地红蝽实时荧光定量PCR内参基因筛选

Screening of Internal Reference Genes for Real-Time Fluorescence Quantitative PCR of Pyrrhocoris tibialis（Hemiptera：Pyrrhocoridae）

摘要

为了筛选出地红蝽在雌雄成虫不同组织、不同性别和不同龄期个体中稳定表达的内参基因，基于地红蝽转录组数据以及参考昆虫常用内参基因，筛选出Hsc70、AK、GAPDH、α-Tub、EF1-α、SDHA、RPL32、β-Act等8个候选内参基因。采用荧光定量PCR（RT-qPCR）测定8个候选基因在地红蝽雌雄成虫的不同组织（包括头、胸、腹、足、翅、触角）、不同龄期（1~5龄和成虫）和不同性别个体中的表达量，并利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper、RefFinder等软件对其表达稳定性进行分析。结果表明，在地红蝽不同样品中各候选内参基因表达量存在差异，在地红蝽不同龄期内参基因稳定性排前3位的依次是EF1-α、SDHA、GAPDH基因，不同性别成虫中内参基因稳定性排前3位的依次是SDHA、RPL32、EF1-α基因，在雌成虫不同组织中内参基因稳定性排前3位的依次是EF1-α、α-Tub、β-Act基因，在雄成虫不同组织中内参基因稳定性排前3位的依次是EF1-α、GAPDH、β-Act基因。结合不同算法综合比较，在地红蝽不同龄期中，建议以EF1-α和SDHA基因作为内参基因；在不同性别成虫中，建议以SDHA和RPL32基因作为内参基因；在雌性成虫不同组织中建议以EF1-α和α-Tub作为内参基因；在雄性成虫不同组织中建议以EF1-α和GAPDH作为内参基因。

Abstract

In order to screen out reference genes stably expressing in different tissues of male and female adults, different genders, and different instar individuals of Pyrrhocoris tibialis Stål, in this study, eight candidate reference genes including Hsc70, AK, GAPDH, α-Tub, EF1-α, SDHA, RPL32, and β-Act were screened based on the transcriptome data of P. tibialis and the reference genes commonly used in insects. Real-time quantitative PCR(RT-qPCR) was used to determine the expression levels of 8 candidate genes in different tissues(including head, chest, abdomen, feet, wings, and antennae), different instars(1-5 instars and adults), and different genders of male and female adults of P. tibialis. The expression stability was analyzed by GeNorm, NormFinder, BestKeeper, RefFinder, and other software. The results showed that there were differences in the expression levels of candidate reference genes in different samples of P. tibialis. The top three reference genes for stability in different instars were EF1-α, SDHA, and GAPDH genes. The top three reference genes for stability in different adult genders were SDHA, RPL32, and EF1-α genes. The top three reference genes for stability in different tissues of female adults were EF1-α, α-Tub, and β-Act genes. The top three reference genes for stability in different tissues of male adults were EF1-α, GAPDH, and β-Act genes. Combined with the comprehensive comparison of different algorithms, it was recommended to use EF1-α and SDHA genes as the internal reference genes in different instars. In different adult genders, SDHA and RPL32 genes were recommended as the internal reference genes. EF1-α and α-Tub were recommended as the internal reference genes in different tissues of female adults. EF1-α and GAPDH were recommended as the internal reference genes in different tissues of male adults.

