根际生防菌田间应用对丹参生长及药用品质的影响

Effects of Field Application of Rhizospheric Biocontrol Bacteria on Growth and Medicinal Quality of Salvia miltiorrhiza

摘要

为探究根际生防菌对丹参促生、防病及品质的影响，使用从丹参根际土壤中分离的Paenibacillus polymyxa Pp146、Bacillus velezensis Bv1-4、Pseudomonas jessenii Pj01-9、Streptomyces syringium SY6-10、B. haynesii CYM6-3、S. toxytricini 136等6株生防菌株、灌溉水（CK）分别对丹参进行灌根处理，系统评价其对丹参根生长指标、根腐病防治及根内23种化学成分（包括5种丹参酮类和18种丹酚酸类）的影响。结果表明，6株生防菌田间灌根处理对丹参根长、根直径及根条数无显著促生作用；除菌株Pp146外，其余5株生防菌处理较CK丹参的根鲜质量均显著提高。在病害防控方面，6株生防菌对丹参根腐病的防治效果达34.31%~65.59%，其中，菌株Bv1-4、CYM6-3显著降低了根腐病的发病率，菌株Pp146、Bv1-4、Pj01-9、SY6-10、CYM6-3显著降低了病情指数。化学成分测定结果表明，菌株Bv1-4显著提高了丹参酮类（丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ_A、丹参新酮）和丹酚酸类（原儿茶醛）的含量；菌株136显著促进了丹酚酸B的积累；菌株Pj01-9显著增加了咖啡酸、丹酚酸C的含量；菌株SY6-10显著提升了丹参素的含量。综上，6株生防菌对丹参田间根腐病防控、产量提升及化学成分积累均具有较好效果，其中，菌株Bv1-4表现出最优的综合效果。

Abstract

To explore the effects of rhizospheric biocontrol bacteria on growth promotion, disease prevention, and quality of Salvia miltiorrhiza, in this study, six biocontrol bacteria(Paenibacillus polymyxa Pp146, Bacillus velezensis Bv1-4, Pseudomonas jessenii Pj01-9, Streptomyces syringium SY6-10, B. haynesii CYM6-3, and S. toxytricini 136) isolated from the rhizosphere soil of S. miltiorrhiza and water(CK) were utilized for root irrigation treatments, respectively. The effects of these biocontrol bacteria on root growth parameters, root rot disease control, and the contents of 23 chemical components(including 5 tanshinones and 18 phenolic acids) in the roots of S. miltiorrhiza were systematically evaluated. The results demonstrated that the field root irrigation treatment with six biocontrol bacteria had no significant growth-promoting effect on the root length, root diameter, and the root branch number. The analysis of the fresh root weight of the plots revealed that except for isolate Pp146, the fresh root weight of the plots treated with the other five biocontrol bacteria was significantly higher than that of CK treatment. In terms of disease control, the six biocontrol bacteria exhibited a control efficacy of root rot ranging from 34.31% to 65.59% against root rot disease. Specifically, the incidence rate of root rot was significantly reduced by B. velezensis Bv1-4 and B. haynesii CYM6-3, while the disease index was significantly decreased by P. polymyxa Pp146, B. velezensis Bv1-4, P. jessenii Pj01-9, S. syringium SY6-10, and B. haynesii CYM6-3. The results of the chemical component determination indicated that B. velezensis Bv1-4 significantly promoted the contents of tanshinones(tanshinone I, tanshinone II_A, and miltirnone) and phenolic acids(protocatechualdehyde); S. toxytricini 136 significantly enhanced the accumulation of salvianolic acid B; P. jessenii Pj01-9 significantly increased the contents of caffeic acid and salvianolic acid C; and S. syringium SY6-10 significantly enhanced the content of danshensu. In conclusion, the six biocontrol bacteria strains had demonstrated significant effects on the prevention and control of root rot disease, yield improvement, and chemical component accumulation in Salvia miltiorrhiza under field conditionsf, with B. velezensis Bv1-4 demonstrating the most comprehensive effects.

