miR-200a通过靶向CDC45调节绒山羊皮肤色素沉着

miR-200a Regulates Skin Pigmentation in Cashmere Goats by Targeting CDC45

摘要

为了揭示miR-200a是否通过靶向调控CDC45基因来影响辽宁绒山羊黑色素生成的生物学过程，选取黑、白色辽宁绒山羊采集背部皮肤组织，同时利用已保存的HEK293T细胞（人胚肾细胞）与B16细胞（黑色素瘤细胞）作为体外研究模型。首先通过运用miR数据库挖掘，预测到CDC45基因的3'UTR存在一个高度保守的miR-200a特异性结合位点；为验证二者之间的相互作用，在HEK293T细胞中构建了双荧光素酶报告基因系统进行验证；然后采用免疫荧光技术，对各组B16细胞内CDC45基因表达的特定分子（蛋白质、抗原等）进行精确定位与可视化表达分析；同时通过克隆形成试验，评估各组B16细胞的增殖潜能。最后借助qRT-PCR及Western blot等技术，全面评估CDC45基因在羊皮组织及B16细胞中的表达水平。结果表明，miR-200a的过表达在转录后（mRNA）及翻译后（蛋白质）水平均显著抑制了CDC45的活性，而针对该结合位点的突变处理则完全消除了这一抑制效应；在B16细胞模型中，miR-200a诱导的CDC45表达下调与黑色素细胞增殖能力的显著减弱呈现出紧密关联。从分子机制层面深入分析，结果发现，通过miR-200a-mimic转染来降低CDC45表达的效果，与miR-200a直接过表达所产生的影响高度一致，表明miR-200a与CDC45之间存在明确的功能性联系。综上，该研究结果证实了miR-200a能够特异性靶向调控CDC45基因。

Abstract

To investigate whether miR-200a regulates melanin production in Liaoning cashmere goats through targeting the CDC45 gene, in this study, dorsal skin tissues from black and white goats were collected and preserved HEK293T cells (human embryonic kidney cells) and B16 cells(melanoma cells) were used as in vitro models. Through miR database mining, a highly conserved miR-200a-binding site in the 3'UTR of CDC45 was predicted. To validate this interaction, a dual-luciferase reporter system in HEK293T cells was constructed for detection. Immunofluorescence analysis was utilized to precisely localize and visualize specific molecules(proteins, antigens) expressed by CDC45 in B16 cells across the groups. Simultaneously, clonogenic assay was employed to evaluate proliferative potential of B16 cells across the groups. Finally, CDC45 expression patterns in both skin tissues and B16 cells was comprehensively assessed by qRT-PCR and Western blot analyses. The results revealed that miR-200a overexpression significantly inhibited CDC45 activity at both post-transcriptional(mRNA) and post-translational(protein) levels, with complete suppression achieved through mutation targeting this binding site. In B16 cell models, miR-200a-induced CDC45 downregulation was closely associated with markedly reduced melanocyte proliferation capacity. Molecular analysis revealed that miR-200a-mimic transfection-induced reduction of CDC45 expression was highly consistent with direct miR-200a overexpression, indicating a clear functional relationship between miR-200a and CDC45. Collectively, miR-200a's ability to specifically target and regulate the CDC45 gene was confirmed in this study.

Graphical abstract

关键词

miR-200a / CDC45 / 黑色素生成 / 免疫荧光技术 / Western blot / 皮肤色素沉着 / B16

Key words

miR-200a / CDC45 / melanogenesis / immunofluorescence technique / Western blot / skin pigmentation / B16