Graphical abstract

关键词

地红蝽 / 组织 / 内参基因 / RT-qPCR / 表达稳定性

Key words

Pyrrhocoris tibialis Stål / tissues / reference gene / RT-qPCR / expression stability

地红蝽属于节肢动物门昆虫纲（Insecta）半翅目（Hemiptera）红蝽科（Pyrrhocoridae）红蝽属（Pyrrhocoris），具刺吸式口器，以植物种子和茎叶汁液为食。它是一种植食性害虫，能够危害谷子、糜子、玉米、绿豆、大豆等多种农作物^[1]，对农业生产构成严重威胁。地红蝽通常栖息于植物的表面或在地面活动，其卵则多产于泥土中或腐烂的落叶层内，这种生存习性及多食性使得其在特定环境中更易于繁殖和扩散，可生存和繁衍在不同的农业生态系统中，这也增加了防控的难度。目前，国内外对地红蝽的研究主要集中在其生物学特性、防御机制、线粒体基因组、特殊取食行为、取食偏好性等方面。因此，对地红蝽生理行为和分子机制展开研究，有助于后续开发防控新技术。2013年，刘晨等^[2]研究了使用不同溶剂提取得到的牛心朴子粗提物对地红蝽的毒杀效果，结果发现，牛心朴子的3种粗提物对地红蝽均有较强的胃毒作用，其中，无水乙醇粗提物的毒杀效果最好。赵瑞等^[3-4]研究了地红蝽在取食行为上的特殊性以及寄主植物叶片的物理特征与营养成分对其选择偏好的影响，结果发现，地红蝽具有吸水—携带种子攀爬—取食的特殊取食行为，且地红蝽成虫取食选择与寄主植物叶片长宽比、背面绒毛密度、含水量以及可溶性糖、总蛋白质含量有关。此外，KRAJICEK等^[5]采用气相色谱与质谱对始红蝽、地红蝽和埃及斑红蝽雌雄成虫挥发性防御分泌物进行了分析，结果发现，这些昆虫的分泌物成分具有较高的相似性，进而推断这种相似性可能与它们的反捕食策略相关。ZHANG等^[6]测定了地红蝽的完整线粒体基因组，并通过系统进化分析确定了扁蝽总科+（蝽总科+（长蝽总科+（红蝽总科+缘蝽总科）））的系统进化关系。

实时荧光定量PCR技术具有较高的灵敏度和特异性，能够准确地测定目标基因的表达水平。此外，该技术还具备良好的重复性，确保了试验结果的可靠性，成为生物学基因表达分析中广泛应用的技术^[7-8]。RT-qPCR技术成功的关键在于内参基因的合理选择。理想的内参基因应具有稳定的表达水平，可用于对试验数据进行校正与标准化，从而减少样本间差异，提高结果的准确性^[9-11]。越来越多的研究发现，昆虫的内参基因在不同处理条件下表达稳定性存在差异^[8]。MENG等^[12]对咖啡灭字虎天牛（Xylotrechus quadripes）RT-qPCR的内参基因进行了筛选，结果发现，RPL10α（Ribosomal protein）、RPS27α基因分别适合作为不同组织、不同发育阶段基因表达研究的内参基因；而在不同杀虫剂处理的基因表达研究中，适合选取EF-1α（Translation elongation factor 1 alpha）作为内参基因。还有研究发现，黏虫（Mythimna separate）成虫在不同光处理条件下可采用AK（Adenosine kinase）和GAPDH（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）基因作为最佳内参基因^[13]。朱红毛斑蛾（Phauda flammans）成虫基因表达内参基因筛选结果表明，TUB2（Tubulin）和GAPDH、TUB1和EF-lα、Actin3和TBP（TATA-box binding protein）基因可分别作为不同组织、成虫不同性别以及不同发育阶段基因表达研究的内参基因^[11]。

此外，国内外众多学者对用于研究昆虫基因表达的内参基因进行了深入的研究，鳞翅目棉铃虫（Helicoverpa armigera）^[14]、鞘翅目咖啡灭字虎天牛^[12]、半翅目牧草盲蝽（Lygus pratensis）^[15]、桃蚜（Myzus persicae）^[16]、俄罗斯麦蚜（Diuraphis noxia）^[17]、玉米飞虱（Delphacodes kuscheli）^[18]、大豆蚜（Aphis glycines）^[19]等物种已经筛选到了合适的用于基因表达研究的内参基因。