Graphical abstract

关键词

丹参 / 根际生防菌 / 生长指标 / 化学成分 / 根腐病发病率 / 微生物菌剂

Key words

Salvia miltiorrhiza / rhizospheric biocontrol bacteria / growth parameter / chemical component / incidence of root rot / microbial agent

近年来，随着我国中医药事业的蓬勃发展，中药材需求量持续增长，作为中医药产业链源头的中药材种植业也迎来了快速发展^[1]。然而，在种植规模不断扩大的同时，过度施用化肥农药、盲目追求产量等问题日益凸显，对中药材产地的生态环境和药材品质造成了严重威胁^[2]。在此背景下，对植物有益微生物为核心的微生物菌剂进行开发，其绿色、可持续等优势已成为当前中药农业发展的重点方向^[2-3]。

丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）为唇形科鼠尾草属的重要药用植物，其干燥根及根茎具有活血祛瘀、凉血消痈、清心除烦等功效^[4]，被广泛应用于多种中药方剂中^[5-7]。丹参的化学成分主要包括脂溶性的丹参酮类和水溶性的丹酚酸类，其中，丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ_A、隐丹参酮和丹酚酸B是丹参的主要有效成分，也是《中国药典（2020版）》规定的丹参质检的指标性成分^[4]。近年来，随着我国丹参大面积集约化种植，连作障碍、病虫害等问题日益严重^[8]，尤其是在丹参整个生长期均可发生、田间发病普遍的根腐病，严重影响丹参的产量和品质，已成为制约丹参生产的主要病害^[9-10]，急需开发有效的防治药剂。研究表明，从药用植物根内或根际土壤中分离的有益微生物（如根瘤菌属Rhizobium、芽孢杆菌属Bacillus、假单胞菌属Pseudomonas、克雷伯氏菌属Klebsiella等）具有固氮、溶磷、产生植物激素等多种功能^[11-13]，可通过调节植物激素水平或增强植物营养吸收促进植物生长^[14-15]。此外，这些有益微生物还能促进药用植物次生代谢产物的合成与积累^[16-19]。利用有益微生物资源开发药用植物专用的微生物菌剂，对中药产业发展、药用品质提升具有重要意义。

目前，针对丹参的有益微生物研究主要聚焦于促生、次生代谢调控与产物积累，且多局限于室内，而大田应用中兼具促生和防病功能的有益微生物对丹参化学成分的影响尚未见报道。基于此，本研究以田间种植丹参为研究对象，选取从丹参根际分离并经室内验证兼具促生与防病效果的6株生防菌进行田间灌根试验，系统评价其对丹参生长、根腐病防控及化学成分的影响，以期为丹参生产中绿色高效微生物菌剂的开发与应用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物

供试材料为河南省农业科学院植物保护研究所选育的郑丹1号丹参，经河南省农业科学院植物保护研究所秦艳红研究员鉴定为唇形科植物丹参（S. miltiorrhiza Bge.）。

1.1.2 生防菌株

供试生防菌株多黏类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa Pp146、贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis Bv1-4和杰氏假单胞菌Pseudomonas jessenii Pj01-9，来源于河南省农业科学院植物保护研究所中药材病虫害研究室菌源库。生防菌株Streptomyces syringium SY6-10、海内氏芽孢杆菌B. haynesii CYM6-3和毒三素链霉菌S. toxytricini 136，来源于河南农业大学植物保护学院生物防治研究室菌源库。

1.1.3 培养基

LB固体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，琼脂18 g，蒸馏水1 000 mL。LB液体培养基：以不加琼脂的LB培养基为LB液体培养基。高氏一号固体培养基（用于链霉菌培养）：可溶性淀粉20 g，硝酸钾1 g，磷酸氢二钾0.5 g，七水硫酸镁0.5 g，氯化钠0.5 g，七水硫酸亚铁0.091 5 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。高氏一号液体培养基（用于链霉菌培养）：以不加琼脂的高氏一号固体培养基为高氏一号液体培养基。

