏烟草RNAi相关途径病毒防御相关的SGS3基因构建PTA表达盒，并比较其与单个amiRNA之间的RNAi效应，探究表达多个基因的amiRNA的PTA表达盒是否产生更高效的RNA干扰效应。

1 材料与方法

1.1 植物栽培和试剂

研究所使用的烟草为17wt本氏烟草，种植于本实验室人工气候室，生长最佳温度为（25±2） ℃，相对湿度为70%~80%，光周期为16 h∶8 h（光∶暗）。Taq聚合酶、Trizol试剂、cDNA反转录试剂盒、 BsaⅠ酶、T₇连接酶和RT⁃qPCR检测试剂盒等试剂购自TaKaRa公司。大肠杆菌DH5α和农杆菌GV310以及2K⁃Trans Marker购自全式金公司。T⁃miR159b和pGTR载体由华中农业大学谢卡宾教授惠赠，双元表达载体pBI121保存于本实验室。引物合成由南京金斯瑞公司完成，DNA测序由北京擎科生物科技公司完成。

1.2 靶基因SGS3特异的amiRNA重组载体的构建

利用本氏烟草基因组数据库（www.benthgenome.com）针对SGS3基因设计3个amiRNA序列。根据amiRNA序列设计引物，通过PCR扩增获得目的片段，经双酶切回收后，连接至XbaⅠ和KpnⅠ线性化的pBI121载体，构建重组载体pBI121⁃amiRNA1/2/3。利用菌落PCR、酶切验证和测序等方式确认克隆的正确性。

1.3 PTA表达盒的构建及本氏烟草瞬时干扰分析

以T⁃miR159b和pGTR质粒为模板，通过引物分别扩增3个amiRNA和3个tRNA片段（表1），经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离后将符合预期大小的片段进行胶回收。将6个回收产物按1∶1摩尔比混合，通过BsaⅠ/T₇酶一步法进行Golden Gate组装。具体组装的反应体系和反应程序如下：6个片段胶回收产物各40~50 ng，BSA 2 µL；2×T₇ DNA ligase Buffer 10 µL，BsaΙ 0.5 µL；T₇ DNA 连接酶0.5 µL，ddH₂O补足至20 µL。混合后于37 ℃、5 min酶切和20 ℃、10 min连接；并于20 ℃延伸1 h。组装产物稀释10倍后，利用上述扩增长片段的引物PCR扩增，获得845 bp的PTA多顺反子表达盒，连接至pMD19⁃T载体并经酶切、PCR扩增及测序验证。验证正确的PTA片段亚克隆至pBI121表达载体，构建pBI121⁃PTA⁃AGO重组质粒并转化GV3101农杆菌。利用该菌株与表达GFP的SMV病毒共侵染3~4叶期本氏烟草，侵染液中加入1∶100的1 mol/L MES和MgCl₂，以及1∶1 000的200 mmol/L乙酰丁香酮。平行对照实验使用单一的AGO1或AGO2基因的pBI121⁃amiRNA重组载体。

1.4 实时荧光定量PCR和量化GFP荧光强度

在本氏烟草瞬时表达系统中，通过实时荧光定量PCR检测pBI121⁃PTA⁃SGS3或pBI121⁃amiRNA的靶基因沉默效应。侵染本氏烟草6天后收集侵染部位的叶片，使用Trizol法提取总RNA并反转录生成cDNA，以NbActin（登录号NM_102866.3）作为内参，比较PTA与单个amiRNA的沉默效果。利用Gel⁃Pro Analyzer软件，对SMV⁃GFP与PTA表达盒或单个amiRNA共侵染部位的GFP荧光转换为灰度密度，用t检验比较法比较单个amiRNA和PTA表达盒侵染的叶片GFP荧光强度值。

2 结果分析

2.1 利用特异性amiRNA在本氏烟草中瞬时沉默靶基因

本研究以本氏烟草RNAi途径中的关键基因SGS3为靶标，分别在其3个不同结构域ZF、XS以及CC（图1a）各设计1个amiRNA序列，以拟南芥miR159b骨架为模板扩增3个amiRNA序列，将其分别克隆至双元表达载体pBI121中。菌落PCR、质粒PCR均表明其大小与预期大小相符（204 bp），进一步测序验证表明成功构建了3个重组载体，分别命名为pBI121‒SGS3‒amiRNA1、pBI121‒SGS3‒amiRNA2和pBI121‒SGS3‒amiRNA3（图1b）。

