基于ISSR分子标记的山药种质资源遗传多样性分析

Genetic Diversity Analysis of Yam Germplasm Resources based on ISSR Molecular Markers

摘要

为明确山药种质资源的遗传多样性并指导品种选育，利用简单重复序列间扩增（ISSR）分子标记技术对34份山药种质的Nei's基因多样性指数（H）、Shannon信息指数（I）、有效等位基因数（Ne）等遗传多样性指标进行了分析，并进一步开展了群体结构分析、聚类分析和主成分分析。结果显示，34份山药材料共检测出109条多态性条带，多态率为95.94%，有效等位基因数为1.430 5，Nei's基因多样性指数为0.267 0，Shannon指数为0.417 3，表明这些山药种质具有较高的分子多态性。群体结构分析结果显示，34份种质材料中存在4个基因库，其中，基因库1和基因库2为优势来源，基因组成占比分别为47.06%和29.41%。聚类分析结果显示，34份山药材料遗传相似系数（GS）为0.54~0.91，其中，GS为0.64时，34份山药种质聚为4大类。主成分分析结果显示，34份山药材料被分为4个相互独立的类群，群体分布较分散，不同群体间无明显重叠现象，表明山药种质资源遗传结构清晰，群体间存在显著的遗传差异。

Abstract

To clarify the genetic diversity of yam(Dioscorea opposita Thunb.) germplasm resources and guide variety selection, in this study, the genetic diversity(including Nei's gene diversity index H, Shannon information index I, and effective allele number Ne) of 34 yam germplasms was analyzed using Inter Simple Sequence Repeat(ISSR) molecular marker technology. Further, population structure analysis, cluster analysis, and principal component analysis were conducted.The results showed that a total of 109 polymorphic bands were detected in 34 yam materials,with a polymorphism rate of 95.94%, effective allele number was 1.430 5, Nei's gene diversity index was 0.267 0, and Shannon index was 0.417 3.These results indicated that the yam materials had a high level of molecular polymorphism. Population structure analysis revealed that there were 4 gene pools among the 34 materials, with gene pool 1 and 2 being the dominant sources,accounting for 47.06% and 29.41% respectively. The results of cluster analysis revealed that the genetic similarity coefficients of 34 yam materials ranged from 0.54 to 0.91,and when GS was 0.64, 34 yam germplasms were clustered into four major groups. Principal component analysis revealed that the 34 yam materials were divided into four independent groups with a relatively dispersed population distribution and no obvious overlap among different groups. This indicated a clear genetic structure of the tested materials and significant genetic differences between populations.

Graphical abstract

关键词

山药 / 种质资源 / ISSR / 群体结构分析 / 主成分分析 / 聚类分析 / 遗传多样性分析

Key words

yam(Dioscorea opposita Thunb.) / germplasm resource / ISSR / group structure analysis / principal component analysis / cluster analysis / genetic diversity analysis

山药（Dioscorea opposita Thunb.）是我国重要的药食同源作物，具有丰富的营养价值和药用功效^[1-3]。其块茎富含蛋白质、淀粉、氨基酸、维生素以及多种矿物质，包括铁、锌和铜^[4]。山药因其突出的营养和药用价值，是我国重要的出口创汇农产品，被中国卫生部列于其发布的食品和药品名录前列。在传统中医理论中，山药具有健脾养胃、促进消化、补肾益精、润肺止咳、辅助降糖等多种功效^[5]。我国山药种质资源丰富，几乎在全国所有省份均有种植，区域差异显著，形成了众多地方品种。然而，近年来因跨地区引种导致品种名称混乱，给品种的引种、保护与遗传改良带来不利影响，而遗传多样性是育种的基础。因此，评估山药的遗传多样性对于种质管理、保护和新品种选育至关重要^[6-8]。

自20世纪90年代起，分子标记技术的发展为山药遗传学研究提供了新的手段^[9-10]。目前，多种分子标记已被广泛应用于评估山药的遗传多样性研究中^[3，11-14]。其中，ISSR有着处理简单、成本低、多态性高、稳定性高等特点，已被广泛用于多种植物的遗传多样性研究，例如小麦、灵芝、藏红花、南瓜、茶薪菇等^[15-19]。目前已有一些研究利用分子标记技术对山药种质材料进行遗传多样性研究。蔡锦玲等^[11]利用RAPD标记对7份德化淮山材料进行分析，验证了分子标记结果与传统分类方法的一致性，但未涵盖北方地区的种质资源。陈阳等^[13]利用ISSR标记技术对44份山药种质资源进行了评估，发现这些种质材料可以分为4个类群，在遗传距离0.561 8处可划分为5类，其中，薯蓣和褐苞薯蓣的亲缘关系最近。然而，用于进行山药遗传多样性分析的分子标记引物筛选效率较低和多态性存在不足，且样本主要集中于长江流域，未能全面反映我国山药种质资源的遗传全貌。