1.1.4 仪器与试剂

ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-S micro IVD系统购自美国Waters 公司。对照品：丹参酮Ⅰ（批号20090901）、丹参酮Ⅱ_A（批号22012016）、隐丹参酮（批号20090909）、二氢丹参酮Ⅰ（批号20090910）、丹参新酮（批号21100627），富马酸（批号23112302）、琥珀酸（批号23100943）、苹果酸（批号21032511）、原儿茶醛（批号21032401）、D-酒石酸（批号20060516）、咖啡酸（批号20060809）、柠檬酸（批号20082009）、阿魏酸（批号20061150）、丹参素（批号21031005）、紫草酸（批号21101928）、迷迭香酸（批号20081109）、异迷迭香酸苷（批号22061681）、丹酚酸A（批号21010801）、丹酚酸B（批号21010802）、丹酚酸C（批号21010803）、丹酚酸D（批号20062243）、丹酚酸E（批号22012351）、丹酚酸Y（批号22012351）均购自北京倍特仁康生物医药科技有限公司。色谱纯甲醇、乙腈及液相色谱-质谱联用仪（Liquid Chromatograph Mass Spectrometer，LC-MS）、分析用甲酸均购自美国Fisher Scientific公司；实验用水为屈臣氏蒸馏水；0.22 μm PTFE滤膜购自天津津腾实验设备有限公司。

1.2 试验设计

在河南省许昌市禹州市广顺种植专业合作社丹参种植田，设置7个处理，分别为6株生防菌发酵稀释液（发酵液浓度为2.0×10⁹ cfu/mL，田间施用时稀释100倍）和灌溉水处理（CK）；试验采用单因素完全随机区组设计，每个处理4次重复，每个小区18 m²（长7.5 m，3垄，一垄双行，垄间距80 cm，行距20 cm，株距20 cm）。于7月丹参苗期采用灌根方式处理一次，每株100 mL，30 d后用同样方法和用量再处理一次，共处理2次，其他管理按当地常规栽培措施进行。

1.3 生防菌田间应用对丹参的促生防病试验

1.3.1 生防菌发酵液制备

分别将菌株活化至LB固体培养基和高氏一号固体培养基（链霉菌），置于28 ℃恒温培养箱中培养48 h，然后使用灭菌牙签分别挑取菌株单菌落转入装有对应液体培养基的锥形瓶内，放入28 ℃、180 r/min摇床，培养72 h后将各菌株发酵液浓度调至2.0×10⁹ cfu/mL，即得各菌株发酵液。

1.3.2 田间调查

于丹参收获期，每小区收集所有丹参根样品测定小区根鲜质量；每小区随机选取20株丹参根样品，测定丹参根长、根直径、根条数，调查根腐病发病率及发病级数；另每处理随机选取9株根样品编号后阴干，干燥后的单株根样品进行化学成分含量测定。田间调查参照孙泽瑞^[20]的丹参根腐病病害分级方法，分级标准如下。

0级.植株主根生长正常，茎基部无病害；1级.表皮表现出轻微病症，但病症未侵染内部组织；3级.表皮呈现明显病症，维管束呈褐色；5级.维管束呈深褐色，导管木质化，根部开始腐烂，腐烂部分占总根的30%以下，生长受阻；7级.根部腐烂部分占总根的30%以上或全株因病萎蔫；9级.植株地上部分全部干枯死亡，并且根系全部腐烂。