为确定最佳干扰时间点，本文将上述3个重组质粒分别转化至农杆菌GV3101后，注射侵染17wt本氏烟草叶片。分别于侵染后3、5、7、9 d取样，通过RT⁃qPCR分析SGS3基因表达水平。NbActin基因作为内参基因，根据2^-ΔΔt方法计算靶标基因的表达情况，通过t检验计算对照组和处理组之间的显著性差异，每组实验做 3个技术重复、3个生物重复。结果显示，侵染第5 d时干扰效果最为显著（图2），故后续实验将采用侵染5 d后取样，检测靶基因的干扰效果。

将各个amiRNA重组体侵染本氏烟草5 d后取样，采用RT⁃qPCR分析靶基因表达水平，评估3个amiRNA的干扰效率，结果如图3所示。接种空载体pBI121（EV）的植株作为对照组，对照中的SGS3表达量被设定为1，本氏烟草NbActin基因作为内参，t检验同上。RT⁃qPCR结果显示，SGS3基因的3个amiRNA中，amiRNA2的干扰效果最佳，与对照组相比，靶基因的表达量下降了74.5%，而amiRNA1和amiRNA3的靶基因表达量分别下降了27%和38.5%。

2.2 构建本氏烟草SGS3基因特异性PTA表达盒

本研究引用了一种基于PTA的多靶基因沉默系统，其核心是采用Golden Gate克隆技术实现无缝组装。Golden Gate克隆利用Ⅱs型限制性内切酶（如BsaⅠ）在识别位点外切割DNA产生黏性末端，同时通过T₇连接酶将多个目的DNA片段按既定顺序连接，实现无痕拼接。该系统的多顺反子tRNA⁃amiRNA转录后，tRNA被RNaseP和RNaseZ特异性识别并切割，释放多个amiRNA同时干扰相应靶基因。期望与单一amiRNA相比，实现更显著的转录后基因沉默效果（图4）。

利用表1引物扩增构建PTA⁃SGS3表达盒所需的3个amiRNA和3个tRNA片段，琼脂糖凝胶电泳检测显示，PCR产物大小与预期一致，其中amiRNA1与amiRNA2均为187 bp，amiRNA3为210 bp；tRNA1为124 bp，tRNA2和3个tRNA片段进行回收纯化后，采用Golden Gate克隆技术，按照预先设计的顺序将6个片段进行串联组装。随后使用PTA1和PTA13引物进行PCR扩增，成功获得SGS3基因对应的PTA表达盒。

将胶回收的PTA表达盒克隆至pMD19⁃T载体，经PCR扩增、酶切及测序验证，成功构建pMD19⁃T⁃PTA⁃SGS3（图5b，c）。从该重组载体中扩增PTA⁃SGS3表达盒，连接至pBI121表达载体，PCR结果显示，750~1000 bp区间存在特异性条带与预期大小相符（845 bp），XbaI/KpnI双酶切产物大小符合预期（图5d，e），DNA测序进一步证实PTA⁃SGS3表达盒成功整合至pBI121表达载体。

2.3 SGS3基因特异性PTA表达盒对抗SMV活性的影响

为了验证靶标基因amiRNA对应的PTA表达盒是否能够提高RNAi效率，本文将PTA表达盒（pBI121⁃PTA⁃SGS3）和前期验证干扰效果最佳的单个amiRNA的重组载体pBI121⁃SGS3⁃amiRNA2，分别与表达绿色荧光蛋白（GFP）的大豆花叶病毒（SMV⁃GFP）载体共侵染本氏烟草。对本氏烟草侵染部位的GFP荧光强度分析发现，相对于表达单个amiRNA，串联表达SGS3基因3个amiRNA的PTA表达盒的病毒积累量更多，也即GFP荧光强度更强（图6a），表明SGS3基因下调使其抗SMV的能力下降。其他pBI121⁃SGS3⁃amiRNA1和pBI121⁃SGS3⁃amiRNA3也做了与病毒共侵染实验，但未见明显的表型效果。利用Gel⁃Pro Analyzer软件对其荧光强度进一步分析也发现，与pBI121⁃SGS3⁃amiR2相比，pBI121⁃PTA⁃SGS3荧光强度提高了50.6%（图6c）。与此同时，侵染本氏烟草叶片4 d后，选择出现明显表型的叶片进行DAB染色观察，发现侵染PTA⁃SGS3的叶片坏死相较于单个amiRNA更严重，与GFP荧光强度的结果一致（图6b）。最后，通过对靶标基因进行表达量分析发现，注射PTA⁃SGS3的本氏烟草的SGS3基因的表达水平相较于单个amiRNA下调了44.8%（图6d）。

