兼具抑菌脱毒特性的功能乳酸菌的筛选及特性分析

Screening and Characterization Analysis of Lactic Acid Bacteria with Both Antibacterial and Detoxification Properties

摘要

青贮饲料霉菌毒素污染时有发生，而乳酸菌作为一类广泛存在于自然环境中的益生菌，不仅在青贮发酵过程中起主导作用，而且能产生多种抑菌物质（如有机酸、细菌素、蛋白类化合物等）以及通过吸附或生物降解等方式降低霉菌毒素含量。为了挖掘兼具抑菌和脱毒活性的功能乳酸菌，以产毒黄曲霉菌和禾谷镰孢菌为指示菌，以玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）和脱氧雪腐镰孢菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）为底物，优选获得了4株兼具高效抑菌脱毒特性的功能乳酸菌，经鉴定分别为植物乳植杆菌LP10、LP64、LP71和发酵黏液乳杆菌LF92；并对乳酸菌在不同pH、温度、酶处理下的抑菌活性及对ZEN和DON的脱毒效果进行了检测。结果表明，随pH值升高，4株乳酸菌的发酵上清液对黄曲霉菌和禾谷镰孢菌抑菌活性均降低；经80、100 ℃处理后，各菌株上清液对黄曲霉菌的抑制效果降低，而LP71、LF92上清液经高温处理后对禾谷镰刀菌的抑制效果增强。蛋白酶处理结果表现出菌株特异性，仅LP71上清液经各蛋白酶处理后对禾谷镰刀菌的抑制效果与对照无差异。脱毒处理结果表明，LP64对ZEN和DON的脱毒率最高，分别为46.9%、82.9%，且脱毒机制主要为吸附作用，可作为青贮饲料生物防控的候选菌株。

Abstract

Mycotoxin contamination in silage becomes a common occurrence. Lactic acid bacteria, which is a type of probiotic widely presenting in the natural environment, not only play dominant roles in silage fermentation but also produce diverse antimicrobial substances(e.g., organic acids, bacteriocins, and proteinaceous compounds) and reduce mycotoxin levels via adsorption or biodegradation. To isolate functional lactic acid bacteria with both antibacterial and detoxifying activities, in this study, four functional lactic acid bacteria with efficient antimicrobial and detoxification activities were selected using Aspergillus flavus and Fusarium graminearum as indicator fungi and zearalenone(ZEN) and deoxynivalenol(DON) as substrates. These strains were identified as Lactiplantibacillus plantarum LP10, L. plantarum LP64, L. plantarum LP71, and Limosilactobacillus fermentum LF92, respectively. The antibacterial activity of the lactic acid bacteria was evaluated under different pH levels, temperatures, and enzyme treatments, and their detoxification effects on ZEN and DON were analyzed. The results indicated that with an increase in pH, the antifungal activity of fermentation supernatants from the four lactic acid bacteria(LAB) strains against A. flavus and F. graminearum gradually decreased. After heat treatment at 80 ℃ and 100 ℃, the inhibitory effect of the respective fermentation supernatants of each LAB strain on A. flavus was significantly reduced, whereas the inhibitory effects of the supernatants of strains LP71 and LF92 against F. graminearum were enhanced following high-temperature treatment. The strains exhibited specificity in response to different protease treatments: only the inhibitory effect of LP71 supernatant against F. graminearum showed no significant difference from that of the control after treatment with various proteases. Furthermore, the detoxification results indicated that LP64 exhibited the highest removal rates for ZEN and DON, at 46.9% and 82.9%, respectively. The primary mechanism of detoxification was identified as adsorption. Consequently, LP64 could be used as a candidate strain for the biological control of fungi and mycotoxin detoxification in silage.