动物皮肤色素沉着形成源于遗传、表观遗传与环境因素的复杂交互作用^[1-3]。在表观遗传调控因子中，mi核糖核酸（miRNA）已成为基因表达的关键调节器^[4-5]，通过精细调控黑色素细胞增殖、分化与黑色素体生成之间的平衡关系。辽宁绒山羊作为我国优质绒肉兼用型品种，其羊绒的经济价值与市场需求持续增长，而天然毛色对提升产品品质及避免染色健康风险至关重要。当前绒山羊毛色单一、分布不均等问题限制了产业升级。毛色表型受多因素调控，其中基因调控网络为核心机制。尽管绒山羊中的miR-200a等miRNA已被证实通过WNT5A和FZD4等靶标参与色素沉着调控^[6]，但关于miR-200a在皮肤生物学中作用的更广泛调控网络仍不完全明确。

细胞分裂周期蛋白45（CDC45）^[7-8]是DNA复制起始机制中保守且不可或缺的核心组分，它通过形成CMG复合体（CDC45/MCM2-7/GINS解旋酶复合物）在S期解旋DNA。除了在基因组复制中的经典功能外，CDC45还与DNA损伤反应通路及细胞增殖调控相关^[9-10]。然而，该蛋白在非增殖过程（如组织特异性分化或色素沉着）中的潜在作用尚未被深入探索。

本研究提出了一种新型调控轴机制：miR-200a通过靶向CDC45，将细胞周期调控与黑色素细胞功能及皮肤色素沉着联系起来。基于生物信息学预测、双荧光素酶报告基因检测以及在HEK293T（人胚肾细胞）细胞和B16（黑色素瘤细胞）细胞中的功能研究^[11]，用于证实miR-200a对CDC45表达量的影响，从而观察黑色素细胞增殖与黑色素合成情况，旨在揭示细胞周期动态与黑色素生成之间此前未被认知的相互作用关系。

1 材料和方法

1.1 试验材料

2025年5月在吉林省白山市养殖中心选取黑、白毛色辽宁绒山羊各4只，采集其肩胛骨部皮肤组织，处理后用锡纸包裹后放置于-80 ℃冰箱中分装保存。同年5—9月在吉林大学动物医学院病理实验室完成相关试验。

1.2 主要试剂和器材

HEK、293T细胞和B16细胞由吉林大学动物医学学院病理实验室保存。E. coli DH5α感受态细胞（生工生物工程（上海）股份有限公司），RNA提取试剂（北京聚合美生物有限公司），反转录试剂盒、荧光定量试剂盒（湖南一诺唯真科技有限公司），胶回收试剂盒（美国Dwyer Omega集团）,LB（肉膏蛋白胨培养基）粉末(德国达姆施塔特默克集团),双荧光素酶报告基因检测试剂盒(普洛麦格（北京）生物技术有限公司）,无内毒素质粒提取试剂盒（美国Dwyer Omega集团),XhoⅠ限制性内切酶、NotⅠ限制性内切酶（宝日医生物技术（北京）有限公司）。

4 ℃离心机（武汉赛默飞世尔科技公司），Nuclease-Free离心管（中国兰杰柯科技有限公司），超净台（飞龙伟业试验设备有限公司），恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司），微量核酸蛋白检测仪、实时荧光定量PCR系统、核酸检测仪（武汉赛默飞世尔科技公司），PCR扩增仪（美国伯腾仪器有限公司），核酸电泳槽（中国卡尤迪生物科技有限公司），凝胶成像仪（美国贝克曼库尔特公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 细胞培养与转染

在-80 ℃冰箱中取出冻存的HEK293T细胞和B16细胞，放置在37 ℃水浴锅中进行解冻，在超净台中将HEK293T细胞和B16细胞转移至含有胎牛血清（FBS）、青霉素和链霉素的高糖DMEM培养瓶中，并置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。将培养瓶内的2类细胞用胰酶消化后铺至细胞6孔板中继续培养，待细胞贴壁后更换培养基。在倒置荧光显微镜下观察细胞，待细胞生长密度达80%时开始进行转染，将小干扰RNA和一组对照组（NC）转染进细胞，每组设3个重复。按照转染试剂盒操作说明进行转染。