GFP蛋白荧光强度分析、SMV‒GFP积累情况、DAB染色以及靶标基因表达量分析均非常直观证明PTA表达盒的RNAi效率高于单个amiRNA。PTA表达盒能更明显降低靶标基因的表达，并导致RNAi途径的缺失，从而导致病毒更容易侵染植物，进一步表明SGS3基因参与了本氏烟草RNAi的关键步骤，且可能参与抗病毒过程。

3 讨论

RNAi作为植物抗病毒免疫的关键机制，在植物抵御病毒入侵过程中发挥着核心作用^［15］。本研究首次明确了本氏烟草中SGS3基因抗SMV功能，可为解析RNAi抗病毒通路中该基因作用机制提供直接实验证据。本研究聚焦本氏烟草SGS3基因在抗SMV途径中的功能，通过引入PTA技术，并与传统单amiRNA进行对比，深入探究其在RNAi效率及抗病毒活性方面的差异。针对SGS3基因的不同结构域设计特异性amiRNA，为精准调控SGS3基因表达奠定了基础。瞬时表达实验结果显示amiRNA2沉默效率最高，这表明针对不同结构域设计的 amiRNA在沉默效果上存在显著差异。这可能与SGS3基因各结构域的功能重要性、空间构象以及amiRNA与靶序列的互补程度等多种因素相关^［16］。不同结构域在SGS3蛋白行使功能过程中扮演着不同角色，如ZF、XS和CC结构域可能参与了蛋白‑蛋白相互作用、RNA结合等关键过程，对这些结构域的有效干扰可能会对SGS3基因功能产生不同程度的影响。值得注意的是，靶向XS结构域的amiRNA2表现出最高的沉默效率（图2c），暗示该结构域可能在SGS3介导的dsRNA合成中发挥核心功能，这一发现为解析SGS3的分子机制提供了新方向。PTA技术的引入是本研究的一大亮点。通过Golden Gate克隆技术将多个amiRNA与tRNA串联组装成PTA‒SGS3表达盒，qRT‒PCR结果清晰地表明，与单一amiRNA相比，PTA系统显著增强了基因沉默效果。这一结果充分体现了PTA技术在多靶点基因沉默方面的独特优势。多个amiRNA的协同作用能够从多个位点对靶基因进行干扰，增加了与靶基因mRNA互补配对的机会，从而更有效地抑制靶基因的表达^［17］。这与近年来关于多靶点沉默技术在增强RNAi效率中的优势报道一致^［13］。tRNA的引入可能有助于稳定amiRNA的表达和加工过程，进一步提高了基因沉默的效率和稳定性。在抗病毒活性方面，GFP荧光强度分析和DAB染色实验结果显示，PTA表达盒侵染后SMV积累量更多，这意味着PTA表达盒更易导致RNAi途径缺失，使病毒更易侵染植物。DAB染色结果显示，PTA‒SGS3处理叶片中H₂O₂积累量减少（图5c），提示SGS3可能通过调控活性氧（ROS）信号通路参与抗病毒防御。这一现象看似与预期相悖，但深入分析可知，SGS3基因在植物抗病毒RNAi途径中具有重要功能，当利用PTA技术强烈抑制SGS3基因表达时，植物正常的抗病毒RNAi途径受到破坏，从而无法有效地抵御SMV的入侵。这一结果从反面证实了本氏烟草SGS3基因在抗SMV途径中确实存在关键功能，为解析SGS3基因在抗病毒RNAi途径中的作用提供了有力的新证据^［18］。从农业生物技术应用的角度来看，本研究成果具有重要意义。一方面，PTA技术作为一种高效的基因沉默工具，为植物抗病毒机制研究提供了新的手段。通过精准调控植物体内关键基因的表达，能够深入研究植物与病毒之间的相互作用机制，为开发新型抗病毒策略提供理论基础。另一方面，对于作物抗病育种而言，明确SGS3基因的功能以及PTA技术的有效性，为培育具有更强抗病毒能力的作物品种提供了新策略。可以通过基因编辑等技术手段，在作物中优化SGS3基因的表达或者利用PTA技术构建高效的抗病毒体系，从而提高作物对病毒病害的抗性，减少农业生产中的损失^［19］。

参考文献

[1] JIN Y， ZHAO J H， GUO H S. Recent advances in understanding plant antiviral RNAi and viral suppressors of RNAi［J］. Current Opinion in Virology， 2021， 46： 65-72.