为筛选出地红蝽在雌雄成虫不同组织、不同性别和不同龄期个体中稳定表达的内参基因，本研究基于对已有的地红蝽转录组数据的分析，以及参考昆虫常用内参基因，筛选出Hsc70（Heatshockprotein70）、AK、GAPDH、α-Tub、EF1-α、SDHA（Succinate dehydrogenase complex subunit A）、RPL32、β-Act等8个基因作为候选内参基因。采用RT-qPCR技术并应用GeNorm、NormFinder、BestKeeper等软件，对地红蝽不同成虫部位、性别及不同发育阶段的候选内参基因表达水平进行分析，利用RefFinder在线网站（http://blooge.cn/RefFinder/）进行综合评估和统计分析，最终筛选出地红蝽在不同条件下进行基因表达研究的最佳内参基因，旨在为后续探索地红蝽基因表达分析奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料与试剂

地红蝽采集自山西农业大学太谷校区试验田，并单头饲养在直径为9 cm的培养皿中，以苘麻种子为食物，培养皿边缘放置适当大小的湿润棉球以维持湿度。培养皿放置在温度为（26±1）℃、相对湿度为60%~70%、光周期为14 h（光照）/10 h（黑暗）的人工气候箱中。分别收集3 日龄雌雄成虫的触角（30头）、头（10头）、胸（10头）、腹（3头）、足（10头）和翅（10头）等6个组织作为不同组织样品；随机抽取雌雄成虫各1头为不同性别成虫样品；收集一龄（30头）、二龄（20头）、三龄（5头）、四龄（5头）、五龄（1头）和成虫（1头）为不同龄期样品，3次生物学重复。

UNIQ-10柱式总RNA提取试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司，HiScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒购自南京诺维赞生物科技股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA提取与cDNA合成

将样品使用液氮迅速冷冻并研磨成粉末状，按照UNIQ-10柱式总RNA提取试剂盒说明书进行总RNA提取，并对提取的RNA进行浓度与纯度测定。按照HiScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper）试剂盒说明书的方法，将总RNA反转录合成cDNA，并置于-20 ℃保存备用。

1.2.2 候选内参基因选择与引物设计

参考昆虫常用内参基因^[8，20]，选取地红蝽转录组测序结果中热激同源蛋白70基因（Hsc70）、核糖体蛋白L32基因（RPL32）、精氨酸激酶基因（AK）、β-肌动蛋白基因（β-Act）、α-微管蛋白基因（α-Tub）、琥珀酸脱氢酶复合体A亚基基因（SDHA）、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPDH）和延长因子1基因（EF1-α）作为候选内参基因。利用Primer 5.0软件设计候选内参基因引物，扩增产物长度为80~250 bp，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2.3 RT-qPCR引物特异性和扩增效率检验

为确定引物的扩增效率，将试验所用样品的cDNA分别以10、100、1 000、10 000倍梯度稀释后，作为模板进行RT-qPCR反应，并计算引物扩增效率和决定系数（R² ）及绘制熔解曲线。RT-qPCR扩增反应按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒说明书进行^[21]，每个样本设置3次生物学重复。反应体系20 μL：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL；Forward Primer（10 μmol/L） 0.4 μL；Reverse Primer（10 μmol/L） 0.4 μL；Template cDNA 1 μL；ddH₂O 8.2 μL。

PCR反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，40个循环；熔解曲线反应条件为95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。

1.3 数据分析

采用GeNorm^[22]、NormFinder^[23]、BestKeeper^[9]软件，以及在线网站RefFinder对8个候选内参基因进行综合分析与稳定性评估。根据GeNorm计算出表达稳定性（M值）进行排序，M值越小则基因越稳定，且得出各基因之间的配对变异值V_n/n+1（以0.15为阈值，小于0.15则表示需要n个基因），以确定最佳内参基因数目。采用NormFinder和BestKeeper软件分别计算出表达稳定值（SV），以及标准差（SD）和变异系数（CV），对稳定值进行排序，其数值越小表示基因的稳定性越好。最后，利用RefFinder在线网站对以上3种方法的稳定性进行评估，得到综合排名。