为解决山药种质鉴定标准不统一、品种混杂缺乏分子证据等产业痛点，本研究通过优化ISSR引物筛选流程，对涵盖我国7个主要产区的34份核心种质进行了多维度分析，旨在为建立全国统一的山药品种鉴定标准提供分子依据，进而指导山药新品种选育。

1 材料和方法

1.1 试验材料

34份山药种质材料均来自山西农业大学棉花研究所南花试验基地（表1）。于2023年7月采集了34份山药材料幼嫩叶子，置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取

34份山药种质材料的总DNA的提取是按照TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒（型号：DP432）说明书进行的。DNA提取完成后，使用ND 2000光谱仪（NanoDrop Technologies，Wilmington，USA）测定DNA的浓度和纯度。

1.2.2 PCR扩增

以山东菏泽山药基因组总DNA为模板进行PCR反应，筛选出13条能扩增出清晰稳定条带的引物（表2）。PCR反应体系为2 μL 1×PCR Buffer、20 ng DNA模板、2.5 mmol/L MgCl₂、1.5 U Taq DNA聚合酶、0.4 μmol/L引物，0.4 mmol/L dNTP，ddH₂O补足至20 μL。将扩增好的PCR产物进行3%琼脂糖凝胶电泳检测：取2 μL PCR产物与6 μL溴酚蓝上样缓冲液混合，300 V电压电泳12 min，根据凝胶电泳胶图确定引物是否具有多态性。

1.3 统计分析

利用0、1矩阵的方式构建ISSR数据库。采用GenAlEx（Genetic Analysis in Excel）6.5软件和Popgen 32软件分别计算ISSR位点的Nei's基因多样性指数（H）、Shannon指数（I）、有效等位基因数（Ne）遗传多样性指标。群体遗传结构分析采用基于贝叶斯模型的STRUCTURE软件进行，将检测到的多态性位点数据格式化后，导入STRUCTURE软件，采用马尔科夫链蒙特卡洛（Markov Chain Monte Carlo, MCMC）方法进行分析，预设群体分组数（K），并根据个体等位基因频率进行计算、抽样和分组。同时，利用NTSYS软件的similarity模块计算遗传相似性或距离矩阵，并通过clustering模块构建聚类树状图。

2 结果与分析

2.1 ISSR引物多态性及山药群体遗传多样性分析

本研究以山东菏泽山药基因组总DNA为模板进行PCR反应，筛选出13条能扩增出清晰稳定条带的引物。利用这13条引物对34份材料进行了PCR扩增。其中，引物ISSR-1在PCR扩增后，34个材料均得到了清楚、优质的条带，能够用于后续试验（图1）。其他引物也获得了类似的多态性条带。

从表3可以看出，13条引物在34份山药种质资源中共检测出113个等位基因位点，其中，多态性位点109个，平均每条引物检测到的多态性位点数为8.384 6，不同引物检测能力差异明显，其中，ISSR-1检测位点最多（14个），ISSR-857最少（5个）。多态性条带比例高达95.94%，表明13条引物的多态性非常丰富。观测等位基因数为1.959 4，接近最大值2.0，说明群体内存在的等位基因种类非常丰富。有效等位基因总数为18.596 3，数值为1.189 9（ISSR-3）~1.639 2（ISSR-867），平均每个位点有效等位基因数目为1.430 5，说明等位基因的分布不均匀。Nei's基因多样性指数（H）的平均值为0.267 0，Shannon指数（I）的平均值为0.417 3，表明这些山药在物种水平上具有中等偏上的遗传多样性。对于以无性繁殖为主的山药而言，这34份种质资源的遗传背景相对较为丰富。

2.2 群体遗传结构分析

2.2.1 STRUCTURE分析

群体遗传结构采用STRUCTURE软件进行分析，结果如图2所示。

从图2可以看出，在STRUCTURE中根据EVANNO等^[20]的方法计算得出最佳delta K值，对应K值为4，表明34份山药种质材料有4个类型的基因组成分。从图3可以看出，按照主要祖先成分比例大于50%的标准进行分类，种质材料64、43、62、46、81、89、87、34、14、59、84、80、85、83、23、55来自基因库1（红色）；种质材料82、13、57、25、58、51、61、47、77、88来自基因库2（黄色）；来自基因库3（蓝色）的种质材料为3、6、11、12的样本；来自基因库4（绿色）的种质材料为39、40、41、42。从表4可以看出，当K为4时，34份种质材料的基因组成主要来源于基因库1和2，占比分别为47.06%和29.41%；其次为基因库3和4，占比均为11.77%。

