双氢青蒿素对脂多糖攻毒断奶仔猪肠道屏障和免疫功能的影响

Effect of Dihydroartemisinin on Intestinal Barrier and Immune Function in Weaned Piglets Challenged with Lipopolysaccharide

摘要

为探究日粮中添加双氢青蒿素（DHA）对脂多糖（LPS）攻毒导致的断奶仔猪肠道损伤和免疫应激的缓解效果及潜在机制，选取18头21日龄断奶仔猪，随机分为对照组（CON）、LPS攻毒组（LPS）、LPS攻毒+DHA添加剂组（LPS+DHA），其中，CON组和LPS组饲喂基础日粮，LPS+DHA组饲喂添加DHA的日粮，28 d后，LPS组和LPS+DHA组仔猪腹腔注射100 μg/kg LPS，CON组注射等量生理盐水；注射4 h后，将所有仔猪进行屠宰，采集血液和空肠样品进行分析。结果表明，LPS显著提高了血清中肠道损伤标志物，增加了血清和空肠中的促炎因子含量，降低了肠道免疫功能，提示免疫应激模型建立成功。与LPS组相比，LPS+DHA组仔猪体质量（BW）、平均日采食量（ADFI）和平均日增质量（ADG）均显著增加，而料质量比（F/G，kg/kg）显著降低；血清中二胺氧化酶（DAO）活性和D-乳酸（D-LA）含量显著降低；血清和空肠中白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）含量也显著降低，而免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白G（IgG）浓度显著增加；此外，空肠中IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR4、NF-κB的相对表达量显著降低，而IgG、FcRn的相对表达量显著增加。综上，日粮中添加双氢青蒿素能够提高断奶仔猪生长性能，有效缓解LPS攻毒引起的肠道屏障功能损伤及肠道免疫功能下降，其作用机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路激活有关。

Abstract

To investigate the alleviating effects and underlying mechanisms of dietary dihydroartemisinin(DHA) supplementation on intestinal damage and immune stress in weaned piglets challenged with lipopolysaccharide(LPS), in this study, a total of 18 weaned piglets at 21 days of age were randomly assigned to three groups: control group(CON), LPS-challenged group(LPS), and LPS-challenged group with DHA supplementation(LPS+DHA).The CON and LPS groups were fed a basal diet, while the LPS+DHA group received a basal diet supplemented with DHA. After 28 days, piglets in the LPS and LPS+DHA groups were intraperitoneally injected with 100 μg/kg of LPS, whereas the CON group received an equivalent volume of physiological saline. All piglets were slaughtered 4 hours post-injection, and blood and jejunum samples were collected for analysis. The results showed that LPS challenge significantly increased markers of intestinal injury in serum, elevated pro-inflammatory cytokine levels in both serum and jejunum, and impaired intestinal immune function, indicating the successful establishment of an immune stress model. Compared with the LPS group, the LPS+DHA group exhibited significantly increased body weight(BW), average daily feed intake(ADFI), and average daily gain(ADG), while the feed-to-gain ratio(F/G, kg/kg) was significantly reduced. Additionally, diamine oxidase(DAO) activity and D-lactate(D-LA) content in serum were significantly decreased. The concentrations of interleukin-1β(IL-1β), interleukin-6(IL-6), and tumor necrosis factor-α(TNF-α) in serum and jejunum were also significantly reduced, whereas the concentrations of immunoglobulin A(IgA) and immunoglobulin G(IgG) were markedly increased. Furthermore, the relative expression levels of IL-1β, IL-6, TNF-α, TLR4, and NF-κB in the jejunum were significantly declined, while the relative expression levels of IgG and FcRn were significantly increased. In conclusion, dietary supplementation with dihydroartemisinin improved growth performance in weaned piglets and effectively alleviated LPS-induced intestinal barrier dysfunction and intestinal immune function decline. The underlying mechanism might be associated with the inhibition of the TLR4/NF-κB signaling pathway activation.