2 结果与分析

2.1 引物扩增效率和特异性评价

引物信息如表1所示。

由表1可知，8个候选内参基因的RT-qPCR引物的扩增效率为96.3%~111.8%，R² 为0.987~1.000，具有良好的线性关系，且各基因的熔解曲线均为单峰无非特异性扩增，表明引物设计合理，具有良好的扩增效率和特异性，可进行RT-qPCR定量试验。

2.2 候选内参基因的表达水平分析

内参基因的表达水平是筛选内参基因的首要条件，在地红蝽各组样品中8个候选内参基因的Ct平均值为17.95~27.56，具有较高的表达水平（表2）。如图1所示，基于各候选内参基因的Ct值可看出，EF1-α基因的Ct值处于较低水平，表明其在不同样品中的表达丰度最高，而Hsc70和RPL32表达丰度较低，且RPL32在不同样品间的表达差异最大，而EF1-α在不同样品间的表达差异最小。

2.3 应用GeNorm软件分析候选内参基因稳定性

由图2可知，根据M值的大小进行排序后发现，在不同龄期样品组中，内参基因的稳定性由高到低依次为β-Act=Hsc70（0.427）>SDHA（0.475）>EF1-α（0.537）>GAPDH（0.632）>AK（0.749）>RPL32（0.810）>α-Tub（1.072），β-Act和Hsc70为稳定性最高的内参基因，α-Tub为最不稳定的内参基因。在不同性别成虫样品组中，内参基因的稳定性由高到低依次为SDHA=RPL32（0）>β-Act（0.269）>Hsc70（0.382）>EF1-α（0.520）>AK（0.574）>GAPDH（0.643）>α-Tub（0.959），SDHA和RPL32为稳定性最高的内参基因，α-Tub为最不稳定的内参基因。在雌性成虫不同组织样品组中，内参基因的稳定性由高到低依次为α-Tub=EF1-α（0.462）>β-Act（0.550）>Hsc70（0.584）>GAPDH（0.610）>SDHA（0.762）>AK（0.939）>RPL32（1.249），α-Tub和EF1-α为稳定性最高的内参基因，RPL32为最不稳定的内参基因。在雄性成虫不同组织样品组中，内参基因的稳定性由高到低依次为GAPDH=EF1-α（0.473）>β-Act（0.548）>Hsc70（0.609）>α-Tub（0.708）>SDHA（0.830）>RPL32（0.971）>AK（1.108），GAPDH和EF1-α为稳定性最高的内参基因，而AK基因为最不稳定的内参基因。结合GeNorm软件计算出V_n/（n+1）值，如图3所示，结果表明最佳内参基因组合数为2个。

2.4 应用NormFinder软件分析候选内参基因稳定性

使用NormFinder软件计算稳定值（SV），SV越小，表示基因表达越稳定。对候选内参基因进行SV分析，结果如表3所示，在不同龄期中，表达稳定性排名前3的内参基因是SDHA（0.16）、EF1-α（0.23）、Hsc70（0.48），最不稳定内参基因为α-Tub（1.79）；在不同性别成虫中，表达稳定性排名前3的内参基因是EF1-α（0.19）、SDHA（0.37）、RPL32（0.37），最不稳定的内参基因为α-Tub（1.85）；在雌性成虫不同组织中，表达稳定性排名前3的内参基因是EF1-α（0.14）、α-Tub（0.38）、β-Act（0.39），最不稳定的内参基因为RPL32（2.10）；在雄性成虫不同组织中，排名前3表达较稳定的内参基因是EF1-α（0.12）、GAPDH（0.34）、β-Act（0.44），最不稳定的内参基因为AK（1.40）。

