超低温冷冻对降香黄檀种子生理生化特性的影响

Effects of Cryopreservation on Physiological and Biochemical Characteristics of Dalbergia odorifera Seeds

摘要

为探索降香黄檀种质资源的长期保存技术，以成熟带果荚种子为材料，分析直接冷冻法、缓慢冷冻法、玻璃化冷冻法等不同冷冻方式和冷冻时间（1~90 d）对种子发芽率及生理生化指标的影响。结果表明，降香黄檀带果荚种子可采用直接冷冻法，无需低温预冷处理，种子发芽率达96.67%，显著优于缓慢冷冻法和玻璃化冷冻法。冷冻时间延长会导致降香黄檀种子发芽率缓慢下降，但60 d后仍维持在85%以上。生理指标测定结果显示，超低温处理初期（≤3 d）抗氧化酶（SOD、CAT）和α-淀粉酶（a-AMY）活性显著升高，POD、LDH活性和脂质过氧化产物（MDA）含量、蛋白质（SP）含量受到抑制；30 d后仅MDA含量显著累积，SOD、POD、CAT、α-AMY、LDH活性和SP含量均下降，表明种子在冷冻初期会激活SOD、CAT和α-淀粉酶活性响应细胞损伤；随冷冻时间延长，种子细胞膜完整性受损，抗氧化能力下降。相关性分析结果表明，发芽率与MDA含量呈负相关，与SOD、POD、CAT等活性呈正相关。研究结果证实，超低温保存技术适用于降香黄檀种子长期贮藏，直接冷冻法可作为优选方案。

Abstract

To explore long-term preservation techniques for germplasm resources of Dalbergia odorifera, in this study, mature seeds with pods were used as materials to investigate the effects of different freezing methods(direct freezing, slow freezing, and vitrification freezing) and freezing durations(1-90 days) on seed germination rate and physiological-biochemical indices. The results demonstrated that the seeds with pods of Dalbergia odorifera could be storaged by the direct freezing method requiring no low-temperature precooling and achieving a germination rate of 96.67%, significantly outperforming slow freezing and vitrification. Although prolonged storage duration led to a gradual decline in germination rate, it was maintained above 85% even after 60 days. Physiological analyses revealed that during the early stage of cryopreservation(≤3 days), the activities of antioxidant enzymes(SOD and CAT) andα-amylase(α-AMY) increased significantly, whereas POD and LDH activity, malondialdehyde(MDA) content, and soluble protein(SP) content were suppressed. After 30 days, only MDA content showed a significant accumulation, while SOD, POD, CAT, α-AMY, LDH, and SP levels all declined. These findings suggested that SOD, CAT, and α-AMY were activated to counteract cellular damage in seeds at the initial freezing stage, however, as extension of freezing, membrane integrity in seeds was progressively compromised and antioxidant capacity was weakened. Correlation analysis further indicated that germination rate was negatively correlated with MDA content and positively correlated with the activities of SOD, POD, and CAT. Collectively, this study confirmed that cryopreservation was a viable strategy for long-term storage of D. odorifera seeds, with direct freezing was recommended as the preferred solution.

Graphical abstract

关键词

降香黄檀 / 直接冷冻法 / 玻璃化冷冻法 / 超低温 / 发芽率

Key words

Dalbergia odorifera / direct freezing method / vitrification freezing method / ultra-low temperature / germination rate

降香黄檀（Dalbergia odorifera）属蝶形花科黄檀属半落叶大乔木，又名降香、花梨木、花梨母、黄花梨、降香檀等，国家二级保护植物，我国珍稀濒危红木树种。降香黄檀心材红褐色，纹理致密，为上等家具用材，具有独特清香，树干和根亦可药用，是中药“降香”的药用来源，为良好的镇痛剂，亦可治刀伤。降香黄檀目前主要依赖种子繁殖，多随采随播。种子作为植物遗传信息的重要载体，是种质资源保存、良种选育的重要物质基础。相较离体保存、活体保存而言，贮藏种子可以最大限度地保存其遗传多样性，种子受外界环境影响较小，且具有运输方便、成本低等优点^[1]。

