白鹭和池鹭卵壳的显微结构比较

Microstructure Comparison of Egretta garzetta and Ardeola bacchus Eggshells

摘要

鸟类卵壳是物质交换和保护内部组织的重要结构，其结构特征会因物种的不同而产生差异。选取白鹭（Egretta garzetta）和池鹭（Ardeola bacchus）的卵作为研究对象，利用扫描电镜比较2种鹭科鸟类卵壳的赤道端、钝端和尖端3个区域的卵壳及壳膜的显微结构特征。结果表明：（1）卵壳的尖端、赤道端和钝端3个区域的气孔形态特点以及气孔长径，可为白鹭和池鹭的鉴定提供依据；（2）卵壳不同部位的壳膜纤维密度、粗细、芽状突起密度等特征可初判二者，卵壳赤道端区域的壳膜纤维直径可为白鹭和池鹭的鉴定提供依据；（3）卵壳3个区域的卵壳厚度、卵壳壳膜厚度可为白鹭和池鹭的鉴定提供依据。综上，不同鸟类卵壳的显微特征存在一定的差异，可为卵壳所属鸟类的鉴别提供依据。

Abstract

Avian eggshells are vital structures for material exchanges and internal tissue protection， and their structural characteristics differ across species. Eggs of Egretta garzetta and Ardeola bacchus were selected as the research objects. Scanning electron microscopy （SEM） was adopted to compare the microstructural characteristics of eggshells and shell membranes at three zones （the equator， blunt end， and sharp end） of the two ardeid birds. The results showed that the morphological characteristics and long diameters of pores at the sharp end， equator， and blunt end of eggshells could provide an identification basis for identifying E. garzetta and A. bacchus. Characteristics including fiber density， fiber thickness， and bud-like protuberance density of shell membranes at different eggshell positions enabled preliminary discrimination between the two species， and the fiber diameter of shell membranes at the equatorial zone of eggshells provided a reference for identifying the two species. Additionally， the thicknesses of the eggshell and shell membrane at the three zones could provide a basis for identifying E. garzetta and A. bacchus. The results indicated that distinct microstructural differences were detected in eggshells of different bird species， and could provide a basis for the identification of bird species that the eggshells belonged to.

Graphical abstract

关键词

白鹭 / 池鹭 / 卵壳 / 显微结构

Key words

Egretta garzetta / Ardeola bachus / eggshell / microstructure

近年来，非法收购、掏窝猎捕、野外捡拾野生鸟蛋等严重危害生态环境的司法案件屡禁不止，打击破坏野生动物资源的行为刻不容缓。长期以来，鸟卵的形态、结构与功能一直是鸟类学家感兴趣的研究内容，自19世纪开始便有学者对鸟卵的形态、结构进行研究，并形成了鸟类学的一个分支学科——鸟卵学^［1］。鸟类卵壳的显微结构是鸟类生态学、生物学及遗传进化研究的重要组成部分，鸟类卵壳作为胚胎发育的天然屏障，其独特的结构不仅影响胚胎的生长和发育，还反映了物种对不同生存环境的适应和进化^［2］。研究表明，鸟类卵壳的显微结构在不同物种间存在显著差异，这些差异不仅揭示了物种的进化过程，也为理解鸟类在不同环境条件下的生理调节机制提供了重要依据^［3］。各国学者自20世纪40年代开始利用显微镜观察鸟类卵壳的显微结构^［4⁃6］，涉及的物种包括藏马鸡（Crossoptilon harmani）^［7］、褐马鸡（Crossoptilon mantchuric）^［8］、白琵鹭（Platalea leucorodia）^［9］、黄嘴白鹭（Egretta eulophotes）^［10］、 白冠长尾雉（Syrmaticus reevesii）^［11］、岩鹭（Egretta sacra）^［12］、丹顶鹤（Grus japonensis）^{［13⁃14］}、鸳鸯（Aix galericulata）^［15］等。