2.5 利用BestKeeper软件分析候选内参基因稳定性

通过BestKeeper软件计算出SD和CV，分析内参基因的稳定性，SD和CV越小，表明基因表达越稳定。当SD<1时，则可作为内参基因^[24]。表4结果显示，不同龄期中表达稳定性前3的基因依次为GAPDH（SD=0.68，CV=3.52）、RPL32（SD=0.71，CV=2.81）、EF1-α（SD=0.80，CV=4.44）；在不同性别成虫中表达最稳定的是AK（SD=0.87，CV=4.27）基因，其次是EF1-α（SD=0.93，CV=4.91）基因；在雌性成虫不同组织中，表达稳定性前3的依次为α-Tub（SD=0.58，CV=3.03）、EF1-α（SD=0.59，CV=3.26）和β-Act（SD=0.82，CV=4.14）基因；在雄性不同组织中，表达最稳定的是α-Tub（SD=0.83，CV=3.91），其次是EF1-α（SD=0.90，CV=4.53）基因。

2.6 运用RefFinder软件进行综合分析

由于各软件的分析方法存在一定的差异，利用在线网站RefFinder进行综合分析，得到稳定性指数然后排序，值越低则基因的表达越稳定。结果如图4所示，在不同龄期中，内参基因表达的稳定性从高到低依次为EF1-α>SDHA>GAPDH>Hsc70>β-Act>RPL32>AK>α-Tub；不同性别成虫中，内参基因表达稳定性从高到低依次为SDHA>RPL32>EF1-α>AK>Hsc70>β-Act>GAPDH>α-Tub；在雌性成虫不同组织中，基因表达稳定性从高到低依次为EF1-α>α-Tub>β-Act>Hsc70>GAPDH>SDHA>AK>PL32；在雄性成虫不同组织中，基因表达稳定性从高到低依次为EF1-α>GAPDH>β-Act>α-Tub>Hsc70>SDHA>RPL32>AK。

3 结论与讨论

本研究基于地红蝽转录组测序结果，利用4种不同的计算方法对地红蝽不同组织中候选内参基因的表达稳定性进行评价和综合分析，筛选最适内参基因组合，结果显示，EF1-α、SDHA、RPL32、α-Tub、GAPDH等基因具有稳定的表达。

在真核生物的蛋白质合成过程中，延伸因子1-α（EF1-α）主要作为mRNA翻译时促进多肽链延伸的蛋白质因子，鉴于其表达的稳定性，EF1-α被普遍作为生物学研究中的内参基因^[25-27]。在桃蚜^[16]、大豆蚜^[19]、小菜蛾（Plutella xylostella）^[28]和印度谷螟（Plodia interpunctella）^[29]中的内参基因筛选也表明EF1-α基因最稳定。本研究发现，EF1-α基因在地红蝽不同发育阶段和雌雄成虫不同组织中具有较高的表达稳定性，表明EF1-α基因也适宜作为地红蝽的内参基因。本研究还发现，α-Tub和GAPDH基因分别在雌雄成虫不同组织中可作为内参基因，这与沙葱萤叶甲（Galeruca daurica）^[30]和松墨天牛（Monochamus alternatus）^[31]等鞘翅目昆虫中，α-Tub基因和GAPDH基因被评估为分析不同组织中基因表达的最佳内参基因之一的结果一致。其次，在黄翅绢野螟（Diaphania caesalis）^[32]基因表达定量研究中发现，适用不同成虫性别最佳内参基因组合为Actin和EF1-α，这与本研究在地红蝽成虫不同性别中，筛选出SDHA和RPL32为最佳内参基因结果不同，可能与物种生物学特性以及试验条件存在差异等有关。RPL32作为核糖体蛋白编码基因之一，已有研究表明，RPL32在柑橘大实蝇（Bactrocera minax）^[33]和绿盲蝽（Apolygus lucorum）^[34]不同发育时期表达稳定，且在不同抗性牧草盲蝽以及不同组织中均有较高的表达稳定性^[15]。

