小偃麦衍生系抗旱基因功能分子标记检测及效应分析

Detection and Effect Analysis of Functional Molecular Markers of Drought- Resistant Genes in Wheat-Thinopyrum intermedium Introgression Lines

摘要

为进一步明确小偃麦衍生系抗旱等位基因组成，采用5个小麦抗旱基因TaNRX-B1、TaDreb-B1、TaPYL1-1B、TaBADH-A1和TaDRO-5B的功能分子标记检测了175份小偃麦衍生系，并结合萌发期13个抗旱指标的抗旱系数和综合评价D值，分析了各等位基因的抗旱效应。结果显示，5个抗旱等位基因在小偃麦衍生系中的频率总体偏低，其中，TaDreb-B1a的频率最高，为38.86%；TaDRO-5B基因的Hap-5B-I的频率最低，为5.14%。在117份中等以上抗旱性衍生系中，2份携带4个抗旱等位基因的衍生系CH6310（TaDreb-B1a/TaBADH-A1b/TaPYL1-1B^In-442 /Hap-5B-I）和CH1539（TaNRX-B1a/TaDreb-B1a/TaBADH-A1b/Hap-5B-I）均为强抗旱种质；13份强抗旱衍生系未检测到任何抗旱等位基因，可能存在未知的抗旱相关基因。携带抗旱等位基因TaDreb-B1a、TaPYL1-1B^In-442 和Hap-5B-I种质的多数指标抗旱系数均值高于携带其干旱敏感等位基因的衍生系，且抗旱等位基因与多个指标抗旱系数呈显著正相关，抗旱效应较高。因此，抗旱基因TaDreb-B1、TaPYL1-1B和TaDRO-5B的功能标记能够有效用于小偃麦衍生系抗旱基因型检测及分子标记辅助选择育种。

Abstract

In order to further clarify the favor alleles of drought-resistant gene composition in the wheat-Thinopyrum intermedium introgression lines, in this study, the functional molecular markers of 5 wheat drought resistant genes, including TaNRX-B1, TaDreb-B1, TaPYL1-1B, TaBADH-A1, and TaDRO-5B, were used to detect 175 wheat-Thinopyrum intermedium introgression lines. The drought resistance effect of each allele was analyzed by combining the drought resistance coefficients of 13 drought-resistant indicators and the comprehensive evaluation D value at the germination stage. The results showed that the frequency of the 5 drought-resistant alleles was generally low in the introgression lines, among which TaDreb-B1a had the highest proportion(38.86%) and Hap-5B-I allele of TaDRO-5B gene had the lowest proportion(5.14%). Among the 117 lines with moderate or above drought resistance, CH6310(TaDreb-B1a/TaBADH-A1b/TaPYL1-1B^In-442/Hap-5B-I) and CH1539(TaNRX-B1a/TaDreb-B1a/TaBADH-A1b/Hap-5B-I), carrying 4 drought-resistant alleles, were highly drought-resistant lines. As the five drought-resistant alleles were not detected in the 13 highly drought-resistant lines, there might be new unknown drought-resistant genes. The average drought resistance coefficients of most indicators of introgression lines carrying drought-resistant alleles TaDreb-B1a, TaPYL1-1B^In-442 and Hap-5B-I were higher than those of introgression lines carrying their drought-sensitive alleles. The drought-resistant alleles were significantly positively correlated with the drought resistance coefficients of multiple indicators, and the drought resistance effect was higher. Therefore, the functional molecular markers of drought-resistant genes such as TaDreb-B1, TaPYL1-1B and TaDRO-5B could be effectively used for drought-resistant genotype detection and molecular marker-assisted selection breeding in wheat-Thinopyrum intermedium introgression lines.

Graphical abstract

关键词

小偃麦衍生系 / 抗旱基因 / 功能分子标记 / 等位基因 / 抗旱系数

Key words

wheat-Thinopyrum intermedium introgression line / drought resistant gene / functional molecular marker / alleles / drought resistance coefficient