Graphical abstract

关键词

乳酸菌 / 玉米赤霉烯酮 / 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 / 抑菌 / 脱毒

Key words

lactic acid bacteria / zearalenone / deoxynivalenol / antibacterial / detoxification

霉菌及其产生的毒素污染是威胁饲料安全与动物生产的重要因素，其中，黄曲霉（A. flavus）和禾谷镰孢菌（F. graminearum）作为全世界范围内常见的植源性丝状真菌，不仅可侵染玉米、小麦等农作物导致产量下降，还能产生黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）等多种霉菌毒素。这些毒素具有较强的致癌性和致畸性，可通过污染青贮饲料进入动物生产链，导致畜禽生长性能降低、繁殖障碍，甚至死亡，同时也可通过食物链危及人类健康，进而对农业经济和公共卫生安全构成严重威胁。近年来，DON和ZEN在世界范围内的污染尤为严重。WHITLOW等^[1]研究发现，在美国检测的461个玉米青贮样品中，ZEN的平均浓度为525 μg/kg，检出率为30%。对荷兰2002—2004年生产的140份玉米青贮饲料进行检测，发现ZEN的检出率为49%，平均浓度为174 μg/kg^[2]。KEESE等^[3]研究发现，DON会导致泌乳奶牛乳脂率降低。DÄNICKE等^[4]向奶牛饲喂受DON和ZEN污染的小麦，结果表明，瘤胃氨浓度显著增加，十二指肠微生物蛋白流量减少。鉴于霉菌毒素污染广泛且危害严重，急需探索有效的控制方法以降低其对青贮饲料及动物健康的不利影响。

生物脱毒方法包括利用微生物细胞壁吸附霉菌毒素和利用微生物代谢产物或分泌酶降解霉菌毒素2种。虽然微生物降解霉菌毒素的技术尚处于起步阶段，但与物理、化学降解技术相比，微生物降解反应条件温和，不会导致二次污染和营养损害，并具有快速高效、低毒、强特异性等特点。CHLEBICZ等^[5]研究了6株酿酒酵母对不同毒素的体外脱毒效果，结果表明，其对伏马毒素B1、B2混合物脱除效果最显著，脱毒率可达67%~74%。CHO等^[6]从被污染谷物中分离出1株可以降解ZEN的枯草芽孢杆菌亚种，发现该菌株在液体培养基中与ZEN共培养24 h后，ZEN降解率可达99%；该菌株在固体培养基中与ZEN共培养48 h后，ZEN降解率可达95%。HARKAI等^[7]通过SOS显色试验及基于酵母的生物发光检测法从124株链霉菌（Streptomyces）中筛选出2株可有效消除ZEN雌激素效应的链霉菌，这2株菌对ZEN的降解率可达100%。但对青贮饲料而言，芽孢杆菌、霉菌、酵母菌等均是青贮发酵的不良微生物，不宜用于青贮饲料的霉菌毒素脱毒，而乳酸菌作为青贮发酵的主导菌群可以成为青贮饲料霉菌毒素生物脱毒的首选菌。

乳酸菌能通过产酸降低环境pH值，进而抑制腐败菌繁殖，同时，部分菌株还可分泌细菌素等抑菌物质，抑制霉菌繁殖。近年来研究发现，植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）^[8]、罗伊士乳杆菌（Lactobacillus reuteri）^[9]等乳酸菌菌株在体外试验中表现出对霉菌具有较强拮抗活性及降解霉菌毒素的能力，其作用机制可能与代谢产物的抑菌效应、菌体表面吸附、酶促降解毒素等有关。因此，筛选具有抑菌脱毒功能的微生物制剂，并通过生物干预手段改善青贮发酵品质、控制霉菌毒素污染，已成为当前青贮饲料研究的热点方向。然而，不同菌株的抑菌谱和脱毒效率存在显著差异，且实验室条件下的抑菌脱毒特性与实际青贮环境中的应用效果往往存在差距，需结合具体菌株和应用场景开展系统研究。

基于前期研究发现，植物乳植杆菌LP10、LP64、LP71及发酵黏液乳杆菌LF92具有潜在的抑菌脱毒活性^[10]，本研究拟通过体外试验明确上述菌株对A. flavus和F. graminearum的抑菌效果及稳定性（耐酸、耐热、耐酶特性），并探究其对ZEN和DON的降解能力，旨在为筛选可用于青贮的高效生物制剂和构建安全可控的青贮发酵体系提供理论依据和实践参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株