深入分析地红蝽候选内参基因的稳定性之后，结合GeNorm软件的计算结果，可推算出在地红蝽定量研究中，使用2个内参基因为最佳组合数。因此，在地红蝽不同龄期中，建议以EF1-α和SDHA作为内参基因；在不同成虫性别中，建议以SDHA和RPL32作为内参基因；EF1-α和α-Tub适合作为雌性成虫不同组织的内参基因；EF1-α和GAPDH适合作为雄性成虫不同组织的内参基因。

参考文献

[1] 章士美. 中国经济昆虫志-第三十一册，（一）-半翅目[M]. 北京：科学出版社，1985：161-162.

[2] ZHANG S M. Economic insect fauna of China[M]. Beijing：Science Press，1985：161-162.

[3] 刘晨，黄攀攀，李敏，等. 牛心朴子提取物对地红蝽毒杀活性的研究[J]. 天津师范大学学报（自然科学版），2013，33（4）：56-59.

[4] LIU C， HUANG P P， LI M，et al. Poison effect of Cynanchum komarovii extracts on Pyrrhocoris tibialis[J]. Journal of Tianjin Normal University（Natural Science Edition），2013，33（4）：56-59.

[5] 赵瑞，王雅丽，王美，等. 地红蝽特殊取食行为及其偏好性[J]. 植物保护学报，2022，49（2）：654-661.

[6] ZHAO R， WANG Y L， WANG M，et al. Special feeding behavior and feeding preference of red bug Pyrrhocoris tibialis Stal[J]. Journal of Plant Protection，2022，49（2）：654-661.

[7] 赵瑞，牛越，王雅丽，等. 寄主植物物理性状及营养物质对地红蝽寄主选择性的影响[J]. 昆虫学报，2022，65（6）：737-748.

[8] ZHAO R， NIU Y， WANG Y L，et al. Effects of physical characteristics and nutrients of host plants on the host selectivity of Pyrrhocoris tibialis（Hemiptera：Pyrrhocoridae）[J]. Acta Entomologica Sinica，2022，65（6）：737-748.

[9] KRAJICEK J， HAVLIKOVA M， BURSOVA M，et al. Comparative analysis of volatile defensive secretions of three species of Pyrrhocoridae（Insecta：Heteroptera） by gas chromatography-mass spectrometric method[J]. PLoS One，2016，11（12）：e0168827.

[10] ZHANG Q L， FENG R Q， LI M，et al. The complete mitogenome of Pyrrhocoris tibialis（Hemiptera：Pyrrhocoridae） and phylogenetic implications[J]. Genes，2019，10（10）：820.

[11] 裴徐梨，冯鹏宇，唐征，等. 青花菜花蕾发育LncRNAs内参基因筛选[J]. 河南农业科学，2023，52(1)：125-133.

[12] PEI X L， FENG P Y， TANG Z，et al. Selection of LncRNAs reference genes in development of flower bud in broccoli[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences，2023，52(1)：125-133.

[13] 史彩华，胡静荣，李传仁，等. 内参基因在昆虫qRT-PCR中的研究进展[J]. 江苏农业科学，2017，45（7）：1-7.

[14] SHI C H， HU J R， LI C R，et al. Research progress of internal reference gene in insect qRT-PCR[J]. Jiangsu Agricultural Sciences，2017，45（7）：1-7.

[15] PFAFFL M W， TICHOPAD A， PRGOMET C，et al. Determination of stable housekeeping genes，differentially regulated target genes and sample integrity：BestKeeper-Excel-based tool using pair-wise correlations[J]. Biotechnology Letters，2004，26（6）：509-515.

[16] 张玉芳，赵丽娟，曾幼玲. 基因表达研究中内参基因的选择与应用[J]. 植物生理学报，2014，50（8）：1119-1125.

[17] ZHANG Y F， ZHAO L J， ZENG Y L. Selection and application of reference genes for gene expression studies[J]. Plant Physiology Journal，2014，50（8）：1119-1125.