干旱是影响小麦产量和品质的重要因素之一，加强抗旱性品种选育是促进小麦持续高产稳产和保障国家粮食安全的有效途径^[1]。研究表明，小麦在不同生育时期受到干旱胁迫时，会引发农艺性状、生理、细胞、生化等多方面的响应变化。抗旱性是受多基因协同调控且易受环境影响的复杂数量性状^[2-3]。随着小麦参考基因组信息的日趋完善，以及表型与基因型鉴定技术的快速发展，小麦优异基因资源发掘和分子标记开发效率大幅提升。目前，利用与抗旱性相关的农艺性状、生理生化指标已经鉴定出多个与小麦抗旱性有关的数量性状位点（Quantitative trait loci，QTL）和关键基因，并基于这些基因的启动子或编码区序列变异开发了不同类型的分子标记^[4-6]，进而为分子标记辅助选择育种提供了更丰富的工具与选择。

研究表明，硫氧还蛋白（Trx）^[7]、脱落酸受体^[8]、脱水反应元件结合蛋白（DREB）^[9-10]、甜菜碱醛脱氢酶（BADH）^[11-12]等均在植物生长发育和抵御逆境胁迫中发挥着极其重要的作用，根据这些蛋白相关基因开发的分子标记可用于种质资源的抗旱性鉴定。张帆等^[7]在普通小麦5B染色体短臂上克隆了1个硫氧还蛋白超家族新基因TaNRX，并基于该基因序列开发了显性互补STS标记，并能够用于检测抗旱等位基因TaNrx-B1a和干旱敏感等位基因TaNrx-B1b。MAO等^[8]研究发现，脱落酸受体基因TaPYL1-1B启动子区插入20 bp的TaPYL1-1B^In-442 等位基因，在保持高产的同时还增强了小麦的耐旱性，其分子标记InDel-442_genotyping可用于检测小麦种质的抗旱类型。WEI等^[10]根据TaDreb-B1基因770 bp处的SNP（A/C）设计开发的分子标记TaDreb-B1能够检测抗旱型等位基因TaDreb-B1a和干旱敏感型等位基因TaDreb-B1b。YU等^[12]基于TaBADH-A1基因第3内含子254 bp的序列开发了分子标记6AM，利用该标记检测了121份小麦品种，发现含TaBADH-A1b的材料的相对发芽率和耐旱性均高于含TaBADH-A1a的材料。张维军等^[13]通过同源克隆获得了小麦根系发育相关的TaDRO-5A、TaDRO-5B和TaDRO-5D基因，其中，基于与株高和千粒质量关系紧密的TaDRO-5B基因开发的分子标记TaDRO-5B-InDel能够用于检测深根抗旱单倍型Hap-5B-Ⅰ和浅根干旱敏感单倍型Hap-5B-Ⅱ。目前，TaNRX-B1、TaDreb-B1基因的分子标记已被应用于小麦育种材料的抗旱基因检测研究^[14-20]，而TaBADH-A1、TaPYL1-1B、TaDRO-5B基因的分子标记仅开发者进行过初步验证，在不同材料群体中应用较少。

CHANG等^[21]将中间偃麦草（Elytrigia intermedium）和长穗偃麦草（Elytrigia elongata）片段转移到普通小麦，创制了一批染色体数目为42条的小偃麦高代衍生系；SHENG等^[22]、张晓军等^[23]、张潇文等^[24]和常利芳等^[25]从这些衍生系中鉴定出抗病、耐盐及综合性状表现优异的衍生系材料。常利芳等^[26]对其中175份小偃麦衍生系进行了萌发期和成株期抗旱性鉴定及综合评价，鉴定出萌发期极强抗旱型材料23份、强抗旱型材料29份、中等抗旱型材料65份，还有29份弱抗旱型材料和29份干旱敏感型材料。为了进一步明确小偃麦衍生系的抗旱等位基因组成，本研究选用5个抗旱基因TaNRX-B1、TaDreb-B1、TaBADH-A1、TaPYL1-1B和TaDRO-5B的功能分子标记对175份小偃麦衍生系进行检测，分析其抗旱基因组成，并结合萌发期抗旱性各项指标的抗旱系数及综合评价D值，评价相关等位基因的抗旱效应，旨在为小麦抗旱育种亲本利用和分子标记辅助选择育种提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为183个小麦品种（系）材料，包括175份小偃麦衍生系^[26]和8个对照品种。对照品种包括晋麦47、运旱618、长6878、辽春10号、中国春、绵麦37、川麦104和周麦22，其中，长6878和晋麦47均为国家旱地小麦区试对照品种。以上材料均由山西省作物遗传与分子改良重点实验室保存。

1.2 试验方法

5个抗旱性相关基因(TaNRX-B1、TaDreb-B1、TaBADH-A1、TaPYL1-1B和TaDRO-5B)的分子标记信息见表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