[2] WANG C N， JIANG F， ZHU S F. Complex small RNA-mediated regulatory networks between viruses/viroids/satellites and host plants［J］. Virus Research， 2022， 311： 198704.

[3] PARENT J S， BOUTEILLER N， ELMAYAN T， et al. Respective contributions of Arabidopsis DCL2 and DCL4 to RNA silencing［J］. The Plant Journal， 2015， 81（2）： 223-232.

[4] TAN H J， LI B S， GUO H W. The diversity of post-transcriptional gene silencing mediated by small silencing RNAs in plants［J］. Essays in Biochemistry， 2020， 64（6）： 919-930.

[5] BOLOGNA N G， VOINNET O. The diversity， biogenesis， and activities of endogenous silencing small RNAs in Arabidopsis ［J］. Annual Review of Plant Biology， 2014， 65： 473-503.

[6] KUMAKURA N， TAKEDA A， FUJIOKA Y， et al. SGS3 and RDR6 interact and colocalize in cytoplasmic SGS3/RDR6-bodies［J］. FEBS Letters， 2009， 583（8）： 1261-1266.

[7] JOUANNET V， MORENO A B， ELMAYAN T， et al. Cytoplasmic Arabidopsis AGO7 accumulates in membrane-associated siRNA bodies and is required for ta-siRNA biogenesis［J］. The EMBO Journal， 2012， 31（7）： 1704-1713.

[8] YOSHIKAWA M， PERAGINE A， PARK M Y， et al. A pathway for the biogenesis of trans-acting siRNAs in Arabidopsis ［J］. Genes & Development， 2005， 19（18）： 2164-2175.

[9] ELMAYAN T， ADENOT X， GISSOT L， et al. A neomorphic SGS3 allele stabilizing miRNA cleavage products reveals that SGS3 acts as a homodimer［J］. The FEBS Journal， 2009， 276（3）： 835-844.

[10] ZHANG D P， TRUDEAU V L. The XS domain of a plant specific SGS3 protein adopts a unique RNA recognition motif （RRM） fold［J］. Cell Cycle， 2008， 7（14）： 2268-2270.

[11] SABLOK G， PÉREZ-QUINTERO Á L， HASSAN M， et al. Artificial microRNAs （amiRNAs） engineering：On how microRNA-based silencing methods have affected current plant silencing research［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2011， 406（3）： 315-319.

[12] 林艺华， 郑涛， 高三基， 等. 人工miRNA技术及其在植物抗病育种中的应用［J］. 生物技术通报， 2017， 33（2）： 47-52.

[13] BAO W H， LI A G， ZHANG Y N， et al. Improvement of host-induced gene silencing efficiency via polycistronic-tRNA-amiR expression for multiple target genes and characterization of RNAi mechanism in Mythimna separata ［J］. Plant Biotechnology Journal， 2021， 19（7）： 1370-1385.

[14] ZHANG N N， ZHANG D D， CHEN S L， et al. Engineering artificial microRNAs for multiplex gene silencing and simplified transgenic screen［J］. Plant Physiology， 2018， 178（3）： 989-1001.

[15] DING S W， VOINNET O. Antiviral immunity directed by small RNAs［J］. Cell， 2007， 130（3）： 413-426.

[16] BARTEL D P. microRNAs genomics， biogenesis， mechanism， and function［J］. Cell， 2004， 116（2）： 281-297.

[17] SCHWAB R， OSSOWSKI S， RIESTER M， et al. Highly specific gene silencing by artificial microRNAs in Arabidopsis ［J］. The Plant Cell， 2006， 18（5）： 1121-1133.

[18] SCHWACH F， VAISTIJ F E， JONES L， et al. An RNA-dependent RNA polymerase prevents meristem invasion by potato virus X and is required for the activity but not the production of a systemic silencing signal［J］. Plant Physiology， 2005， 138（4）： 1842-1852.

[19] BRODERSEN P， VOINNET O. The diversity of RNA silencing pathways in plants［J］. Trends in Genetics， 2006， 22（5）： 268-280.

基金资助

国家自然科学基金资助项目“鳞翅目昆虫RNAi效率的优化及寄主介导的多靶基因沉默（MTS）体系的建立”(32260667)

内蒙古师范大学基本科研业务费专项资金资助项目“利用VIGS技术挖掘玉米黏虫有效致死基因”(2023JBYJ019)

大学生创新训练资助项目“利用核酸农药技术筛选靶向玉米黏虫的关键基因”(S202310135030)