杂粮红曲的发酵及其影响因素分析

Analysis of Fermentation of Coarse Cereals by Monascus and Its Influencing Factors

摘要

红曲是红曲霉发酵谷物类获得的产物，具有多种用途。试验旨在研究以玉米、马铃薯、红薯、糯米等大宗淀粉类杂粮作为紫红曲霉发酵基质生产红曲色素的可行性及产量，并优化玉米红曲固态发酵的工艺参数。以不同杂粮粉为碳源，设置2%、4%、6%等3个梯度添加量，进行液态发酵，测定红曲色素色价；以玉米粒为基质进行固态发酵，通过单因素试验探讨种子液接种量、温度和发酵时间对红曲色价的影响，并通过正交试验优化发酵工艺。结果表明，以玉米粉、马铃薯粉、红薯粉为碳源进行液态发酵的最适添加量为4%，糯米粉的最适添加量为2%；4种碳源均在发酵7 d时色价最高，红薯粉发酵色价低于其余3种，其余3种碳源发酵色价没有明显差异；玉米红曲固态发酵色素色价受温度、发酵时间、接种量等因素影响，各因素影响顺序依次为接种量>时间>温度，最佳发酵工艺为接种量20%、30 ℃、发酵11 d，获得的发酵产物红曲色素色价为102.81 U/g。糯米、玉米、马铃薯、红薯均可作为红曲霉发酵基质生产红曲色素。综合考虑，以玉米作为基质生产红曲产品效益较好。

Abstract

Red yeast is the product obtained from fermentation of coarse cereals by Monascus and has multiple applications. In this study, aiming to evaluate the feasibility and yield of producing Monascus pigments using the bulk starchy coarse cereals such as maize, potato, sweet potato, and glutinous rice as the fermentation substrate of Monascus purpureus to optimize the process parameters for solid-state fermentation of maize Monascus. Taking different coarse cereals as carbon sources, three supplementation gradients including 2%, 4%, and 6% were set to conduct liquid-state fermentation and determine the pigment values of Monascus. Using whole maize grains as the substrate for solid-state fermentation, single-factor experiments were employed to investigate the influences of inoculum volume, temperature, and fermentation time on the pigment values of Monascus, followed by orthogonal design for optimization of fermentation. The results revealed that, under liquid-state conditions, the optimal supplementation levels for maize, potato, and sweet-potato flours were 4%, whereas glutinous rice flour performed best at 2%. Maximum pigment values were attained after 7 days of fermentation for all the four carbon sources. Sweet-potato flour produced significantly lower pigment values than the other three substrates, while no significant differences in pigment values from fermentation were observed among maize, potato, and glutinous-rice groups. In solid-state fermentation of maize Monascus, the pigment values was influenced by the factors such as temperature, fermentation time, and inoculum volume, and the order of influence of the factors was as follows: inoculum volume > fermentation time > temperature. The optimum fermentation processes were 20% of inoculum volume, 30 °C, and 11 days, and the red-pigment value of the fermentation product yielded was 102.81 U/g. These findings demonstrated that glutinous rice, maize, potato, and sweet potato were effective substrates for Monascus fermentation to produce Monascus pigments. Overall, maize presented the best comprehensive benefits for Monascus product production.

Graphical abstract

关键词

红曲霉 / 杂粮 / 发酵 / 影响因素 / 红曲色素

Key words

Monascus / coarse cereals / fermentation / influencing factors / Monascus pigment

红曲（Red yeast rice，RYR）是紫红曲霉（Monascus purpureus）接种于谷物后，经固态或液态发酵制成的药食两用产品，迄今已有超过1 800 a应用历史^[1]。1979年，ENDO^[2]首次从红曲中分离得到红曲的主要功能成分Monacolin K（MK），其结构与洛伐他汀一致，能通过竞争性抑制HMG-CoA还原酶，显著降低血清中的低密度脂蛋白（LDL）^[3]，使红曲成为天然降脂的新兴药物。除MK外，红曲还富含γ-氨基丁酸（GABA）、红曲色素、植物甾醇、麦角固醇及酚类化合物，具有降血脂、抗氧化、抗抑郁、增加骨密度和调节肠道菌群等多重功效^[4-6]。红曲色素（Monascus pigments）是由红曲霉固态或液态发酵产生的一类天然聚酮类色素，呈橙、红、黄三色系，兼具着色、功能活性与保健价值多重作用，在食品添加剂、医药领域应用广泛。