种子的超低温冷冻技术（液氮保存），即将种子置于液态（-196 ℃）或气态（-150 ℃）的液氮中进行冻存。因在超低温环境下，种子的新陈代谢受到抑制，细胞活动基本停止，可最大程度地减缓种子劣变，延长种子的贮藏时间。理论上通过超低温保存，种子的贮藏寿命可达上百至上千年^[2-3]。自1973年有学者首次使用液氮成功冻存胡萝卜体细胞胚，目前针对花药、芽、茎尖、花粉、种子、愈伤组织，乃至植物幼苗等多种种质^[4-11]材质开展了超低温研究。超低温保存种子的方式操作相对简单，目前关于种子超低温保存的研究逐渐增多，对小麦、玉米、葱韭类蔬菜种子、草本植物种子、豆科植物种子等研究均表明，超低温保存可保持其种子活力^[10,12-15]。对香椿^[16]、马尾松^[1]、红豆杉^[17]、肉豆蔻^[18]、高良姜^[19]、杜若^[14]、过江藤^[14]、夏枯草^[14]、皱果苋^[14]、罗勒^[14]、山香^[14]等多个林木、草本植物的种子在不同冷冻方式下种子生理生化指标及发芽率的研究结果表明，香椿、过江藤、山香种子适用于玻璃化冻存法；马尾松、罗勒种子适用于直接冻存；红豆杉可用PVS4冷冻保护剂冻存；含水量24.44%的肉豆蔻可用玻璃化和缓慢冻存法，含水量27.15%肉豆蔻可采用直接冻存法，含水量13.58%高良姜采用玻璃化冻存法；而皱果苋、夏枯草种子适合采用缓慢冻存法，杜若种子采用缓慢冻存和直接冻存均可。当前关于降香黄檀种子资源保存的研究仅局限于种子的形态^[20]、萌发特性^[21]的研究。曾琳等^[22-23]就降香黄檀的种子和离体胚进行了超低温冻存研究，结果表明，玻璃化冷冻法优于快速冷冻法；当降香黄檀含水量为12.35%时，贮藏效果最佳。

因实际生产中，降香黄檀育苗或保存多采用带果荚种子。因此，本研究以降香黄檀带果荚种子为材料，运用3种冷冻方式，对种子进行超低温保存，探讨在超低温保存过程中种子发芽率、α-淀粉酶（α-AMY）、脱氢酶（LDH）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）活性，丙二醛（MDA）和可溶性蛋白质（SP）含量等生理生化指标的内在变化规律，探究超低温保存降香黄檀带果荚种质的可能性，旨在为降香黄檀种质资源的长期保存提供一条新途径。

1 材料和方法

1.1 试验材料

成熟的降香黄檀果荚于2023年12月采自海南省乐东黎族自治县。降香黄檀果荚晾晒至果荚两侧革质翅片可轻松揉搓脱落时，获取带果荚种子。所有种子经初步净种处理后，置于5 ℃低温冰箱（相对湿度40%~50%）进行短期贮藏备用。

1.2 试验方法

1.2.1 种子基本特性测定

种子大小^[24]：采用四分法，随机选取降香净种50粒，4次重复，采用游标卡尺测量种子的长（纵轴）、宽（横轴）及厚度，计算平均值和标准差。

千粒质量：参照《林木种子检验规程》，随机选取降香净种100粒，8次重复，称量种子的质量，计算平均值和标准差。

发芽率：随机抽取种子150粒，置于浸湿脱脂棉的双层滤纸塑料发芽盒（14.5 cm×8.5 cm×10.5 cm）内，30 ℃恒温、光周期为8 h/14 h的光照培养箱内进行发芽培养。种子萌发标准为胚根突破种皮的长度超过种子直径。逐日记录各试验组的种子发芽数，试验结束后统计种子发芽率。