[18] 陈炼，田忠，王小云，等. 朱红毛斑蛾实时荧光定量PCR内参基因的筛选[J]. 环境昆虫学报，2021，43（1）：15-24.

[19] CHEN L， TIAN Z， WANG X Y，et al. Screening of reference genes for quantitative real-time PCR in Phauda fammans （Walker）（Lepidoptera：Phaudidae）[J]. Journal of Environmental Entomology，2021，43（1）：15-24.

[20] MENG Q Q， SHU B S， SUN S W，et al. Selection of reference genes for quantitative real-time PCR normalization in the coffee white stem borer，Xylotrechus quadripes Chevrolat（Coleoptera：Cerambycidae）[J]. Bulletin of Entomological Research，2022，112（2）：151-161.

[21] 段云，巩中军，吴仁海，等. 光处理下粘虫头部组织定量PCR分析中内参基因的筛选[J]. 应用昆虫学报，2021，58（2）：318-325.

[22] DUAN Y， GONG Z J， WU R H，et al. Identification of reference genes in the heads of Mythimna separata with real-time quantitative PCR under different light sources[J]. Chinese Journal of Applied Entomology，2021，58（2）：318-325.

[23] ZHANG S D， AN S H， LI Z，et al. Identification and validation of reference genes for normalization of gene expression analysis using qRT-PCR in Helicoverpa armigera（Lepidoptera：Noctuidae）[J]. Gene，2015，555（2）：393-402.

[24] 贾冰，马亿，庞保平，等. 牧草盲蝽实时定量PCR内参基因的筛选[J]. 昆虫学报，2019，62（12）：1379-1391.

[25] JIA B， MA Y， PANG B P，et al. Screening of reference genes for quantitative real-time PCR in Lygus pratensis（Hemiptera：Miridae）[J]. Acta Entomologica Sinica，2019，62（12）：1379-1391.

[26] KANG Z W， LIU F H， TIAN H G，et al. Evaluation of the reference genes for expression analysis using quantitative real-time polymerase chain reaction in the green peach aphid，Myzus persicae [J]. Insect Science，2017，24（2）：222-234.

[27] SINHA D K， SMITH C M. Selection of reference genes for expression analysis in Diuraphisnoxia（Hemiptera：Aphididae） fed on resistant and susceptible wheat plants[J]. Scientific Reports，2014，4：5059.

[28] MARONICHE G A， SAGADÍN M， MONGELLI V C，et al. Reference gene selection for gene expression studies using RT-qPCR in virus-infected planthoppers[J]. Virology Journal，2011，8（1）：308.

[29] BANSAL R， MAMIDALA P， MIAN R A M，et al. Validation of reference genes for gene expression studies in Aphis glycines（Hemiptera：Aphididae）[J]. Journal of Economic Entomology，2012，105（4）：1432-1438.

[30] 张敏，李子鹏，赵欣然，等. 绿豆象实时荧光定量PCR内参基因的筛选[J]. 环境昆虫学报，2024，46（1）：174-183.

[31] ZHANG M， LI Z P， ZHAO X R，et al. Selection and validation of candidate reference genes for gene expression analysis in Callosobruchus chinensis（Coleoptera：Bruchidae） by qRT-PCR[J]. Journal of Environmental Entomology，2024，46（1）：174-183.

[32] 焦丽亚琳，赵萌萌，王美，等. 星豹蛛两个GST基因克隆、鉴定及其对溴氰菊酯胁迫的响应表达[J]. 昆虫学报，2023，66（9）：1161-1170.

[33] JIAO L Y L， ZHAO M M， WANG M，et al. Cloning and identification of two GST genes in Pardosa astrigera（Araneae：Lycosidae） and their expression in response to deltamethrin stress[J]. Acta Entomologica Sinica，2023，66（9）：1161-1170.

[34] VANDESOMPELE J， DE PRETER K， PATTYN F，et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J]. Genome Biology，2002，3（7）：RESEARCH0034.1.