采用改良的CTAB法提取供试材料幼苗叶片的基因组DNA，测定浓度后备用。参考对应文献中分子标记的PCR反应体系和扩增程序（表1）进行PCR扩增。分子标记TaNRX-B1a1、TaNRX-B1b1、TaDreb-B1的PCR扩增产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，分析标记6AM、TaDRO-5B-InDel、InDel-442_genotyping的PCR扩增产物采用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

1.3 数据统计分析

利用Excel 2011和SPSS 21.0软件进行数据处理、t测验和相关性分析。参考张海萍等^[27]的分析方法将携带抗旱等位基因的材料赋值为“1”，不含抗旱等位基因的材料赋值为“0”，并对各指标的抗旱系数进行相关性分析，评估各抗旱等位基因与抗旱系数之间的相关性。

2 结果与分析

2.1 小偃麦衍生系抗旱基因分子标记检测

利用TaNRX-B1、TaDreb-B1、TaBADH-A1、TaPYL1-1B、TaDRO-5B基因的分子标记分别对175份小偃麦衍生系进行了检测，结果如图1、表2所示。

图1、表2结果表明，62份种质扩增出TaNRX-B1a1抗旱等位基因的特异性片段（841 bp），占比为35.43%；68份种质扩增产物为抗旱等位基因TaDreb-B1a的特异性条带（616 bp+x），占比为38.86%；60份种质扩增出抗旱性等位基因TaBADH-A1b的特异性片段（574 bp），占比为34.28%；16份种质扩增出抗旱等位基因TaPYL1-1B^In-442 的特异性片段（209 bp），占比为9.14%；9份种质扩增出深根抗旱等位基因Hap-5B-I的特异性片段（357 bp），占比为5.14%。另有37份衍生系未检测到这5个抗旱基因的等位基因，占比21.14%。综上，175份小偃麦衍生系中抗旱等位基因TaDreb-B1a的分布频率最高，为38.86%，Hap-5B-I的分布频率最低，为5.14%。

2.2 小偃麦衍生系的抗旱等位基因分布

不同抗旱等级小偃麦衍生系的抗旱等位基因分布如表3所示。

结合前期常利芳等^[26]萌发期抗旱性分级结果，从表3可以看出，117份中等以上抗旱性衍生系中，42份携带1个抗旱等位基因，45份携带2个抗旱等位基因，3份检测到3个优异抗旱等位基因。含有3个抗旱优异等位基因的种质为CH16484（含有TaNRX-B1a、TaBADH-A1b、TaPYL1-1B^In442 ）、CH16352（含有TaNRX-B1a、TaDreb-B1a、TaPYL1-1B^In442 )、CH16381(含有TaNRX-B1a、TaDreb-B1a、TaBADH-A1b），其中，CH16484、CH16352抗旱性为3级，属于中度抗旱种质，CH16381为2级抗旱性，属于强抗旱种质。2份种质携带4个优异抗旱等位基因，分别为CH6310（含有TaDreb-B1a、TaBADH-A1b、TaPYL1-1B^In-442、Hap-5B-I）和CH1539（含有TaNRX-B1a、TaDreb-B1a、TaBADH-A1b、Hap-5B-I），其抗旱性分别为2级和1级，均为强抗旱种质。37份未检测到任何抗旱等位基因的材料中，包括1级极强抗旱种质5份，2级强抗旱种质8份，12份3级中度抗旱种质，推测其中可能存在新的未知的抗旱基因。

从表3可以看出，含有3个抗旱优异等位基因的4份衍生系中，3个材料表现出中等以上抗旱性，仅1份材料表现为干旱敏感型，但含有4个抗旱优异等位基因的2个衍生系均为强抗旱种质，不存在干旱敏感类型。说明随着携带抗旱等位基因数量的增加，衍生系的抗旱性也随之增强，多个抗旱等位基因的聚合增加了材料的抗旱性。

2.3 不同等位基因抗旱效应分析

基于前期常利芳等^[26]小偃麦衍生系萌发期抗旱性鉴定结果，选用萌发期13个指标的抗旱系数及综合评价D值数据，进一步分析不同抗旱等位基因的抗旱效应，其结果如表4所示。