本研究选用的白鹭（Egretta garzetta）和池鹭（Ardeola bacchus）均被列为2023年新修订的《有重要生态、科学、社会价值的陆生野生动物名录》（简称“三有动物”），是案件中较为常见的种类。对白鹭的研究包括卵壳的重金属分布特征^［16］，羽毛重金属分析^［17］，营巢高度和营巢材料^［18］等；池鹭的研究包括羽毛重金属分析^［17］，卵壳成分和超微结构^［19］等。此外，朱曦等^［20］初步研究了白鹭和池鹭卵壳的表面形态、卵壳重量、卵壳厚度、卵壳断面基本结构与壳膜纤维微观形态。在此基础上，本研究测量卵壳气孔长径、壳膜纤维直径、卵壳厚度和壳膜厚度等，旨在丰富鹭科鸟类卵壳显微结构资料，为鹭科内不同属的鸟类、鹭科与其他不同科鸟类卵壳的认定提供佐证。

1 材料与方法

1.1 研究材料

研究材料来自南京警察学院鉴定中心，材料已经过DNA序列检测，确定其所属的物种，本研究共收集了白鹭和池鹭各3枚卵壳。

1.2 材料与数据的处理

1.2.1 材料的处理

将卵壳等距离划分成3个环形区，即尖端、赤道端和钝端。将蒸馏水倒入超声波清洗机中，清洗卵壳，擦去残留内容物。在卵壳湿润状态下，用镊子将卵壳与壳膜分离，将3个区域的卵壳与壳膜充分晾干后备用。所制样品利用离子溅射仪（HITACHI E-1010）进行喷金45 s，然后用扫描电子显微镜（型号为S3400N Ⅱ）观察。

1.2.2 数据采集与分析

采集白鹭和池鹭卵壳各3个区域的卵壳气孔长径、壳膜纤维直径、卵壳厚度和壳膜厚度4类数据各40组。利用SPSS进行数据统计分析，卵壳气孔长径结果用平均值与区域概率进行比较分析，壳膜纤维直径、卵壳厚度和壳膜厚度结果用平均值±标准差表示，采用方差齐性检验（F检验）进行相关性分析。

2 结果分析

2.1 卵壳气孔研究

卵壳气孔结构如图1所示。白鹭卵壳赤道端气孔呈现几何规律性（图1A1），多数呈圆形或椭圆形轮廓，少有月牙形等不规则形状。数据显示：白鹭卵壳赤道端气孔长径大小平均值为829 nm，在318~1 440 nm之间波动，318~<800 nm的占42.5%，800~<1 440 nm的占57.5%。池鹭卵壳（图1B1）的赤道端气孔分布具有独特的过渡性特征。从形态学角度看，气孔开口呈现丰富的多样性特征：多数呈规则的圆形或椭圆形轮廓，少数呈不规则形态，气孔长径大小差距明显。数据显示：池鹭卵壳赤道端气孔长径大小平均值为968 nm，在437~2 620 nm之间波动，437~<800 nm的占47.5%，800~<1 600 nm的占45%，1 600~<2 620 nm的占7.5%。

白鹭卵壳钝端区域气孔形态多样化，既有细长的柳叶状开口，也有蜿蜒的不规则多边形结构（图1A2）。数据显示：卵壳钝端区域气孔长径大小平均值为1 287 nm，在624~2 880 nm之间波动，624~<800 nm的占15%，800~<1 000 nm的占22.5%，1 000~<2 880 nm的占62.5%。池鹭卵壳钝端区域气孔分布呈显著的聚集特征，密度明显高于其他部位，形成密集的分布模式（图1B2）。观察发现，气孔的开口形状以不规则的圆形或椭圆形为主，整体观察气孔长径的大小小于尖端和赤道端。这种独特的形态特征可能与其在胚胎发育过程中高效的气体交换需求密切相关。数据显示：卵壳钝端区域的气孔长径大小平均值为931 nm，在384~1 770 之间波动，384~<800 nm的占40%，800~<1 000 nm的占25%，1 000~<1 770 nm的占35%。

