基于DUS测试的绿豆品种多样性与特异性分析

Analysis of Diversity and Specificity of Mung Bean Varieties based on DUS Testing

摘要

为了优化绿豆DUS测试，为绿豆新品种选育提供参考依据，研究对2023年绿豆新品种申请测试的24份品种的31个性状进行聚类、多样性、相关性、变异系数等综合分析。结果表明，下胚轴花青苷显色、小叶基部花青苷显色、种子种皮光泽等3 个质量性状的遗传多样性均偏低，83.33%~87.50%的品种表现为下胚轴和小叶基部花青苷显色、种子有光泽，表型高度趋同；10 个数量性状中，成熟期的遗传多样性指数最高、主茎茸毛最低；所有测试品种均为三小叶表型，叶柄花青苷显色强度以弱表达为主，植株分枝与主茎夹角普遍在中等及以上。7个核心数量性状里，荚果数的变异系数最大，为28.53%，荚果种子数变异系数最小，为6.25%。相关性分析结果表明，株高与主茎节数、荚果长度与百粒质量均呈极显著正相关，其中荚果长度对百粒质量正向贡献最大，株高、荚果数与百粒质量呈负相关。聚类分析结果将24份品种分为5类，荚果长度与荚果数在类群间区别度较高，可作为绿豆新品种特异性判定的核心性状。

Abstract

In order to optimize the DUS testing of mung bean. provide reference for breeding new varieties of mung bean. In this study, the clustering, diversity, correlation, and coefficient of variation of 31 traits of 24 varieties applying the mung bean new variety testing in 2023 were comprehensively analyzed. The result showed that the genetic diversity of three quality traits(anthocyanin coloration of hypocotyl, anthocyanin coloration of leaflet base, and seed coat luster) was all low, and 83.33%-87.50% of the varieties showed anthocyanin coloration of hypocotyl and leaflet base with glossy seeds, presenting a highly convergent phenotype. Among the 10 quantitative traits, the genetic diversity index of maturity stage was the highest, and the index of main stem villi was the lowest, all tested varieties had a trifoliolate phenotype, the anthocyanin coloration intensity of petiole was dominated by weak expression, and the angle between plant branches and main stem was generally above the medium level. Among the 7 core quantitative traits, the coefficient of variation of plant pod number was the largest(28.53%), and that of pod seed number was the smallest(6.25%). Plant height was extremely significantly positively correlated with the number of main stem nodes, and pod length was extremely significantly positively correlated with 100-seed weight, among which pod length had the greatest positive contribution to 100-seed weight, while plant height and pod number were negatively correlated with 100-seed weight. Cluster analysis divided the 24 varieties into 5 groups, and pod length and pod number had a high degree of differentiation among the groups, so the two traits could be used as the core traits for judging the distinctness of new mung bean varieties.

Graphical abstract

关键词

绿豆 / DUS测试 / 数量性状 / 质量性状

Key words

mung bean / DUS testing / quantitative traits / qualitative traits

绿豆，又名青小豆，属豆科豇豆属作物。绿豆原产于印度和缅甸地区，目前在全球多个国家都有种植^[1]，在我国已有超过2 000 a的栽培史，黄河、淮河流域及东北地区为主要产区。内蒙古、吉林、安徽、河南、山西、陕西和湖南为绿豆的主要种植区，其播种面积合计占全国播种总面积的78.8%；吉林和内蒙古的产量最多，合计占总产量的42.2%，其次是河南、湖南、山西、新疆、重庆、四川和湖北。绿豆的营养丰富，籽粒中蛋白质含量较高，占干质量的25%~28%，是集粮食、蔬菜、绿肥和医药用途于一身的传统豆类食物^[2]。基于绿豆的实用价值及人们对其喜爱程度，培育适应性更强、产量更高、品质更好的绿豆新品种尤为重要。