关键词

断奶仔猪 / 双氢青蒿素 / 脂多糖 / 生长性能 / 肠道 / 免疫功能

Key words

weaned piglets / dihydroartemisinin / lipopolysaccharide / growth performance / intestine / immune function

断奶是仔猪生命周期中的关键阶段，伴随着营养来源、物理环境和社会结构的剧烈变化，常导致仔猪出现采食量下降、生长阻滞、肠道功能紊乱和免疫力低下等一系列问题，造成断奶应激^[1]。在此期间，仔猪肠道黏膜免疫系统尚未发育完善，肠道屏障功能脆弱，极易受病原微生物及其产物的侵害，从而引起肠道损伤，最终影响仔猪生长性能和生产效益^[2-3]。长期以来，抗生素在畜牧生产中被广泛用于疾病防治。然而，由于细菌耐药性的出现和药物残留问题，我国在2020年已宣布在饲料端全面禁止使用抗生素。因此，开发新型的绿色饲料添加剂以缓解断奶造成的炎症反应，对于保障仔猪健康、提高养殖效益具有重要意义。

青蒿素是从传统中草药黄花蒿（Artemisia annua L.）中提取的一种倍半萜内酯化合物，以其高效抗疟疾活性而闻名于世。双氢青蒿素（Dihydroartemisinin，DHA）是青蒿素的主要衍生物之一，具有较高的生物活性和水溶性^[4-5]。已有研究发现，青蒿素及其衍生物除了抗疟疾作用外，还具有广泛的药理活性，包括抗炎、抑菌、免疫调节、抗寄生虫、抗病毒和抗肿瘤等^[6-7]。特别是在炎症调控方面，青蒿素类药物能够通过NF-κB、MAPK等信号通路抑制促炎因子的产生，在多种炎症性疾病模型中表现出良好的保护效果^[8-11]。然而，关于DHA在畜禽生产，特别是在缓解断奶仔猪免疫应激方面的应用研究尚不多见，其具体作用机制也有待深入阐明。

本研究通过建立LPS攻毒的断奶仔猪免疫应激模型，分析DHA对仔猪生长性能、肠道屏障功能、全身及肠道局部免疫指标的影响，并进一步从基因表达水平探讨其可能的作用机制，以期为DHA作为一种新型饲料添加剂在生猪健康养殖中的应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料及试剂

仔猪购自正大猪业（余姚）有限公司。双氢青蒿素（纯度≥98%）购自南京道斯夫生物科技有限公司；LPS（大肠杆菌血清型O55∶B5）购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；D-乳酸（D-LA）和二胺氧化酶（DAO）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；免疫指标测定使用的试剂盒购自上海易利生物科技有限公司；反转录试剂盒购自宝日医生物技术（北京）有限公司；SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司。

1.2 试验设计及饲养管理

选取18头21日龄健康杜×长×大三元杂交断奶仔猪，按体况一致、性别均衡原则随机分为3组，分别为对照组（CON）、LPS攻毒组（LPS）、LPS攻毒+DHA添加剂组（LPS+DHA），每组6头仔猪，其中，CON组和LPS组仔猪饲喂基础日粮，LPS+DHA组饲喂添加了80 mg/kg DHA的基础日粮。基础日粮参考NRC标准进行配制，其组成及营养水平见表1、2。

试验期28 d。仔猪饲养试验于正大猪业（余姚）有限公司进行，试验仔猪饲养于3 m×4 m的保育栏内（6头/栏），环境温度控制在26~28 ℃，相对湿度60%~65%，自然光照，自由采食与饮水。饲养期间每日清理圈舍2次，定期消毒，记录仔猪健康状况。

1.3 样品采集与处理

试验第28天，LPS组和LPS+DHA组仔猪腹腔注射100 μg/kg的大肠杆菌LPS（血清型O55∶B5），CON组注射等量生理盐水。观察仔猪的反应，并测定直肠温度。LPS注射4 h后，所有仔猪前腔静脉采集血液于10 mL离心管中，4 ℃静置4 h，3 000 r/min离心15 min，分离血清，-80 ℃冷冻保存备用。采血后仔猪进行安乐死，迅速剖开腹腔，分离空肠，剪开空肠肠段，用无菌的载玻片轻轻刮取空肠黏膜于2 mL冻存管中，随后立即置于液氮中冷冻。取约0.1 g组织，按照1∶9（m/V）比例加入预冷的0.9%生理盐水，冰水浴匀浆后，3 500 r/min离心10 min，取上清液，置于-80 ℃保存，用于免疫指标测定。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 生长性能指标测定

分别于试验第1天和试验第28天对仔猪进行空腹称体质量（BW），记录每组仔猪每日的耗料量，计算平均日增质量（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料质量比（kg/kg，F/G）。