从表4可以看出，5个抗旱等位基因与非抗旱等位基因的各指标抗旱系数平均值之间差异表现各不相同，差异显著性也各不相同。携带等位基因TaNRX-B1a的衍生系，其发芽率、根长、苗高、胚芽鞘长、叶鲜质量和叶干质量的抗旱系数平均值均大于携带TaNRX-B1b的衍生系，但差异不显著；携带TaNRX-B1a的衍生系的其余8个指标的抗旱系数平均值均小于携带TaNRX-B1b的衍生系，其中，二者的干根冠比抗旱系数均值差异显著（P<0.05）。携带TaBADH-A1b的衍生系，其胚根数、干根冠比和苗高的抗旱系数均值大于携带TaBADH-A1a的衍生系，但差异不显著。其余11个指标的抗旱系数均值均是携带TaBADH-A1a的衍生系大于携带TaBADH-A1b的衍生系，且二者苗高抗旱系数均值差异显著（P<0.05）。携带抗旱等位基因TaDreb-B1a的萌发期D值、发芽势、根长、苗高、胚芽鞘长、叶鲜质量、根鲜质量、叶干质量、根干质量、鲜根冠比和干根冠比的抗旱系数均值均大于携带TaDreb-B1b的衍生系，且携带TaDreb-B1a与携带TaDreb-B1b的衍生系的苗高抗旱系数均值差异显著（P<0.05）；携带TaPYL1-1B^In-442 的衍生系，在除了发芽率、发芽指数、苗高外的11个指标的抗旱系数均值均大于携带TaPYL1-1B^Del-442 的衍生系，二者间仅胚根数抗旱系数均值表现显著差异（P<0.05）。携带抗旱等位基因Hap-5B-I的衍生系萌发期D值、发芽势、发芽指数、根长、胚根数、胚芽鞘长、叶鲜质量、根鲜质量、根干质量、干根冠比、鲜根冠比等11个指标抗旱系数均值均大于携带Hap-5B-II的材料，且二者之间萌发期D值、根鲜质量、根干质量和干根冠比抗旱系数均值均差异显著（P<0.05）。

相关性分析结果表明（表5），TaNRX-B1a与干根冠比呈显著负相关（P<0.05），相关系数为0.174。TaDreb-B1a与苗高呈显著正相关（P<0.05），r=0.170。TaBADH-A1b与苗高呈显著负相关（P<0.05），r=0.189。TaPYL1-1B^In-442 与胚根数呈极显著正相关（P<0.01），r=0.198。TaDRO-5B基因的等位基因Hap-5B-I与萌发期D值、根鲜质量、根干质量和干根冠比均呈显著正相关（P<0.05）。

综上，TaDreb-B1、TaPYL1-1B、TaDRO-5B基因的抗旱等位基因与各指标的抗旱系数一致性较好，且与多个抗旱指标显著相关，抗旱效应较高，其分子标记能够用于小麦抗旱性材料的辅助筛选。

3 结论与讨论

本研究用5个抗旱基因（TaNRX-B1、TaDreb-B1、TaPYL1-1B、TaDRO-5B、TaBADH-A1）的6对分子标记检测了175份小偃麦衍生系，明确了其抗旱等位基因组成，发现5个抗旱优异等位基因在供试材料中频率总体偏低，但携带多个抗旱等位基因的种质表现出较强的抗旱性，其中，13份强抗旱种质中未检测到这5个抗旱等位基因，推测可能含有其他未知的抗旱基因。此外，TaDreb-B1、TaPYL1-1B和TaDRO-5B抗旱等位基因的多个指标抗旱系数均值高于其干旱敏感等位基因，且与多个指标抗旱系数呈显著正相关，抗旱效应值较高，可有效用于小麦种质资源的抗旱性分子标记辅助检测。