1.3.3　利用各处理小区丹参根腐病病级，计算病情指数。利用处理组及对照组病情指数，计算防治效果。

发病率=\frac{\mathrm{发病}\mathrm{株数}}{\mathrm{调查}\mathrm{总株}\mathrm{数}}×100%（1）

病情指数=\sum（病级数×该病级株数）/（最高病级数×调查总株数）×100%（2）

防治效果=（对照组病情指数-处理组病情指数）/对照组病情指数×100%（3）

1.4 丹参的化学成分含量测定

1.4.1 待检样品溶液制备

干燥后的单株根样品利用打粉机粉碎，粉碎后样品过0.25 mm筛，装入封口袋并编号备用；待检样品溶液的制备参照《中国药典（2020版）》^[4]对丹参丹酚酸类及丹参酮类的提取方法，实验条件参照王巧等^[21]的方法。称取待检样品时，封口袋内样品需充分混匀，精密称取样品干燥粉末15 mg，置于2 mL离心管内，每个样品称取2管；每管样品中分别加入80%甲醇（酚酸类提取试剂）或纯甲醇（丹参酮类提取试剂）1.5 mL，称定质量，超声提取（功率300 W，频率40 kHz）40 min；冷却后称定质量，分别用对应提取试剂补足失质量。以12 000 r/min离心5 min，上清液过0.22 µm微孔滤膜后即得待检样品溶液。

1.4.2 对照品溶液制备及样品成分的测定

精密称取丹酚酸B对照品1.83 mg，加甲醇配制质量浓度为1 mg/mL的单一对照品溶液，4 ℃下冷藏保存，供超高效液相色谱（UPLC）分析用；另分别精密称取其他成分对照品适量，加甲醇配制质量浓度为1 mg/mL的单一对照品备用液，然后根据响应值量取各对照品备用液适量，加甲醇配制质量浓度为20 µg/mL不等的混合对照品溶液，4 ℃下冷藏保存，供超高效液相色谱—三重四极杆质谱联用技术（UPLC-QQQ-MS）分析用。

1.4.3 色谱条件

Waters XBridge BEH C₁₈色谱柱（3.0 mm×100 mm，2.5 μm），柱温为40 ℃，进样量为1 μL，流速为0.3 mL/min；流动相A为0.1%甲酸乙腈；流动相B为0.1%甲酸水溶液；丹酚酸B等度洗脱程序：0 min，A（25%）；3 min，A（25%）；检测波长为287 nm。酚酸类梯度洗脱程序：0 min，A（5%）；3.5 min，A（30%）；6.0 min，A（60%）；6.5 min，A（90%）；7.5 min，A（90%）；8 min，A（5%）；10 min，A（5%）；丹参酮类洗脱程序：0 min，A（65%）；3.5 min，A（75%）；4.5 min，A（65%）；7.0 min，A（65%）。

1.4.4 质谱条件

采用电喷雾离子源（ESI），丹参酮类成分采用正离子扫描，酚酸类成分采用负离子扫描；气帘气流速为30 L/min，喷雾电压为5 500 V（正离子）和-4 500 V（负离子）；雾化气流速为50 L/min，加热辅助气流速为50 L/min；采集方式为多反应监测（MRM）模式，离子源温度为150 ℃，脱溶剂温度为500 ℃。其他质谱条件见表1。

1.5 数据分析

采用WPS Office 2024软件进行数据处理，采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，采用Origin 2024软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同生防菌处理对丹参的促生效果

于丹参收获期对不同处理丹参地下部根的表型性状调查结果显示（图1），CK的丹参平均根长为25.33 cm，6株生防菌处理后的丹参平均根长均小于CK，但未达显著水平；除菌株CYM6-3外，其他5株生防菌处理后的丹参平均根直径均大于CK（0.97 cm），但各处理间同样未达显著水平；各处理组丹参的平均根条数为5~7条，其中，菌株Bv1-4处理丹参的平均根条数为5条，与菌株Pj01-9处理差异不显著，但显著少于其他生防菌和CK（P<0.05）。

不同生防菌处理组的小区根鲜质量测定结果显示（图1），CK的小区根鲜质量为28.25 kg，除菌株Pp146外，其他5株生防菌处理的小区根鲜质量均显著大于CK（P<0.05），均表现出良好的增产效果。