1.4.2 肠道损伤标志物测定

血清中D-乳酸（D-LA）含量采用ELISA法进行测定；二胺氧化酶（DAO）活性采用比色法测定，按照试剂盒说明书操作。

1.4.3 免疫指标测定

血清和空肠黏膜中白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）含量采用ELISA法进行测定，按照试剂盒说明书操作。

1.4.4 基因表达量测定

利用TRIzol试剂提取空肠组织总RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，然后采用核酸蛋白测定仪测定OD₂₆₀/OD₂₈₀值（1.8~2.0为合格）。按照反转录试剂盒说明书合成cDNA，-20 ℃保存备用。

参照GenBank中猪IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR4、MyD88、NF-κB、IgG、FcRn及内参基因β-actin的序列，采用Primer 5.0软件设计引物，基因引物序列见表3。引物经PCR验证特异性后使用。反应体系与反应程序参考SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒说明书进行设置，以β-actin为内参基因，采用2^-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.5 数据统计分析

数据采用Excel 2019整理后，使用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA）并绘图，组间多重比较采用Duncan氏法。结果以平均值±标准误（Mean±SE）表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 日粮添加DHA对断奶仔猪生长性能的影响

日粮添加双氢青蒿素对断奶仔猪生长性能的影响如表4所示。

从表4可以看出，与LPS组相比，LPS+DHA组断奶仔猪49 d体质量、平均日采食量（ADFI）和平均日增质量（ADG）均显著升高（P<0.05），而F/G显著降低（P<0.05）；但CON组和LPS组间各指标均无显著差异。

2.2 日粮添加DHA对LPS攻毒断奶仔猪肠道损伤标志物的影响

与CON相比，LPS组断奶仔猪血清中DAO活性显著升高（P<0.05）；而LPS+DHA组血清中D-LA含量和DAO活性显著降低（P<0.05）（表5）。

2.3 日粮添加DHA对LPS攻毒断奶仔猪免疫指标的影响

由表6可知，与CON组相比，LPS组断奶仔猪血清中IL-1β、IL-6含量均显著升高（P<0.05），而IgA、IgG含量均显著降低（P<0.05）。与LPS组相比，LPS+DHA组血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均显著降低（P<0.05），而IgA、IgG含量均显著升高（P<0.05）。

由表7可知，与CON组相比，LPS组断奶仔猪空肠IL-1β、IL-6、TNF-α含量均显著升高（P<0.05），而IgA、IgG含量均显著降低（P<0.05）。日粮添加DHA不仅显著降低了LPS攻毒仔猪空肠IL-1β、IL-6、TNF-α含量，而且提高了IgA、IgG含量（P<0.05）。

2.4 日粮添加DHA对LPS攻毒断奶仔猪肠道炎症反应和免疫功能相关基因表达的影响

从表8可以看出，与CON组相比，LPS组断奶仔猪空肠NF-κB、TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α相对表达量均显著上调（P<0.05），而IgG、FcRn相对表达量均显著下调（P<0.05）。与LPS组相比，LPS+DHA组断奶仔猪空肠NF-κB、TRL4、IL-1β、IL-6、TNF-α相对表达量均显著下调，而IgG、FcRn相对表达量均显著上调（P<0.05）。

3 结论与讨论

本研究中，LPS用于建立断奶仔猪急性免疫应激模型，生长指标是在LPS攻毒前测定的，故本研究主要研究DHA对断奶仔猪生长性能的影响。已有研究发现，日粮添加不同浓度的DHA对断奶仔猪的ADFI均有不同程度的影响，而80 mg/kg的DHA还可显著提高ADG，降低F/G^[12]。也有研究发现，日粮添加80 mg/kg DHA可显著提高宫内发育迟缓仔猪的ADFI和ADG^[13]。本研究也得到了相似的结果。本研究发现，DHA提高了断奶仔猪的ADFI和ADG，降低了F/G。DHA可能通过减少炎症反应、改善肠道消化吸收功能，从而改善断奶仔猪生长性能。此外，DHA的脂溶性特征可能促进日粮中脂溶性维生素吸收，进一步协同提升断奶仔猪生长性能^[14]。