焦雄飞等^[3]对45份兵豆种质资源的质量性状进行了多样性分析，对其数量性状进行了相关性分析与分级，为兵豆种质资源保护和兵豆DUS测试指南的制定提供了参考。官玲等^[4]采用符合系数（COC）分析17份蚕豆标准品种在重庆地区的性状表现与指南描述的差异性，从而筛选出重庆地区适宜种植的蚕豆种质资源。王红娟等^[5]对106份南方春大豆品种采用不同方法对各数量性状进行研究，旨在为大豆资源的综合评价提供参考。杨学乐等^[6]对收集的176份湖南省绿豆种质资源的田间农艺性状进行综合分析和评价，结果表明，绿豆田间农艺性状易受环境、气候和栽培措施等的影响，并利用分子标记进行遗传多样性分析，以期为绿豆种质资源创制和新品种选育提供参考。朱慧珺等^[7]对10份绿豆种质资源在榆次、怀仁和临汾三地的农艺性状及营养品质进行综合分析，结果表明，主要农艺性状和品质性状受气候因子不同程度的影响。

植物新品种测试是对申请保护的植物新品种进行特异性（Distinctness）、一致性（Uniformity）和稳定性（Stability）的栽培鉴定试验或室内分析测试的过程（简称DUS测试）。根据特异性、一致性和稳定性的试验结果，判定测试品种是否属于新品种，为植物新品种保护提供可靠的判定依据^[8-9]。《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南　绿豆》（NT/T 2350—2013）2013年发布实施，本研究以2023年农业农村部植物新品种测试中心委托、社会委托的24份绿豆申请品种为试材，严格参照该指南开展31个农艺性状的DUS测试，通过对测试性状进行遗传多样性、相关性、变异系数及聚类等综合分析，筛选绿豆新品种特异性判定的核心性状，优化绿豆DUS测试技术体系，旨在为绿豆新品种的定向选育、审定登记及植物新品种权保护提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料包括12份社会委托测试品种（中绿29、中绿28、中绿27、中绿26、并绿11号、并绿20号、并绿21号、汾绿豆6号、冀绿25号、汾黑绿豆12号、航农绿豆、庆绿8号）和由农业农村部植物新品种测试中心提供的12份绿豆申请品种（表1）。

1.2 试验设计

2023年5月20日至9月1日在农业农村部植物新品种测试（忻州）分中心DUS试验基地进行集中测试。试验采用随机区组设计，采用条播种植，每小区播种株数不少于120株，株距15 cm,行距60 cm,共设2个重复。在绿豆测试田块四周种植保护行，田间管理与当地种植管理方式保持一致。按照《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南　绿豆》（2013版）（以下简称《指南》）的要求，采集31个基本性状数据如表2所示。

1.3 性状检测方法

根据《指南》要求，对质量性状、数量性状和假质量性状进行调查，如表2所示。个体观测性状（VS、MS）在每个小区随机选取20株植株观测，在观测植株的器官或部位时，每个植株取样数量为1个。群体观测性状（VG、MG）应观测整个小区的样本，测试品种目测性状按照《指南》要求给出相应代码。株高、荚果长度使用直尺或游标卡尺测量，百粒质量使用电子天平测定。

1.4 数据统计与处理

1.4.1 质量性状的处理

根据《指南》的标准进行分级，对其中3个质量性状进行多样性分析，多样性分析参考文献[10-11]进行。

H'=－∑P_i lnP_i（1）

式中，P_i 为某个性状第i个代码出现的概率。

1.4.2 数量性状的处理

采用Excel软件处理试验数据，计算各测试绿豆品种的平均值、最大值、最小值、标准差和变异系数等参数，按照级差≥2倍标准差的计算方法进行分级^[12-14]，其中，级差是指数量性状分级后，相邻等级之间的差值，用于统一性状分级标准，保证DUS测试结果规范可比。具体分级方式：级数1=极差/（标准差×2）；级数2=级数1最接近的整数（按照1、3、5、7、9的就小取值）；级差=极差/级数2；分级数是根据中值和级差而确定的、连续的不同数据分布范围的数量。采用CORR过程对24个品种的7个数量性状进行性状间相关性分析和最短距离聚类分析。