指示菌株A. flavus NRRL3357和F. graminearum PH-1均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。植物乳植杆菌LP10（L. plantarum LP10）、LP64（L. plantarum LP64）、LP71（L. plantarum LP71）和发酵黏液乳杆菌LF92（Limosilactobacillus fermentum LF92）筛选自全国不同地区发生霉变或遭受霉菌毒素污染的青贮玉米中，这些菌株加入到含20%（V/V）甘油的MRS（de Man，rogosa and sharp）肉汤中，并置于-80 ℃冷冻保存。

1.1.2 培养基及试剂

MRS培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato dextrose agar，PDA）均购自上海盛思生化科技有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶均购自北京索莱宝试剂有限公司；蛋白酶K购自伊势久生物有限公司；过氧化氢酶购自天津市化学试剂有限公司。AgraQuant^®霉菌毒素酶联免疫检测试剂盒购自荷兰Koninklijke DSM公司。

磷酸缓冲液（Phosphatic buffer solution，PBS）配方为NaCl 8.0 g，KH₂PO₄ 0.2 g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9 g，KCl 0.2 g。

1.2 试验菌株抑菌特性测定

1.2.1 霉菌孢子悬浮液制备

将A. flavus和F. graminearum接种于PDA琼脂培养基，恒温30 ℃孵育7 d后，在培养基表面加入1 mL无菌水，并用无菌毛刷将菌丝刮下，紫外线照射2 min，置于30 ℃恒温培养箱中继续培养12 h，可形成分生孢子。利用孢子洗脱液（0.1% Tween-80（V/V））洗脱孢子，并制备成浓度为1.0×10⁶ cfu/mL的霉菌孢子悬液。

1.2.2 菌株发酵上清液制备

从-80 ℃超低温冰箱取出试验菌株，按2%（V/V）比例接种于MRS肉汤培养基，置于37 ℃恒温箱厌氧培养24 h，再将菌液在4 ℃条件下，8 000 r/min离心10 min，获取发酵上清液。

1.2.3 双层牛津杯抑菌试验

将121 ℃高压灭菌后的2%（m/V）琼脂倒于培养皿，待培养基冷却凝固后将灭菌后的牛津杯置于其表面；取霉菌孢子悬液，与灭菌后冷却至40~50 ℃的PDA琼脂培养基混合均匀，倒入琼脂培养基表面，待培养基凝固后取出牛津杯；将200 µL的菌株发酵上清液加入牛津杯孔内，37 ℃恒温培养，每隔6 h观察结果一次，共观察8次，并采用十字交叉法测量抑菌圈大小。

1.2.4 酸处理试验

使用2 mol/L的NaOH和HCl，将菌株发酵上清液pH值分别调至3.0、5.0、7.0，进一步采用双层牛津杯法比较不同pH值处理的发酵上清液对A. flavus和F. graminearum的抑菌效果，以未调pH值的菌株发酵上清液为对照。

1.2.5 热处理试验

将菌株发酵上清液分别在60、80、100 ℃下处理2 h，待冷却至室温后采用双层牛津杯法比较不同温度处理的发酵上清液对A. flavus和F. graminearum的抑菌效果，以未进行热处理的菌株发酵上清液为对照。

1.2.6 蛋白酶及过氧化氢酶处理

分别将菌株上清液的pH值调至胰蛋白酶（250 U/mg）、胃蛋白酶（250 U/mg）、蛋白酶K（40 U/mg）和过氧化氢酶（40 U/mg）的最适pH值，然后添加相应蛋白酶或过氧化氢酶，37 ℃温育2 h；再置于100 ℃沸水中5 min对各种酶进行失活处理。随后将各菌株上清液的pH值调整至原始值，采用双层牛津杯法比较不同酶处理的发酵上清液对A. flavus和F. graminearum的抑菌效果，以未添加蛋白酶和过氧化氢酶的菌株上清液为对照。