白鹭卵壳尖端气孔以类圆形为主，但形态规整度稍有下降，细长型开口的出现频率较钝端区域明显增多（图1A3）。所测数据显示卵壳尖端部分的气孔长径大小平均值为938 nm，在588~1 480 nm之间波动，588~<1 000 nm的占67.5%，1 000 ~<1 480 nm的占32.5%。池鹭卵壳尖端区域气孔的分布呈现独特的空间特征，相较于钝端部分，该部分气孔密度明显变小，均匀地散布在卵壳表面，大小相差明显，多数呈规则的圆形轮廓，但也有细长形态（图1B3）。卵壳尖端部分的气孔长径大小平均值为1 974 nm，在1 010~4 430 nm之间波动，1 010~<1 500 nm的占5%，1 500~<3 000 nm的占65%，3 000~<4 330 nm的占30%。

2种鹭科鸟类相同部位的外卵壳气孔长径大小的统计分析表明，卵壳的赤道端（F=7.25，P<0.01）、钝端（F=12.09，P<0.01）和尖端区域（F=47.82，P<0.01）的气孔长径在白鹭和池鹭间均存在极显著差异，故卵壳3个区域的气孔长径可为白鹭和池鹭的鉴定提供依据。

2.2 壳膜纤维直径研究

白鹭和池鹭的壳膜由粗细不等的蛋白质纤维交织并重叠排列形成多层网络结构，壳膜纤维从内到外逐渐变粗，纤维上有芽状突起（图2）。

白鹭（图2A1）和池鹭（图2B1）卵壳赤道端区域壳膜的纤维粗细程度相差较大（最粗纤维和最细纤维的差别），同时芽状突起的数量较少，不易观察到。白鹭赤道端区域壳膜的纤维直径为（2.43±0.83） nm，池鹭赤道端区域壳膜的纤维直径为（1.71±0.52） nm。白鹭（图2A2）和池鹭（图2B2）卵壳钝端区域的纤维密度和纤维的粗细程度差别不大，呈多方向错综相交。白鹭钝端区域壳膜的纤维直径为（1.96±0.30） nm，池鹭钝端区域壳膜的纤维直径为（2.33±0.70） nm。白鹭（图2A3）卵壳尖端区域壳膜纤维密度较低，纤维的粗细差别较大，池鹭（图2B3）纤维的粗细差别不大；白鹭的纤维表面具有较明显的均匀分布的芽状突起，池鹭的不明显。白鹭尖端区域壳膜的纤维直径为（2.34±0.69） nm，明显较粗。池鹭尖端区域壳膜的纤维直径为（2.05±0.43） nm。

白鹭和池鹭卵壳相同部位的壳膜纤维直径的统计分析显示，赤道端区域壳膜纤维直径（F=1.84，P<0.01）在白鹭和池鹭间差异极显著，而钝端（F=1.32，P>0.05）和尖端（F=2.27，P>0.05）区域壳膜纤维直径在白鹭和池鹭间差异均不显著。因此，赤道端区域壳膜纤维直径可为白鹭和池鹭的鉴定提供依据。

2.3 卵壳厚度分析

白鹭3个区域的卵壳厚度均大于池鹭。白鹭卵壳赤道端区域卵壳厚度为（193.63±11.38） nm，池鹭卵壳赤道端厚度为（159.68±12.88） nm；白鹭卵壳钝端区域卵壳厚度为（189.18±16.59） nm，池鹭卵壳钝端厚度为（142.80±11.88） nm；白鹭卵壳尖端区域卵壳厚度为（180.73±17.29） nm，池鹭卵壳尖端厚度为（141.95±10.46） nm。

对白鹭和池鹭相同部位的卵壳厚度的统计分析表明，赤道端区域（F=1.27，P<0.01）、钝端区域（F=1.27，P<0.01）和尖端区域（F=2.62，P<0.01）的卵壳厚度在白鹭和池鹭间均存在极显著差异，因此可以用该指标区分白鹭和池鹭。