2.2 不同生防菌处理对丹参根腐病的防治效果

不同生防菌处理对丹参根腐病的防治效果如图2所示。

丹参收获期对不同生防菌处理组的根腐病发病率及病害严重度的调查结果表明（图2），CK丹参根腐病的发病率为32.50%，6株生防菌处理均可降低根腐病的发病率，其中，菌株Bv1-4、CYM6-3处理的丹参根腐病平均发病率分别为13.75%和15.00%，均显著低于CK（P<0.05）；除菌株136外，其他5株生防菌处理较CK均显著降低了丹参根腐病病情指数（P<0.05）。

利用病情指数计算根腐病的防治效果结果显示（表2），6株生防菌处理对丹参根腐病的防治效果为34.31%~65.59%，其中，菌株Bv1-4和CYM6-3处理对丹参根腐病防治效果分别为65.59%和62.46%，均达60%以上，表现出对丹参根腐病较好的防治效果。

2.3 不同生防菌处理对丹参指标性成分含量的影响

不同生防菌处理丹参指标性成分含量测定的结果显示（图3），菌株Bv1-4处理较CK可显著提高丹参内丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ_A的含量（P<0.05），而其他5株生防菌对丹参内丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ_A含量的影响不显著。按照《中国药典（2020版）》对丹参干燥品指标性成分的含量要求，丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ_A、隐丹参酮的总含量不得少于0.25%，丹酚酸B的含量不得少于3.0%。本试验中不同生防菌及CK的丹参成分含量均可满足药典的要求，CK丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ_A、隐丹参酮的总含量为1.02%，菌株Bv1-4处理丹参的这3个成分总含量达到1.27%。另外，6株生防菌处理均可一定程度上提高丹酚酸B的含量，菌株136处理与CK间差异显著（P<0.05），其他5株处理与CK间均未达显著水平。

2.4 不同生防菌处理对丹参其他成分含量的影响

除《中国药典（2020版）》规定的丹参指标性成分外，不同生防菌处理还可对丹参其他成分含量产生影响。如表3所示，相较于CK，菌株Bv1-4处理可以显著提高丹参新酮、原儿茶醛的含量（P<0.05），菌株Pj01-9处理可显著提高咖啡酸、丹酚酸C的含量（P<0.05），菌株SY6-10处理可显著提升丹参素的含量（P<0.05）；而菌株Bv1-4、CYM6-3、136处理却显著降低了丹酚酸A的含量（P<0.05）。

2.5 不同生防菌处理对丹参总丹参酮和总酚酸含量的影响

不同生防菌处理对丹参总丹参酮和总酚酸含量的影响如图4所示，菌株Bv1-4处理较其他5株生防菌和CK显著提升了总丹参酮含量（P<0.05），其余5株生防菌处理均低于CK的总丹参酮含量。此外，6株生防菌处理与CK的总酚酸含量间均无显著差异。

3 结论与讨论

植物与微生物的共生关系是自然界中普遍存在的现象。研究表明，植物在其根际、叶际、种子表面及体内定殖着丰富的微生物群落^[22-24]。这些微生物与植物经过长期进化形成了互利共生关系，在植物生长发育、养分吸收以及应对干旱、盐分、重金属等非生物胁迫和病虫害等生物胁迫过程中发挥着重要作用^[25-28]。近年来，关于有益微生物对植物生长促进及病害防控的研究取得了显著进展。KUMAR等^[29]从姜黄根状茎内分离获得9株具有固氮、溶磷和产IAA能力的生防菌株，其中荧光假单胞菌P. fluorescens对姜黄叶片数、茎高及根状茎鲜质量等表现出显著促生效果；陈逢玲等^[30]从关防风根际土壤中筛选出2株贝莱斯芽孢杆菌B. velezensis，其对关防风立枯病的盆栽防效均超过60%；马召等^[8]通过盆栽试验证实，3株丹参根内细菌可促进丹参幼苗的主根长度、直径、地上与地下部生物量。然而，现有研究多局限于室内或温室条件下的效果评价，当这些有益微生物应用于田间时，往往面临防效不稳定、作用效果受限等问题^[31-32]。