1.3.2 绒山羊羊皮组织细胞与B16细胞内标志基因的实时荧光定量PCR检测

为检测miR-200a在绒山羊皮肤组织及B16细胞中的表达水平，首先将液氮研磨后的羊皮组织粉末与转染后（miR-200a mimics/inhibitor处理）的B16细胞分别提取总RNA，并检测其纯度与浓度。随后将RNA反转录为cDNA，针对miR-200a设计特异性茎环引物，以U6为内参基因进行qRT-PCR（表1），定量分析各组样本中miR-200a的相对表达量。qRT-PCR反应要严格遵循反应体系（表2），采用20 μL无核酸酶体系以避免RNA降解，所有试剂均使用经DEPC处理的水配制。扩增后通过溶解曲线分析验证产物特异性，确保检测结果的准确性。

1.3.3 Western blot检测绒山羊羊皮组织细胞与B16相关蛋白表达

检测的目的是在翻译后水平（蛋白水平）验证miR-200a对CDC45表达的调控作用。在体外细胞试验中，通过脂质体转染技术将miR-200a模拟物（mi组）和miR-200a抑制剂（ih组）导入B16细胞。设置mimics组、NC组和inhibitor组是遵循“功能获得—功能缺失—基线对照”的分子功能研究金标准。将研磨好的羊皮组织样本和转染后的B16细胞加入预冷的RIPA裂解液（含蛋白酶和磷酸酶抑制剂），冰上超声裂解后，于4 ℃以12 000 r/min离心15 min，取上清液。采用BCA法测定蛋白浓度，按等质量上样至SDS-PAGE凝胶进行电泳分离。电泳结束后，将凝胶、PVDF膜及滤纸置于湿转缓冲液中，使蛋白转移至膜上。随后用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗（稀释比1∶10 000）4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次后，加入HRP标记二抗（1∶10 000）室温孵育1 h。最后用ECL化学发光试剂显影，并以β-actin为内参进行灰度值定量分析。

1.3.4 HEK293T细胞进行双素荧光素酶报告检测

在活细胞水平验证miR-200a与CDC45基因3'UTR预测结合位点的直接靶向作用及特异性。将细胞生长密度达80%的HEK293T细胞通过脂质体转染技术进行转染，分为psi组（空载体对照组）、WT组（野生型组）、MT组（突变型组）。其中，WT组保留原始靶序列，MT组将核心结合位点突变以破坏碱基互补配对。取出转染后的HEK293T细胞，弃去培养基，用PBS洗涤细胞，加入细胞裂解液充分裂解。随后加入萤火虫荧光素酶底物检测Firefly luc活性，再加入Stop & Glo试剂终止反应并同步激活Renilla luc检测。通过酶标仪分别读取2次发光值，以Firefly/Renilla的值作为目标启动子活性的相对指标，每组试验设3个复孔，重复3次，以确保结果可靠性。

1.3.5 B16细胞免疫荧光测定

在细胞水平直观验证miR-200a对CDC45蛋白表达的调控作用，并观察其亚细胞定位。将转染后的B16细胞从细胞培养箱中取出，置于4%福尔马林溶液中固定15 min，随后使用0.1%（体积分数）TritonX-100溶液提高细胞膜通透性。石蜡切片在37 ℃条件下用5%牛血清白蛋白孵育30 min。经PBS清洗后，将切片与稀释的CDC45（1∶50）抗体于4 ℃环境中孵育过夜。随后用生物素标记的二抗与载玻片孵育15 min，再加入POD标记的链霉亲和素。经DAB显色及苏木精复染后，通过显微镜观察切片。

1.3.6 对数生长期B16细胞克隆形成试验

为了评估miR-200a通过靶向调控CDC45对B16细胞增殖能力的影响，试验分mi、ih、NC等3组，每组设3个复孔。取出转染后对数生长期的B16细胞，胰酶消化后计数，使用血球计数板对细胞进行计数，按每孔500个细胞接种于6孔板，轻摇使细胞均匀分布，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养10~14 d，期间每3 d更换新鲜培养液。待克隆形成后，弃培养液，PBS轻柔洗涤2次，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%结晶紫染色20 min，流水缓慢冲去染液，晾干后拍照计数。