1.2.2 种子含水率测定

采用低温烘干法^[25]（103 ℃烘干17 h）测定。3次重复，每个重复30粒。

初始含水率=（鲜质量-干质量）/鲜质量×100%（1）

1.2.3 冷冻方式试验

采用直接冻存、缓慢冻存、玻璃化冻存3种超低温保存方法^[26]，对降香黄檀带果荚种子进行超低温贮藏48 h，测定种子发芽率。

直接冻存法（Direct freezing，DF）：将放入50 mL冻存管的降香黄檀种子，直接投入液氮中冻存，48 h后取出解冻。

缓慢冻存法（Slow freezing，SF）：将经过PVS2（30%甘油、15%乙二醇、15%二甲基亚砜、0.4 mol/L蔗糖）处理过的降香黄檀种子加入50 mL冻存管中，依次置于4 ℃冰箱中保存30 min，-20 ℃冰箱中保存60 min，液氮中冻存，48 h后取出解冻。

玻璃化冻存法（Vitrification freezing，VF）：将降香黄檀种子依次在装载液LS（2 mol/L甘油、0.4 mol/L蔗糖的MS溶液）处理20 min，PVS2中处理30 min，更换预冷的PVS2，迅速投入液氮中，48 h后取出解冻。

解冻：经液氮处理后，将种子在40 ℃水浴锅中解冻2 min。缓慢冻存和玻璃化冻存需用卸载液US（1.2 mol/L蔗糖的MS培养液）冲洗2~3次，每10 min更换一次洗涤液，再用无菌水清洗3次，每次10 min。直接冷冻法冻存的种子用无菌水清洗3次，每次10 min。

1.2.4 冷冻时间试验

采用直接冻存的方法，对降香黄檀种子进行超低温保存。冷冻时间分别为3、7、10、15、30、60、90 d，测定种子发芽率。

1.2.5 种子生理生化指标测定

选择经直接超低温冷冻法处理冻存3、7、10、30 d的降香黄檀种子进行生理生化活性指标测定。其中，可溶性SP含量采用考马斯亮蓝测定^[27]，α-AMY活性采用淀粉酶试剂盒（试剂盒为南京建成生物工程研究所淀粉酶试剂盒C016-1，碘－淀粉比色法）测定，硫代巴比妥酸测定MDA含量^[28]，氮蓝四唑测定SOD活性^[26]，愈创木酚测定POD活性^[28]，CAT试剂盒（试剂盒为南京建成生物工程研究所过氧化氢酶试剂盒A007-1-1）测定CAT活性，LDH试剂盒（试剂盒为Solarbio BC0680-50T/24S）测定LDH活性。

1.3 数据分析

采用WPS 2000对数据进行处理，用Origin 2021对数据进行分析、热图绘制。

2 结果与分析

2.1 降香黄檀带果荚种子的基本特性

降香黄檀种子肾形，无胚乳，种皮不透水且与子叶不易分离，胚与子叶质量比很小。经测定，降香黄檀带果荚种子长13.56 mm、宽7.19 mm、厚1.95 mm。带果壳千粒质量57.75 g，初始含水量为14.33%。

2.2 不同冻存方式对发芽率的影响

由图1可知，3种冷冻方式中，采用直接冻存的降香黄檀种子发芽率最高，缓慢冻存法其次，玻璃化冻存法次之，略低于缓慢冻存方式。从3种冷冻方式种子发芽势来看，3种冷冻方式下，种子均在第4天发芽，缓慢冷冻方式下种子发芽速度最快，种子在第7天开始大量萌芽，第14天基本结束发芽；玻璃化冷冻方式下种子发芽速率居中，第8天开始大量发芽，第19天结束发芽；直接冷冻下，种子发芽启动最慢，第11天启动大量发芽，第14天种子发芽数达到25粒，第19天结束发芽。直接冷冻方式种子虽发芽前期缓慢，其萌发进程存在滞后性，但最终发芽率优势显著。此外，直接冷冻法无需进行复杂预处理，操作更环保便捷。