1.3 试验菌株脱毒特性测定

1.3.1 菌株发酵液、上清液和菌体沉淀的制备

菌株发酵液的制备：从-80 ℃超低温冰箱取出乳酸菌菌株，以2%（V/V）比例接种于MRS肉汤培养基中，在37 ℃恒温培养箱厌氧培养48 h。发酵上清液和菌体沉淀的制备：取5 g的菌株发酵液在4 ℃，8 000 r/min离心15 min，上清部分即为发酵上清液；菌体沉淀用磷酸缓冲液（pH=7.4）洗涤2次，4 ℃，8 000 r/min离心15 min，用相同体积的磷酸缓冲液溶解即为菌体沉淀。

1.3.2 菌株脱毒试验

取900 µL菌株发酵液、发酵上清液、菌体沉淀，分别与ZEN（0.4 µg/mL）和DON（2 µg/mL）混合均匀后置于无菌离心管内，以相同体积的MRS肉汤培养基为空白对照。将ZEN反应体系置于37 ℃恒温培养箱中培养72 h，将DON反应体系置于30 ℃培养箱中培养96 h，反应结束后用AgraQuant^®霉菌毒素酶联免疫检测试剂盒测定溶液中霉菌毒素含量，计算霉菌毒素降解率。

1.4 统计分析

采用SAS 9.10的一般线性模型（General linear model，GLM），根据完全随机设计分析乳酸菌的2种霉菌的抑菌活性（Yijk）。

Yijk=μ+Ii+Tj+（I×T）ij+eijk（1）

式中，Yijk为因变量，μ为所有处理抑菌圈直径的平均值，Ii为乳酸菌的固定效应（i=5），Tj为处理的固定效应（j=3或4），（I×T）ij为乳酸菌和不同处理的交互作用，eijk为残差。

采用Tukey's法对各处理间均值进行多重比较，当P<0.05时，表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌对黄曲霉菌和禾谷镰孢菌的抑菌特性分析

2.1.1 不同pH处理对乳酸菌抑菌活性的影响

不同pH处理对乳酸菌抑制禾谷镰孢菌和黄曲霉菌活性的影响如表1所示。

从表1可以看出，不同pH处理下，不同乳酸菌在对黄曲霉菌的抑制作用存在交互效应。在对照组中，菌株LP64对F. graminearum和A. flavus的抑菌圈直径均高于其他菌株，显示出最高的抑菌活性。但在pH值为3.0时，菌株LF92对A. flavus抑制效果最好，显著高于菌株LP64（P<0.05），对F. graminearum抑制效果也高于菌株LP64。在pH值为 5.0时，菌株LF92对A. flavus抑菌圈直径也显著大于其他菌株（P<0.05）；菌株LP10对F. graminearum抑制效果也显著高于其他菌株（P<0.05）。上清液pH值调整为7.0时，各菌株对A. flavus抑菌圈直径间无显著差异，菌株LP71对F. graminearum的抑菌效果最佳。

与对照组相比，菌株LP10、LF92在pH值为3.0时，对F. graminearum和A. flavus的抑菌圈直径都有显著增加（P<0.05），且为所有pH处理组中抑菌效果最好的。但当上清液pH值调整到5.0和7.0时，4株乳酸菌对F. graminearum和A. flavus的抑菌圈直径逐渐缩小。

2.1.2 不同温度处理对乳酸菌抑菌活性的影响

由表2可知，不同温度处理下，不同乳酸菌对F. graminearum抑菌活性存在差异。在60、80、100 ℃温度条件下，菌株LP64、LP71对F. graminearum抑菌直径均显著大于LP10和LF92（P<0.05）。与对照组相比，随着处理温度的上升，各菌株对A. flavus抑菌效果呈现逐渐降低的趋势。在80 ℃处理后，菌株LF92对A. flavus形成的抑菌圈直径显著大于菌株LP10、LP64、LP71所形成的抑菌圈直径（P<0.05）。而在60、100 ℃处理后，菌株LP64、LP71、LF92的抑菌效果均显著高于LP10（P<0.05）。