2.2.2 遗传距离和聚类分析

基于遗传相似矩阵，构建了个体的UPGMA树，结果显示（图4），遗传相似系数（GS）为0.54~0.91，其中，种质材料11与12、43与46的GS均为0.91，表明这2对材料各自具有较近的亲缘关系。

34份山药种质材料在GS为0.57处分为2个亚类，第1亚类只包括江西山药（88）1份种质材料，而其余种质材料属于第2亚类。34份山药种质在GS为0.64时分为4个亚类，其中，铁棍山药1（39）、铁棍山药2（40）、铁棍山药3（41）、铁棍山药4（42）属于一类；江西吉安山药（13）、孝义仁顺山药（25）、鸡皮山药（57）、太谷地方种4（51）、2018加倍（58）、日本白玉山药（82）属于一类，江西山药（88）独自属于一类，剩余其他种质属于一类。

2.2.3 主成分分析

从图5可以看出，编号分布的疏密代表了山药之间遗传关系的远近。结合STRUCTURE分析和聚类分析可以发现，34份山药材料在原始群体中几乎没有重叠，且较为分散，提示该山药材料有较高的代表性，能够代表原始群体的遗传多样性。

3 结论与讨论

种质资源是作物遗传育种的物质基础，而遗传多样性分析则是高效利用种质资源的必要前提。山药种质资源极为丰富，作为一种重要的药食同源作物，为世界人民的健康与营养作出了巨大贡献^[21]。山药的品种体系复杂，单一的分类方法难以对其进行准确鉴别，这导致记录和命名方法纷杂不一，甚至造成部分物种的分类混乱。这些因素严重阻碍了山药资源的节约和进一步利用^[22]。因此，了解山药种质材料的群体结构和遗传多样性，对其种质评价和选育新品种具有重要的指导意义。本研究利用ISSR分子标记分析了34份山药种质材料的遗传多样性及群体结构，结果显示，这些山药种质材料具有丰富的遗传多样性，研究结果可为山药的育种和遗传改良提供依据。

本研究筛选出的13条引物多态性比例高达95.94%，与刘向宇等^[23]（ISSR多态性比例为97.18%）及杨帆等^[24]（ISSR多态性比例为98.43%）的研究结果一致。

本研究通过群体结构分析发现，34份山药材料存在4个基因库，其中，基因库1和基因库2所包含的种质材料占总数的40.75%和33.25%，这与UPGMA聚类分析（GS=0.64时，分为4亚类）和主成分分析结果高度一致，表明中国山药种质具有显著的遗传分化。ZHOU等^[25]利用ISSR分子标记对28份山药资源进行遗传多样性分析，将28个山药品种分成4组，CAO等^[14]结合表型特征和SSR-SRAP分子标记将112个山药品种分为6组，本研究的分类数目差异可能源于种质材料地理分布差异或标记方法的不同（ISSR vs SSR/SRAP）。

本研究通过聚类分析，在GS为0.64时将34份山药种质分为4个亚类，江西山药单独归为一类，且与其他山药种质遗传距离较远，同时，群体结构分析显示江西山药存在2类基因库（基因库2和基因库4）的基因，推测其可能是在进化或人工选择中发生了2类基因组重组而形成的新品种，但基因组重组究竟源于自然杂交还是人工定向选择还有待进一步验证。后续可开展以下研究：全基因组关联分析（GWAS）定位重要性状位点；扩大样本量，构建涵盖野生—栽培种的泛基因组图谱；结合历史栽培记录解析人类活动对山药遗传结构的影响。这将为山药种质创新提供更精准的分子设计育种方案。

一般来说，种群的遗传多样性水平与种质资源潜力呈正相关关系，种群的遗传多样性越高，说明种质资源潜力越大^[26]，种群中的个体受其他外部因素的影响越小，就越能适应环境，促进其对异质性生境的生态位分化与扩张，进而提升种群的增长速率与分布范围。相比之下，遗传多样性较低的种群适应性较差，更容易受到环境影响^[27]。尽管本研究和曾昭清等^[28]均证实山药具有较高的遗传多样性（GS范围0.54~0.91），但地理距离与遗传距离的关联性仍存在矛盾，栽培山药和野生山药之间存在遗传差异。另外，CAO等^[14]对山药的起源和遗传关系分析表明，山药可能起源于中国，而本研究的基因库分布模式却未呈现明显地理聚类。这种分歧可能不仅源于不同标记系统对基因流的敏感度差异，也与现代品种跨区域引种扰乱了自然遗传结构有关。

综上，本研究选取的34份山药资源的遗传多样性十分丰富，为山药资源的分类、育种、种质创新、利用和品种保护提供了理论参考。

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基金资助

国家中药材产业技术体系山药运城综合试验站项目(CARS-21)

运城市科技计划(YCKJ-2023014)