[35] LINDBJERG C A， LEDET J J， FALCK T Ø. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data：a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization，applied to bladder and colon cancer data sets[J]. Cancer Research，2004，64（15）：5245-5250.

[36] 李晓，李建文，成波，等. 大灰象甲实时定量PCR内参基因的筛选[J]. 昆虫学报，2018，61（11）：1284-1294.

[37] LI X， LI J W， CHENG B，et al. Screening of reference genes for quantitative real-time PCR in Sympiezomias velatus（Coleoptera：Curculionidae）[J]. Acta Entomologica Sinica，2018，61（11）：1284-1294.

[38] HORŇÁKOVÁ D， MATOUŠKOVÁ P， KINDL J，et al. Selection of reference genes for real-time polymerase chain reaction analysis in tissues from Bombus terrestris and Bombus lucorum of different ages[J]. Analytical Biochemistry，2010，397（1）：118-120.

[39] CHAPUIS M P， TOHIDI-ESFAHANI D， DODGSON T，et al. Assessment and validation of a suite of reverse transcription-quantitative PCR reference genes for analyses of density-dependent behavioural plasticity in the Australian plague locust[J]. BMC Molecular Biology，2011，12：7.

[40] PONTON F， CHAPUIS M P， PERNICE M，et al. Evaluation of potential reference genes for reverse transcription-qPCR studies of physiological responses in Drosophila melanogaster [J]. Journal of Insect Physiology，2011，57（6）：840-850.

[41] FU W， XIE W， ZHANG Z，et al. Exploring valid reference genes for quantitative real-time PCR analysis in Plutella xylostella（Lepidoptera：Plutellidae）[J]. International Journal of Biological Sciences，2013，9（8）：792-802.

[42] 唐培安，张棋麟，薛昊，等. 印度谷螟实时荧光定量PCR内参基因的选择[J]. 中国科学：生命科学，2016，46（10）：1201-1209.

[43] TANG P A， ZHANG Q L， XUE H，et al. Selection of reference genes in quantitative real-time PCR of Plodia interpunctella（Lepidoptera：Pyralidae）[J]. Scientia Sinica（Vitae），2016，46（10）：1201-1209.

[44] TAN Y， ZHOU X R， PANG B P. Reference gene selection and evaluation for expression analysis using qRT-PCR in Galeruca daurica（Joannis）[J]. Bulletin of Entomological Research，2017，107（3）：359-368.

[45] 冯波，郭前爽，毛必鹏，等. 松墨天牛化学感受组织荧光定量PCR内参基因的鉴定与筛选[J]. 昆虫学报，2016，59（4）：427-437.

[46] FENG B， GUO Q S， MAO B P，et al. Identification and selection of valid reference genes for assaying gene expression in the chemosensory tissues of Monochamus alternatus（Coleoptera：Cerambycidae） by RT-qPCR[J]. Acta Entomologica Sinica，2016，59（4）：427-437.

[47] WANG Z， MENG Q Q， ZHU X，et al. Identification and evaluation of reference genes for normalization of gene expression in developmental stages，sexes，and tissues of Diaphania caesalis（Lepidoptera：Pyralidae） open access[J]. Journal of Insect Science，2020，20（1）：6.

[48] LÜ Z C， WANG L H， DAI R L，et al. Evaluation of endogenous reference genes of Bactrocera（tetradacus） minax by gene expression profiling under various experimental conditions[J]. Florida Entomologist，2014，97（2）：597-604.

[49] LUO J， WANG A L， CHENG Y X，et al. Selection and validation of suitable reference genes for RT-qPCR analysis in Apolygus lucorum（Hemiptera：Miridae） purchased[J]. Journal of Economic Entomology，2020，113（1）：451-460.

基金资助

农业农村部农产品质量安全监管专项(15197063)

山西省基础研究计划（自由探索类）(202103021224161)