本研究在前期已验证6株生防菌室内促生防病效果的基础上^[13，33]，进一步开展了田间应用研究，结果表明，6株生防菌田间处理对丹参根长、根直径的影响均未达显著水平；除菌株Bv1-4处理的丹参根条数显著少于CK外，其余处理与CK无显著差异。这一结果与室内盆栽试验中观察到的显著促生效果^[8，34]存在差异。另外，除菌株Pp146外，其余5株生防菌处理的小区根鲜质量均显著高于CK，结合其降低根腐病发病率和病情指数的试验结果，推测本研究中生防菌处理对丹参的增产效果主要由于其防病作用保证了各处理小区健康植株的数量。已有研究表明，土壤类型、水分含量、碳氮含量、酸碱度、温湿度等能够影响土壤中根际微生物的丰度和多样性^[35-38]，从而直接或间接影响根际生防菌对植物生长的促进作用，因此，经室内验证的根际生防菌在进行大田效果评价时，还需充分考虑田间复杂的环境因素对根际生防菌功能的直接或间接影响。此外，部分根际生防菌还可直接合成或诱导植物产生吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）、赤霉素（Gibberellic，GA）、细胞分裂素（Cytokinin，CTK）等多种激素类物质来促进植物生长^[34，39]，本研究中6株生防菌是否可直接产生或诱导丹参产生上述激素类物质还需进一步研究。

对于药用植物而言，根际、根内有益微生物除具有促生和增强抗逆能力外，还可影响其次生代谢产物的合成与积累，从而提升药材品质^[40-41]。然而，不同有益微生物对丹参活性成分的影响存在显著差异。研究表明，丹参根际土曲霉Aspergillus terreus和极细枝孢霉Cladosporium tenuissimum等真菌可促进丹参中丹参酮Ⅱ_A和隐丹参酮的合成与积累^[18]；丹参根际分离的泛菌属Pantoea和假单胞菌属Pseudomonas则能显著提高丹参中丹酚酸B、迷迭香酸的含量^[19]；而内生真菌深绿木霉Trichoderma atroviride^[17]以及青霉菌属Penicillium meloforme等^[42]在促进丹参酮类物质积累的同时，对酚酸类物质表现出抑制作用。本研究发现，生防菌处理可显著影响丹参指标性成分的含量，菌株Bv1-4处理可显著提高丹参酮类（丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ_A）和丹参新酮的含量，也可一定程度提升丹酚酸B的含量，同时未对其他丹酚酸类物质产生显著抑制，这与明乾良等^[17]和LI等^[42]的研究结果存在差异；菌株136处理则显著提高了丹酚酸B的含量，而对丹参酮类成分表现出轻微抑制。此外，生防菌处理也可显著影响丹参其他成分的含量，菌株Pj01-9处理可以显著提高咖啡酸和丹酚酸C的含量，菌株SY6-10处理可以显著提高丹参素的含量，这些差异可能源于不同生防菌对丹参次生代谢途径的调控机制存在多样性。丹参的优形优质受到其品种基因型、产区生态地理因子及农艺措施等多种因素综合作用的影响^[43]。生防菌处理对丹参特定化学成分含量的提升在不同品种上、不同产区间是否具有稳定效果，还有待于进一步研究。

本研究为生防菌田间应用效果评价提供了重要依据，筛选的促生、防病、提升丹参化学成分积累的优良菌株，为开发定向获得成分含量稳定、优形优质表型明显的丹参专用微生物菌剂提供了优质菌种资源，研究结果对实现丹参绿色、高产、优质种植具有重要指导意义。

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基金资助

国家中药材产业技术体系(CARS-21)

河南省中药材产业技术体系(HARS-22-11-Z1)

河南省农业科学院新兴学科(2024XK06)

河南省农业科学院自主创新项目(2025ZC51)

河南省科技攻关计划(252102111102)