利用分子标记检测携带优异抗旱等位基因的小麦种质资源，可以加速优异抗旱种质的有效利用。前人已利用上述5个抗旱基因的功能标记鉴定了不同类型的小麦种质，表明这些优异抗旱等位基因已经在小麦抗旱育种中得到了应用。吴晓军等^[17]对46份黄淮海小麦品种进行抗旱基因检测发现，抗旱基因TaNRX-B1a占比为45.7%，TaDreb-B1a占比为95.7%。孙晓燕等^[15]对137份春小麦育种材料进行抗旱基因检测发现，抗旱基因TaNRX-B1a占比为65.69%。MAO等^[8]对120份小麦品种进行抗旱基因检测发现，抗旱等位基因TaPYL1-1B^In-442 占比为48.3%。张芳等^[28]对83份新疆冬小麦品种(系)的抗旱基因进行检测发现，TaNRX-B1a占比为83.1%。李玮等^[29]利用KASP标记对31份抗旱、高产小麦品种的抗旱基因进行检测发现，TaPYL1-1B^In-442 占比为83.87%，TaDreb-B1a占比为77.42%。张维军等^[13]对中国小麦微核心种质的抗旱基因进行检测后发现，TaDRO-5B基因在地方品种中以等位基因Hap-5B-Ⅰ(75.16%)为主，现代育成品种中则以Hap-5B-Ⅱ(81.82%)为主。本研究中，5个抗旱优异等位基因的分布频率以TaDreb-B1a为最高，占比为38.85%，其次依次为TaNRX-B1a（占比为35.43%）、TaBADH-A1b（占比为34.28%）、TaPYL1-1B^In-442 （占比为9.14%）、Hap-5B-I（占比为5.14%）。与前人对不同类型种质抗旱等位基因检测结果相比，175份小偃麦衍生系含有优异抗旱等位基因的比例总体偏低。这可能是功能标记开发所用材料与小偃麦衍生系遗传背景差异较大，且仅检测了5个抗旱基因，不足以全面解释小偃麦衍生系的抗旱性表现。此外，小偃麦衍生系可能含有新的效应更强的抗旱基因，特别是13份表现极强或强抗旱性的衍生系未检测到任何抗旱等位基因，有待于利用关联分析和连锁分析等方法挖掘其中未知的抗旱相关基因。

前人多采用相对发芽率作为评价小麦抗旱性的指标来判断分子标记的有效性^[14-17]，而抗旱性是一个受多基因影响的复杂数量性状，仅用相对发芽率不足以全面评价材料的真实抗旱性。本研究结合小偃麦衍生系萌发期13个指标的抗旱系数以及综合评价D值，更加准确地反映了不同抗旱等位基因的效应。结果显示，携带抗旱等位基因TaDreb-B1a、TaPYL1-1B^In-442、Hap-5B-I的种质，其萌发期D值、最大根长、胚芽鞘长等多个指标的抗旱系数大于相应的携带TaDreb-B1b、TaPYL1-1B^Del-442、Hap-5B-II的种质；携带TaNRX-B1a的种质在发芽率、胚芽鞘长等8个指标的抗旱系数均值大于携带TaNRX-B1b的材料；携带TaBADH-A1b的种质仅胚根数、干根冠比的抗旱系数大于携带TaBADH-A1a的种质，其余指标则反之。以上结果表明，TaDreb-B1、TaPYL1-1B、TaDRO-5B的抗旱等位基因效应较高，其标记能够有效地检测供试材料的抗旱性。本研究基于多个萌发期抗旱相关指标证明了TaDreb-B1、TaPYL1-1B、TaDRO-5B基因功能标记的有效性，为抗旱育种的标记辅助选择提供了更简单实用的分子标记。

此外，由于抗旱性是众多基因协调调控的复杂性状，加之环境影响及基因间的连锁与互作效应，仅单个或少数优异抗旱等位基因不足以全面反映种质材料抗旱性表现，聚合多个优异抗旱基因可以有效提高材料的抗旱性水平^[18-20，30]。本研究中，27份携带1个抗旱等位基因的衍生系表型为干旱敏感型，但携带3个优异抗旱等位基因的衍生系中，CH16484、CH16352的萌发期抗旱性为3级，属于中度抗旱种质，CH16381萌发期抗旱性为2级，属于强抗旱种质，携带4个优异抗旱等位基因的CH6310和CH1539分别为2级和1级抗旱性，分别属于强和极强抗旱种质。进一步根据常利芳等^[26]成株期抗旱性鉴定结果分级发现，CH16352成株期抗旱性为3级，CH16381为1级，CH6310为2级，CH1539为3级，均表现为中等以上抗旱性，仅CH16484表现为5级，对干旱较为敏感。这5份衍生系可以作为抗旱种质加以利用，同时也证明了多个抗旱等位基因聚合能够增加材料的抗旱性。将来可通过更多方法挖掘抗旱基因资源，开发更多的主效抗旱基因功能标记，以进一步提高抗旱小麦品种的分子标记辅助选择效率，进行多基因聚合育种，解决抗旱性育种中的实际问题。

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基金资助

山西省基础研究计划(202403021211048)

农业农村部政府购买服务项目(19230606)