2 结果与分析

2.1 绿豆品种质量性状的多样性分析

在31个测试性状中，有3个质量性状，分别是下胚轴（花青苷显色）；叶（小叶基部花青苷显色)；种子(种皮光泽)。由表3可知，3个质量性状的多样性指数均小于1，其中小叶基部花青苷显色的多样性指数最大，为0.45，下胚轴花青苷显色和种子光泽的多样性指数相同，均为0.38，说明本试验测试的3个质量性状在测试品种中的遗传多样性均较低。下胚轴花青苷显色占比是87.50%，小叶基部花青苷显色占比是83.33%，种子有光泽的占比是87.50%，整体来看，较多数测试品种的下胚轴和小叶基部花青苷显色，种子有光泽。

2.2 绿豆品种7个数量性状的多样性分析

绿豆品种7个数量性状分级占比及多样性分析如表4所示。

从表4可以看出，始花期和成熟期的多样性指数均较高，分别为1.26、1.36；叶的绿色程度和植株的分枝与主茎夹角的多样性指数也都大于1，分别是1.06、1.03；主茎茸毛的多样性指数最低，为0.64。分析数据得知，绿豆成熟期的表达状态在测试品种中具有最高的遗传多样性，主茎茸毛的遗传多样性最低。

始花期早到中、中、中到晚、晚的占比分别为25.00%、41.67%、25.00%、8.33%；主茎茸毛以多为主要表型，占比为66.67%，少表型占比为33.33%；小叶数量只有1种表型，均为三小叶，说明三小叶普遍存在于绿豆中，在下次绿豆测试指南修订时可以考虑去除此性状的测试；叶的绿色程度中、中到深、深的占比分别为25.00%、45.83%、29.17%；叶柄的花青苷显色强度弱的占比最高，为62.50%；成熟期极早到早、早、早到中、中、中到晚的占比分别是4.16%、41.67%、16.67%、29.17%、8.33%；植株分枝与主茎夹角中到大的占比为整体的1/2，夹角中等的占比是29.17%，夹角大的占比是20.83%，说明植株分枝与主茎夹角普遍在中等夹角以上。

将24个测试品种7个数量性状的原始数据平均值进行统计分析，从表5可以看出，各数量性状的变异系数最大的是荚果数，为28.53%，其次是分枝数，为17.22%，表明植株荚果数和分枝数在种间相较于其他5个性状差异较大；株高、荚果长度、荚果种子数和百粒质量的变异系数相对较小，均小于15%，变异系数最小的是荚果种子数，仅为6.25%，荚果种子数的种间差异最小。按照级差大于等于2倍平均标准差的要求，对各数量性状进行分级^[15-16]，所有性状均可分为3个连续分布的分级范围（表6）。

从表7可以看出，在7个性状中有2组性状具有一定的相关性，株高和主茎节数呈极显著正相关（P<0.01），相关系数为0.578；荚果长度和百粒质量也呈极显著正相关（P<0.01），相关系数为0.549，说明荚果长度对百粒质量的贡献最大。株高、荚果数与百粒质量均呈负相关，相关系数分别为-0.296、-0.223，结合表5中荚果数的较大变异性，因此，在DUS测试和审查时，要针对荚果数对百粒质量的相关性进行重点比对。

对24个测试品种的7个数量性状进行聚类分析（图1），可分为5类，第Ⅰ类只有1号品种，主要特征为株高中等，荚果数中等，主茎节数中等，荚果长度长到极长；第Ⅱ类包含20个品种，占全部品种的83.33%，分别是试验编号2、22、8、12、17、18、9、13、11、10、23、5、19、20、6、7、15、3、24、21，主要特征为7个数量性状多处于中等范围；第Ⅲ类是16号品种，主要特征为株高矮到中，荚果数极多；第Ⅳ类是14号品种，主要特征为株高较矮，分枝数较少，荚果数多到极多；第Ⅴ类是4号品种，主要特征为荚果数极少，荚果长度较长，荚果种子数少。