2.1.3 不同酶处理对乳酸菌抑菌活性的影响

由表3可知，不同酶处理下，不同乳酸菌对F. graminearum和A. flavus的抑制活性存在差异。在对F. graminearum的抑制效果上，LP64和LF92在被胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和过氧化氢酶处理后抑菌活性均显著降低（P<0.05）；菌株LP10被胰蛋白酶处理后，抑菌活性显著降低（P<0.05）；各种酶处理后，菌株LP71对F. graminearum抑菌效果没有差异。在对A. flavus抑制效果上，胃蛋白酶和蛋白酶K处理后，LP10和LP64的抑菌活性显著降低（P<0.05），而LP71和LF92抑菌活性没有变化。胰蛋白酶处理后，LP71和LF92的抑菌活性也显著降低（P<0.05），表明4株乳酸菌上清液中均存在蛋白酶类抑菌活性物质。

2.2 乳酸菌对ZEN和DON的脱毒特性分析

2.2.1 乳酸菌不同组分对ZEN的脱毒效果

从图1可以看出，4株乳酸菌的上清液、发酵液和菌体沉淀对ZEN脱毒率存在差异。对比4株乳酸菌的发酵液组分对ZEN的脱毒率，LP64和LF92发酵液对ZEN的脱毒效果较好，分别为46.9%和45.6%。菌株LP64、LP71、LF92的上清液对ZEN的脱毒率均显著低于其菌体沉淀（P<0.05），而LP10的上清液和菌体沉淀对ZEN的脱毒效果相似。

2.2.2 乳酸菌不同组分对DON的脱毒效果分析

由图2可知，4株乳酸菌的不同组分对DON脱毒效果存在差异。对比4株乳酸菌的发酵液组分对DON的脱毒率发现，LP64发酵液的脱毒效果最好，为82.9%；菌株LP64、LF92的菌体沉淀对DON的脱毒率均显著高于上清液（P<0.05），菌株LP10、LP71的上清液脱毒率均显著高于菌体沉淀（P<0.05）。

3 结论与讨论

霉菌侵染会引起青贮饲料营养损失、霉菌毒素污染等一系列问题，对动物和人类健康造成严重的威胁。乳酸菌作为天然生物抗菌防腐剂，可产生多种代谢产物包括有机酸、苯基乳酸、蛋白质、环肽、细菌素等，可以抑制霉菌的生长^[11]。乳酸菌对抗病原微生物侵染的机制主要有降低环境酸碱度、代谢相关抗菌化合物（如细菌素）、竞争营养成分、产生有机酸、刺激免疫调节机制等^[12]。有机酸主要是通过将pH值降低到真菌生长范围以外^[13]，进而抑制真菌生长。同时，有机酸还可通过破坏膜结构、降低细胞内pH值、抑制转运蛋白活性和阻碍代谢功能来发挥抗真菌活性^[14]。当环境pH值低于等电点时，有机酸主要以未解离的形式存在，这是发挥其抑菌作用的主要形式，在这种形式下有机酸可穿透真菌细胞壁从而发挥抑菌作用^[15]。DOGI等^[16]研究发现，植物乳杆菌RC009在pH值小于4.0时，能有效抑制禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）生长，在pH值为6.0时，无抑制效果。因此，为剖析4株乳酸菌抑菌效果是否源于有机酸和其低pH值环境，本研究将乳酸菌发酵上清液的pH值调节为3.0、5.0、7.0。研究发现，随着发酵上清液pH值升高，4株乳酸菌对A. flavus和F. graminearum的抑菌效果均有所下降，表明发酵产生有机酸及其诱导的低pH值环境可能是发挥其抑菌效果的主要原因。但当中和发酵有机酸时（pH值调节至7.0），4种功能菌均仍具有抑菌活性，表明可能还含有其他机制或途径协同抑菌。