2.4 壳膜厚度分析

鸟类壳膜厚度存在差异是多种因素共同作用的结果，如保护需求的差异、水分调控的需求等，体现了鸟类对不同生态环境、繁殖策略和发育需求的适应性演化。

白鹭3个区域壳膜的厚度均较池鹭的大。白鹭卵壳赤道端区域的壳膜厚度为（91.38±9.30） nm，池鹭卵壳赤道端区域的壳膜厚度为（64.73±11.74） nm；白鹭卵壳钝端区域的壳膜厚度为（69.34±14.37） nm，池鹭卵壳钝端区域的壳膜厚度为（55.23±10.08） nm；白鹭卵壳尖端区域的壳膜厚度为（84.19±21.34） nm，池鹭卵壳尖端区域的壳膜厚度为（57.98±10.08） nm。

白鹭和池鹭相同部位的卵壳厚度的统计分析显示，赤道端（F=1.45，P<0.01）、钝端（F=1.82，P<0.01）和尖端（F=4.08，P<0.01）区域的壳膜厚度在白鹭和池鹭间均存在极显著差异，可为二者的鉴定提供依据。

3 讨论

卵壳表面的气孔是胚胎与外界交换的“桥梁”，不仅可以确保氧气进入并排出二氧化碳，维持胚胎呼吸需求，而且在调节水分平衡中发挥重要作用，防止卵壳内环境过干或过湿，保障胚胎正常代谢。本研究表明卵壳的气孔形态、气孔长径、壳膜纤维直径、卵壳厚度、壳膜厚度等可为白鹭和池鹭的鉴别提供依据，但需要多个指标综合考虑。不同鸟类物种的卵壳在结构、颜色、厚度、气孔密度等方面存在显著差异，这是长期自然选择与生态适应共同作用的结果^［21］。

本研究中白鹭的壳膜纤维直径为（2.25±0.68） nm、池鹭的壳膜纤维直径为（2.03±0.62） nm，与白冠长尾雉的壳膜纤维直径（1.69±0.48） nm^［11］存在一定差别。东方白鹳卵壳厚度的平均值为260.8 nm、白枕鹤的平均值为195.1 nm、雪雁的平均值为230.6 nm^［22］，大鸨卵壳的平均厚度为（420±40） nm、波斑鸨的平均厚度为（230±40） nm^［23］，其厚度均较白鹭（187.84 nm）、池鹭（148.14 nm）的卵壳厚，而岩鹭卵壳厚度（168.6 nm）^［12］较池鹭的厚，较白鹭的薄。本研究中白鹭的壳膜厚度平均为（81.64±18.27） nm、池鹭的壳膜厚度平均为（70.44±18.52） nm，与白琵鹭壳膜层厚度60~70 nm^［9］及白冠长尾雉壳膜层厚度50.0~87.5 nm^［11］相差不大。

鸟卵是涉及野生动物案件中常见的物证之一，确定鸟卵所属的鸟类种属，对于案件的定罪量刑具有重要的意义。鸟卵的显微结构因其具有一定的种属特异性，可为鸟类的鉴定提供依据，对构建鸟类卵壳的特征指标数据库具有重要的价值，可为公安、海关缉私、林业等部门打击破坏鸟类资源的案件提供基础数据，提高整体案件侦破效率，也为珍稀鸟类的保护奠定基础。

4 结论

（1）卵壳的赤道端、钝端和尖端3个区域的气孔形态特点以及气孔长径可为白鹭和池鹭的鉴定提供依据。

（2）卵壳的不同部位的壳膜纤维的密度、粗细、芽状突起密度等特征可初判二者，卵壳赤道端区域的壳膜纤维直径可为白鹭和池鹭的鉴定提供依据，而钝端区域和尖端区域的壳膜直径无法直接区分白鹭和池鹭。

（3）卵壳3个区域的卵壳厚度、卵壳壳膜厚度可为白鹭和池鹭的鉴定提供依据。

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基金资助

江苏省高校优秀科技创新团队资助项目“打击生态环境犯罪物证技术创新团队”(2019⁃29)