3 结论与讨论

绿豆是一种高蛋白、低脂肪、中淀粉的医食同源豆类作物，是理想的营养保健食品，被广泛应用在食品、酿造和医药多领域^[17]。由于其生长周期短、平均产量高且具有耐旱和固氮等特点，被广泛种植。近年来，世界绿豆的种植面积和总产量都呈现较快的发展趋势，特别是一些发达国家绿豆产量较高、竞争力较强，对我国绿豆产业形成挑战^[18]。我国绿豆主要在干旱、半干旱、瘠薄、山坡、高地种植，生产基本条件差，产量极不稳定^[19-20]。选育适应性强的优质绿豆品种尤为重要，以扩大绿豆的种植范围，提升绿豆产能，提高我国绿豆的国际竞争力^[21]。美国、加拿大、澳大利亚等国家通过生物技术、分子标记辅助选择等方法，培育出具有较高产量、优质、抗病虫害等特点的绿豆品种。我国应借鉴国外先进经验，提高绿豆品种选育水平。

DUS测试使优良种质得到较好保护，也会促进种质资源开发与利用，注重品种的综合性，挖掘优异基因，选育出高产稳产的绿豆新品种，对绿豆产业的发展意义重大。本研究选用24份送检的绿豆新品种进行31个性状测试，结果表明，87.50%的测试品种下胚轴花青苷显色，83.33%的测试品种小叶基部花青苷显色，87.50%的测试品种种子有光泽，整体来看，较多数测试品种的下胚轴和小叶基部花青苷显色，种子有光泽；绿豆成熟期的表达状态在测试品种中具有最高的遗传多样性，主茎茸毛的遗传多样性最低，且66.67%的测试品种主茎茸毛为紫色。小叶数量只有1种表型，均为三小叶，说明三小叶性状普遍存在于绿豆中，三小叶的性状测试似乎没有意义，可以考虑在下次绿豆测试指南修订时去除此性状的测试。7个主要数量性状的变异系数均未超过30%，其中变异系数最大的是荚果数，最小的是荚果种子数，说明测试品种的7个主要数量性状数据均较为集中，变异程度不大；利用2倍标准差法可将7个数量性状均分为3级，等级为中级的性状频率较高，低级和高级的频率相对较少。

数量性状在测定过程中易受气候条件、栽培条件等众多因素的影响^[14]。就忻州分中心的栽培条件，对绿豆7个数量性状进行相关性分析得知，株高和主茎节数、荚果长度和百粒质量均呈极显著正相关，株高、荚果数量对百粒质量均呈负相关。综合荚果数的较大变异性，在DUS测试和审查时，要针对荚果数与百粒质量的相关性进行重点比对，建议绿豆测试指南修订时进行荚果数对百粒质量影响的优化。

聚类分析是将个体的集合分组为由类似的对象组成的多个类的分析过程，可以用于分析品种之间的亲缘关系^[22]。本试验将24个品种的7个数量性状分为5类，群体间存在一定差异，第Ⅰ类只有1号品种，主要特征为株高中等、荚果数中等、主茎节数中等、荚果长度长到极长；第Ⅱ类包含20个品种，占全部品种的83.33%，主要特征为7个数量性状多处于中等范围；第Ⅲ类是16号品种，主要特征为株高矮到中、荚果数极多；第Ⅳ类是14号品种，主要特征为株高较矮、分枝数较少、荚果数多到极多；第Ⅴ类是4号品种，主要特征为荚果数极少、荚果长度较长、荚果种子数少。对比分析5类群体的综合性状，荚果长度与荚果数是特征性状，在群体间的区别度较大，可作为判定品种间的特异性标准。建议育种者在培育高产优质的绿豆新品种时，关注荚果长度、荚果数等区别度较大的DUS测试性状，提高新品种特异性判定效率，同时针对遗传多样性偏低、表型高度趋同的性状开展定向培育与种质创新，丰富绿豆种质的遗传背景。

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