乳酸菌所具备的抑菌活性在一定程度上受环境温度的变化而发生改变。对发酵上清液进行60、80、100 ℃处理后，发现随着温度的上升，4种乳酸菌对A. flavus的抑菌效果均显著下降，但加热处理并未影响各菌株对F. graminearum的抑菌效果，表明4株乳酸菌发酵液中对A. flavus的抑菌物质存在热不稳定性。ALBANO等^[17]将植物乳植杆菌（L. plantarum）发酵上清液在不同温度条件下处理60 min，发现经过100 ℃处理后，其对大肠杆菌（Escherichia coli）的抑菌活性显著降低，表明其抑菌物质在高温条件下失活或变性。短乳杆菌（Lactobacillus brevis）无细胞上清液经121 ℃处理15 min后，其抗菌效果未产生显著影响，表明抗菌物质的热敏性受菌株和结构不同而存在差异^[18]。

乳酸菌发酵产物中发挥主要抑菌作用的物质可能是蛋白质、多肽等^[19]，本研究对4株乳酸菌上清液进行不同蛋白酶酶解处理后，发现经胃蛋白酶处理的LP64对A. flavus和F. graminearum抑菌活性显著降低，表明蛋白质是其抑菌主要活性物质。在蛋白酶K处理后，乳酸菌LP10对A. flavus抑制效果、LF92对F. graminearum抑制效果、LP64对A. flavus和F. graminearum抑制效果均显著降低，表明乳酸菌可能通过产生丝氨酸或类丝氨酸物质来抑制F. graminearum的增殖^[20]。

除直接抑制霉菌生长外，乳酸菌的脱毒特性是降低青贮毒素风险的另一核心功能，二者共同构成了乳酸菌防控霉菌污染的双重防线。微生物降低霉菌毒素含量主要通过细胞壁吸附、生物转化和化学降解^[21]。吸附作用是指微生物细胞壁上的某些特定结构通过与霉菌毒素发生非共价键相互作用（主要是范德华力），这种作用有助于减少霉菌毒素在畜禽胃肠道中的吸收，从而减轻其对家畜的潜在毒性。降解作用是微生物在代谢过程中通过改变霉菌毒素的化学结构或将霉菌毒素转化为毒性较低或无毒的物质^[22]，从而有效消除其对畜禽健康的潜在威胁。为了探究试验菌株对ZEN和DON的脱毒特性，本研究制备了试验菌株的发酵液、上清液和菌体沉淀等组分液，并将其与毒素反应，结果表明，各菌株的上清液和菌体沉淀均可有效去除ZEN和DON。菌株LP64、LP71、LF92的上清液脱毒率均显著低于其菌体沉淀，表明乳酸菌LP64、LP71、LF92主要通过吸附作用发挥对ZEN的脱毒作用。CHEN等^[23]基于酯酶的活性特性，筛选出3株可对ZEN脱毒的植物乳杆菌（L. plantarum）菌株，进一步研究表明，这3株植物乳酸菌首先通过吸附机制将ZEN紧密结合到其细胞壁上，之后利用自身分泌的酯酶对吸附在细胞壁上的ZEN进行降解，从而有效减少其毒性。菌株LP64、LF92的菌体沉淀对DON的脱毒率显著高于上清液，而菌株LP10、LP71的上清液脱毒率显著高于菌体沉淀，说明菌株LP64、LF92主要通过细胞壁吸附来对DON进行脱毒，而菌株LP10、LP71主要通过生物降解来对DON进行脱毒。菌株LP64作为脱毒效果最好的菌株，生物降解效果也高于菌株LP71、LF92。本研究系统探究了4株乳酸菌对A. flavus和F. graminearum的抑菌活性及其对ZEN和DON的脱毒效果，结果表明，4株乳酸菌在酸性条件（pH值为3.0）下对A. flavus和F. graminearum抑菌活性最强，这表明酸性物质为其主要抑菌成分；高温仅降低对A. flavus的抑制效果。蛋白酶处理结果表明，蛋白质类物质在菌株抑制方面发挥重要作用。菌株通过吸附或生物降解作用去除ZEN和DON，其中，植物乳植杆菌LP64脱毒率最高，可作为青贮饲料生物防控的候选菌株。

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基金资助

常州市农业科技创新与示范推广项目(KCSF（2023）03)