1.4 统计分析

本研究采用GraphPad Prism 统计软件对所有试验数据进行分析处理，计量资料以平均值±标准误差（SE）形式呈现。统计推断采用单因素方差分析（one-way ANOVA），并通过t检验对任意2组差异进行精确分析。并以P<0.05作为差异具有统计学意义的判断标准。

2 结果与分析

2.1 miR-200a在皮肤组织和角质形成细胞中的表达分析

通过系统分析并确定了miR-200a在绒山羊皮肤组织及角质形成细胞中的表达特征。从图1-A可以看出，与白色绒山羊皮肤组织相比，miR-200a在黑色绒山羊皮肤组织中的表达水平呈显著上调趋势，提示该miRNA可能参与调控绒山羊毛色形成的分子机制。B16细胞转染48 h后，qRT-PCR检测证实，转染miR-200a模拟物的B16细胞中其表达量较NC组显著升高（P<0.05，图1-B），而转染抑制剂的细胞则表现出miR-200a表达水平的明显抑制。

2.2 miR-200a靶向CDC45分析

生物信息学软件对mmu-miR-200a-5p与CDC45基因的相互作用进行预测分析，结果显示（图2-A），CDC45基因3'非翻译区（3'UTR）第64—71位核苷酸序列（5'-GUAAGAUA-3'）与mmu-miR-200a-5p的5'端种子序列（第2—8位核苷酸）存在完全互补配对，提示该区域可能为miR-200a的直接作用靶点^[12]。为验证这一预测，构建了双荧光素酶报告基因系统：psi组仅转染不含靶序列的基础载体，作为背景荧光基线以排除载体本身对报告基因活性的影响；WT组将CDC45基因3'UTR野生型序列（含完整5'-GUAAGAUA-3'互补位点）插入载体下游；MT组则通过定点突变技术将5'-GUAAGAUA-3'突变为5'-CUUUCUAU-3'，破坏miRNA-靶标的碱基配对。结果显示（图2-B），在WT组中，共转染miR-200a mimics的细胞荧光素酶活性较阴性对照（NC组）显著降低（P<0.05），表明miR-200a可通过结合该位点抑制报告基因表达；而在MT组中，miR-200a mimics对荧光素酶活性无显著影响，进一步证实了靶序列的特异性及互补配对的必要性。

2.3 miR-200a过表达和敲低对CDC45 mRNA和蛋白水平的影响

从图3可以看出，CDC45在白色绒山羊皮肤组织中的转录本丰度及蛋白表达量均显著高于黑色绒山羊皮肤组织（P<0.05），提示CDC45与绒山羊毛色表型差异显著相关。

qRT-PCR及Western blot检测发现，mi组细胞中CDC45的mRNA及蛋白表达水平较阴性对照（NC组）显著下调（图3-D~F），而ih组则呈现相反趋势，即CDC45表达量显著上调，表明miR-200a可通过转录后调控抑制CDC45的表达。进一步通过单克隆细胞培养试验评估miR-200a对细胞生物学特性的影响，在克隆形成试验中（图3-G），经培养统计，ih组细胞较mi组表现出更强的增殖能力与自我更新活性，细胞形态饱满、活力旺盛，表明CDC45参与维持细胞增殖状态。此外，免疫荧光染色结果直观显示（图3-H），在转染miR-200a模拟物的细胞中，CDC45蛋白荧光信号显著减弱，而转染抑制剂的细胞中CDC45表达增强，且荧光定位与前期报告基因试验结果一致，均集中于细胞核周围。