肠道屏障作为抵御病原入侵的第一道防线，其完整性与功能状态直接关联仔猪健康。肠道屏障功能受损可通过血清D-LA含量和DAO活性进行评估^[15]。D-LA由肠道细菌代谢产生，主要存在于肠黏膜绒毛上皮细胞，肠屏障受损时，肠道通透性增加，D-LA由肠道进入血液中，因此，其含量升高直接反映肠黏膜通透性；DAO作为肠黏膜绒毛上皮细胞胞质酶，血清活性升高直接反映肠黏膜完整性破坏。本研究中，LPS组血清DAO活性显著升高，证实肠黏膜上皮细胞受损严重，而DHA可使DAO活性和D-LA含量显著降低，提示DHA可降低肠黏膜通透性，阻止肠道细菌代谢产物进入血液。已有研究表明，LPS攻毒会引起断奶仔猪血清中DAO活性和D-LA含量增加^[16]。DHA可以显著降低宫内发育迟缓仔猪血清中DAO含量，表明DHA有效维护了肠黏膜结构的完整性和通透性，这可能与DHA直接作用于肠上皮细胞抑制炎症间接保护肠道屏障相关^[13]。

免疫应激会导致仔猪免疫稳态失衡，发生炎症反应。IL-1β、IL-6作为早期促炎因子，可激活巨噬细胞、中性粒细胞等免疫细胞，放大炎症反应。本研究中，LPS组仔猪血清及肠道组织促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量升高，与HUANGFU等^[17]的研究结论一致。而DHA可显著下调上述促炎因子含量，其中，肠道IL-1β含量较LPS组降低49.3%，表明DHA对肠道局部炎症的抑制效应较好。已有研究发现，DHA不仅可以有效改善呕吐毒素诱导的仔猪血清中TNF-α、IL-1β含量的降低^[18]，还可以降低宫内发育迟缓仔猪肝脏IL-1β、IL-6、TNF-α含量^[19]。

IgA作为肠道黏膜免疫的核心抗体，可阻止病原体黏附肠上皮细胞。IgG则通过FcRn受体转运至肠黏膜表面，发挥抗感染作用^[20]。本研究中，日粮中添加DHA显著提高了血清及空肠中IgA、IgG含量，上调了IgG、FcRn的相对表达量，提示DHA可能通过促进IgG在肠道黏膜的富集，增强黏膜免疫功能。ZHANG等^[21]研究发现，肉鸡日粮中添加不同浓度的DHA均对血清中IgG含量有不用程度的提升，且存在二次项效应。NIU等^[13]研究也表明，DHA可以提高宫内发育迟缓仔猪肠道IgA、IgG含量，增强免疫功能。

TLR4/NF-κB通路是LPS诱导炎症反应的核心通路。LPS作为病原相关分子模式，主要通过识别受体如Toll样受体4（TLR4），启动细胞内髓样分化因子88（MyD88）依赖的信号转导，最终激活转录因子NF-κB，诱导大量促炎细胞因子的合成与释放，引发炎症反应^[22-23]。本研究中，LPS组TLR4、NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α表达量显著升高，日粮添加DHA可显著下调以上基因的表达量，表明DHA通过靶向抑制TLR4/NF-κB通路发挥抗炎作用。值得注意的是，各组MyD88基因表达量无显著差异，推测DHA主要作用于TLR4受体水平，而非MyD88下游信号分子。ZHANG等^[24]研究表明，在母猪日粮中添加青蒿提取物可以通过抑制TLR4/NF-κB通路缓解后代仔猪的炎症反应和氧化还原状态。REN等^[25]研究发现，青蒿素类似物蒿甲醚通过调节TLR4/NF-κB p65通路抑制结肠炎造成的肠道损伤。本研究结果表明，DHA对LPS攻毒仔猪肠道炎症反应的缓解作用，可能与DHA具有抗炎抑菌作用有关。

本研究发现，日粮添加80 mg/kg DHA可以显著提高断奶仔猪生长性能，修复LPS攻毒仔猪肠黏膜损伤，保护肠道屏障功能，增强免疫功能，降低炎症反应；并通过抑制TLR4/NF-κB信号通路激活，下调促炎细胞因子的基因表达，上调免疫相关基因表达，来改善肠道健康。本研究结果可为DHA作为一种新型天然饲料添加剂在缓解断奶仔猪免疫应激中的作用提供理论依据。

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基金资助

浙江省自然科学基金(LQ23C170002)

动物抗病营养四川省重点实验室开放课题(SZ20250203)