2.3 不同冷冻时间对发芽率的影响

从图2可以看出，随冷冻时间的延长，种子发芽率整体呈下降趋势，仅在冷冻第10天时，种子发芽率出现短暂的升高。种子在液氮冷冻初期（≤30 d）种子发芽率较高（≥93.00%），具有良好的萌发潜力；冷冻30~60 d时，发芽率明显下降（≤87.00%），且随时间延长持续降低至80.00%。结果表明，长期冷冻可能会对种子的细胞结构或代谢功能产生累积性损伤，从而抑制发芽。

2.4 不同冷冻时间对种子生理指标的影响

从图3可以看出，SOD、CAT、α-AMY活性均随冷冻时间整体呈先上升后下降趋势；而POD、LDH活性和SP含量变化趋势相反，随冷冻时间呈先下降后上升再下降趋势；MDA含量在冷冻初期略降，后随冷冻时间延长，不断升高。

在冷冻0~7 d时，SOD活性从50.11 U/g上升到131.11 U/g；冷冻10~30 d时，活性由108.27 U/g直接降至9.69 U/g。冷冻初期POD活性由208.38 U/（g·min）下降至125.32 U/（g·min），3 d后酶活开始上升，10 d酶活达到314.60 U/（g·min）后再次急速下降至99.40 U/（g·min）。冷冻3 d，MDA含量仅0.000 23 μmol/g，30 d后升高至43.74 μmol/g。CAT冷冻3 d后，活性急速上升，由62.40 U/g上升到269.21 U/g，第7天略有降低，冷冻30 d后急速降至0.18 U/g。α-AMY活性冷冻3 d被激活，活性由20.96 U/g提升至28.89 U/g，3 d后活性骤降，7~10 d活性维持在相对稳定之后，逐渐失活，30 d降低至1.61 U/g。7 d内LDH活性由0.41 U/（g·min）降至0.36 U/（g·min），7~10 d为低温激活阶段，活性由0.36 U/（g·min）上升至0.77 U/（g·min），30 d后因损伤累积活性下降至0.46 U/（g·min）。冷冻3~7 d，SP含量保持在44.06~44.12 mg/g基本不变，7 d后急速上升至158.50 mg/g，30 d后下降至96.76 mg/g。

2.5 冷冻时间、发芽率和生理指标相关性分析

由图4可知，T（冷冻时间）与MDA、SOD、CAT、α-AMY呈极显著相关性，其中与MDA呈极显著正相关，与SOD、CAT、α-AMY呈极显著负相关；此外，T与GN（发芽率）、POD呈负相关，与LDH、SP呈正相关。GN仅与MDA含量呈负相关，而与SOD、POD等其他生理指标均呈正相关，但所有相关性均不显著。MDA与SP呈正相关，而与SOD、POD、CAT、α-AMY、LDH均呈负相关，其中与SOD、CAT呈极显著负相关,与α-AMY呈显著负相关。SOD与POD、CAT、α-AMY呈正相关，其中与CAT呈极显著正相关，与α-AMY呈显著正相关；SOD与LDH、SP呈负相关，相关性不显著。POD与LDH、SP呈极显著正相关，与CAT呈正相关，与α-AMY呈负相关。CAT与α-AMY呈显著正相关，与LDH相关性不大，与SP呈负相关。此外，LDH与SP呈极显著正相关，与α-AMY呈负相关。

3 结论与讨论

超低温贮藏方式目前被认为是保存种质资源最理想、最长远、最稳定的方法。常用的冻存方法中直接冻存法相对来说，最环保、操作最简单、成本最低。直接冻存法温度迅速下降，细胞内水分还来不及形成冰晶，此方法较适合于低含水量种质；玻璃化冻存法目前应用最广泛，其中使用的冷冻保护剂可使植物进入玻璃化状态，且使组织进一步脱水，可避免细胞内部形成冰晶，提高存活率^[29]，但冷冻保护剂对种质有毒害作用。现有研究表明，香椿^[16]、高良姜种子^[19]可用玻璃化冻存法保存；益智、白木香、海南龙血树^[26，30-31]种子可用直接冻存法保存。