3 结论与讨论

由相关研究可知，黑色素含量减少，与黑色素合成相关基因（TYR、TYRP1、DCT）的间接调控有关^[13-15]。此外，皮肤色素沉着同时还受到生物体的生理状态和外部环境的影响^[16-17]。黑色素体的形成需经历多阶段生物合成与运输过程，其中蛋白质转运机制及效应蛋白定向募集是调控色素合成的核心环节。在黑色素细胞内，黑色素合成后经囊泡化包装形成黑色素体，通过微管/肌动蛋白骨架依赖的胞内运输系统定向迁移，最终通过胞吐作用或树突延伸将黑色素颗粒转移至邻近角质形成细胞，完成皮肤色素沉积的生理过程^[18-19]。有研究通过Solexa深度测序技术，解析了辽宁山羊皮肤中miRNA的表达与功能^[20]。

既往研究已揭示，miR-200a通过GNAI1和PLCB4等靶点调控色素沉着，涉及钙信号与GPCR通路^[21-22]。本研究发现，在B16细胞中miR-200a模拟物显著降低了CDC45的表达量，然而在抑制物中CDC45的表达量显著增多。证明CDC45这一非经典色素沉着基因是miR-200a的直接靶点。值得注意的是，CDC45在色素沉着中的角色尚未被报道，既往研究将CDC45作为细胞周期调控因子^[23]，并未进行CDC45与皮肤色素沉着关系方向的研究。miR-200a/CDC45轴的发现，也与表皮稳态的miRNA调控网络相呼应。例如，miR-200a对细胞增殖的抑制作用与其在肿瘤中的抑癌功能一致，而其对色素沉着的调控则体现了组织特异性适应^[24]。

此外，在正常情况下，黑色素细胞通过精密的分子机制来平衡细胞增殖与黑色素生成，以应对外界环境的变化。当皮肤暴露于紫外线等有害刺激下时，黑色素细胞需要迅速作出反应，既要防止过度的细胞损伤，又要增强皮肤的防护能力。miR-200a在这一过程中可能发挥着核心的协调作用。本研究表明，miR-200a通过直接靶向DNA复制关键调控因子CDC45，结合CDC45的3'UTR，抑制其mRNA和蛋白表达，从而调节绒山羊皮肤色素沉着，这一发现也进一步揭示了miR-200a/CDC45轴通过整合细胞周期调控与色素沉着，维持黑色素细胞功能稳态的新机制。具体而言，在需要保护皮肤免受紫外线伤害时，miR-200a可能通过抑制细胞周期相关基因的表达，减缓黑色素细胞的增殖速度，从而减少因细胞快速分裂而可能引发的DNA损伤风险。与此同时，miR-200a还可能促进黑色素合成相关基因的活性，加速黑色素的生成和沉积，为皮肤提供额外的保护屏障，抵御紫外线的进一步侵害。此路径的失调可能导致色素沉着异常，如白癜风或黄褐斑中常见的增殖与色素生成失衡^[25]。

不过，从整体来看，该研究仍具有一定的局限性。在体外模型方面，尽管细胞试验明确了机制因果，但缺乏类器官或重建表皮模型等更接近生理环境的数据支持^[26-28]。另一方面是黑色素合成的间接调控，CDC45下调后黑色素减少可能源于细胞周期依赖的分化状态改变，需进一步验证直接调控机制。此外，还需要在模型和验证上进行上、下游调控探索，重建表皮评估miR-200a/CDC45在分层表皮中的功能，研究miR-200a的转录调控机制（如紫外线诱导的p53或β-catenin信号）^[29-32]，阐明CDC45如何影响黑色素合成酶，是否通过转录共调控因子或表观遗传修饰实现。虽然本研究具有完整的体内证据，但仍需要在小鼠相关模型中验证，然后进一步整合基础研究与临床应用，以推动其在色素沉着疾病治疗中的应用。

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基金资助

吉林省教育厅项目(JJKH20220399KJ)