种子发芽率是植物种子活力大小最直观的指标之一。曾琳等^[15]曾以降香黄檀种子和离体胚为试验材料，采用快速冻存和玻璃化冻存对不同含水量种子的发芽率进行测定，结果表明，超低温可以用于降香黄檀种子保存，与本试验结果一致。此外，曾琳等^[15]试验还表明，种子超低温保存最佳条件为含水量12.35%；离体胚超低温保存最佳条件为含水量15.04%，玻璃化冷冻法优于快速冻存。本研究采用的是带果荚种子贮藏，与曾琳等^[15]所用材料略有差异，3种冻存方法的发芽率无显著差异，因直接冻存法操作简便、环保，直接冷冻避免了预处理对种子的潜在损伤，建议降香黄檀种质用直接冻存法。

植物细胞在受到超低温冷冻的低温胁迫后，其细胞组织会通过调控产生很多活性氧，激活抗氧化酶体系各种关键酶的酶活来消除活性氧，防止膜脂质过氧化^[32]，避免或降低其低温受损程度。在植物的抗氧化防御体系中，SOD、POD、CAT、LDH等均为植物抗氧化酶体系的核心酶类，在植物种子抵御低温胁迫中发挥关键作用，多通过观测这些酶活的变化趋势，来研究植物低温胁迫的机理。现有研究结果表明，这些酶活的强弱与植物在超低温环境下的抗性有着重要的相关性。POD主要是通过消除细胞内脂质过氧化产物的毒害来保护细胞膜结构。CAT是通过分解细胞内的过氧化氢阻断氧化损伤。LDH多用于种子活力的检测，是种子活力的标志性酶，其酶活强弱可直接反映种子生命力的强弱。α-AMY主要是通过催化淀粉水解为种子萌发提供能量^[33]。香椿种子在直接冷冻条件下SOD、CAT、POD活性均显著降低^[16]，龙血树^[26]、益智^[30]、玉蝉花^[34]种子在超低温冷冻条件下，抗氧化能力均减弱，与本研究结论一致。

可溶性蛋白（SP)是植物种子中重要的营养物质之一。在超低温保存过程中，低温可刺激新的可溶性蛋白的生成，导致超低温保存后可溶性蛋白含量增加^[35]。龙眼种子经玻璃化冷冻后SP含量显著提高^[33]，山茶花粉、水曲柳合子胚、橡胶树花粉经超低温保存后SP含量均增加^[4，34-35]。本研究结果表明，随冷冻时间延长，SP含量先下降后增加，虽冷冻30 d后含量又呈下降趋势，但冷冻30 d的SP含量依然高于未低温保存时初始值，表明超低温冻存可促进降香黄檀SP含量增加，与上述结果类似。

MDA含量与抗氧化酶体系作用相反，其作为膜脂过氧化终产物，其含量越高，表明植物细胞膜的损害程度越严重，多用于衡量评估植物细胞膜受损程度。水曲柳合子胚MDA含量在玻璃化超低温作用下呈下降趋势^[35]；大苞鞘石斛原球茎MDA含量呈升高趋势^[36]；益智种子MDA含量呈先升后降趋势^[30]，不同种质在超低温冻存情况下MDA变化不一致，本研究MDA含量呈先降后升趋势，表明冷冻初期，低温激活细胞膜的应急反应，随着冷冻时间延长，细胞膜受损程度增加。

本研究表明，降香黄檀种子可通过直接冷冻法在液氮中保存至少60 d，发芽率维持85%以上，为该物种建立低成本、高效的长期保存技术提供了科学依据。本试验采用带果荚种子，后续可以探究去果荚种子、不同含水量种子或更长冷冻周期种子的保存稳定性，也可进一步对其基因组进行测定。此外，还可结合脱水处理，进一步将种子含水量降低，减少冰晶使用或筛选天然冷冻保护剂，降低化学毒性对种子的影响，进一步提升超低温保存的稳定性。

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基金资助

海南省省属科研院所技术创新项目(KYYSLK2023-011)