传统红曲及其色素以大米为基质，存在原料成本高的问题。而玉米、马铃薯、红薯等杂粮占我国粮食总产40%以上，价格低廉且营养全面，微量元素如钾、铁、锌等含量较大米高，有望通过固态发酵实现功能成分富集，同时提升杂粮的附加值^[7]。近年来，杂粮因富含抗性淀粉、多酚及微量元素，成为红曲发酵基质的潜在替代品。有研究陆续报道，小米、薏米、荞麦等杂粮可替代大米用于红曲发酵，且红曲色素产量与MK产量更高^[8-10]。ZHANG等^[8]研究发现，以小米为基质进行固态发酵的MK产量显著高于大米。张娜娜等^[9]研究表明，荞麦红曲的MK含量可达200.00 mg/kg。侯敏等^[11]研究了麦芽糖、葡萄糖、淀粉等不同碳源对红曲霉液态发酵产红曲色素的影响，结果表明，淀粉能促进红曲霉菌丝的生长，水溶性和醇溶性色素产量均较高。此外，杂粮中的绿原酸、阿魏酸等酚类有机酸可能促进紫红曲霉的红曲色素合成^[7]。已有文献主要聚焦在荞麦、薏米、小米等杂粮的固态发酵，至今未见以马铃薯、红薯为基质的杂粮红曲发酵报道。

本研究以玉米、马铃薯、红薯和糯米等大宗淀粉类杂粮作为紫红曲霉发酵基质，评估了其生产红曲色素的可行性及产量差异，并通过单因素与正交试验优化玉米红曲固态发酵的关键工艺参数，旨在为杂粮资源的高值化利用、红曲发酵底物的选择以及功能红曲产品的开发提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

紫红曲霉（Monascus purpureus）菌株GDMCC 3.439购自广东省微生物菌种保藏中心（ACCC30352）。大米、糯米、干玉米粒（橙色）、鲜马铃薯、鲜红薯，均从市场购买。

麦芽汁培养基、蛋白胨、牛肉膏、硫酸镁、磷酸氢二钾、硫酸亚铁，均购自广西南宁康维生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化及培养

将菌种接种到麦芽汁琼脂培养基上，28 ℃培养7~9 d，进行活化。菌种活化后，加生理盐水10 mL至活化菌种培养基上制成孢子悬液，取孢子悬液1 mL接种于50 mL麦芽汁液体培养基中，置于摇床培养箱中，30 ℃，150 r/min培养3 d，作为发酵用种子液。

1.2.2 杂粮原料的处理

将鲜马铃薯与红薯洗净，切块，蒸熟，烘干，粉碎成粉末。干玉米与糯米直接粉碎成粉末。

1.2.3 液态发酵试验

分别称取适量（2、4、6 g）杂粮粉、胰蛋白胨2.00 g、牛肉膏1.00 g、七水硫酸镁0.05 g、磷酸氢二钾0.13 g、七水合硫酸亚铁0.02 g，置于250 mL锥形瓶中，加入蒸馏水定容至100 mL，用玻璃棒充分搅拌均匀，调节pH值至5~6。121 ℃高压灭菌20 min，制备液体发酵培养基。将种子培养液1 mL接种到不同杂粮碳源的液态发酵培养基中，置于摇床中，30 ℃ 150 r/min培养发酵。在不同的发酵时间（5、7、9 d）取样，测定红曲色素色价。

1.2.4 玉米红曲固体发酵单因素试验

将玉米粒浸泡20 h后，用高压蒸汽锅121 ℃高压30 min蒸熟，冷却后进行试验。发酵完毕后60 ℃烘干、粉碎，测定色价。

1.2.4.1 接种量试验

按种子液接种量与玉米粒体积质量比，分别设置10%、20%和30%等3个梯度的接种量发酵，30 ℃发酵10 d测定红曲色价。

1.2.4.2 发酵温度试验

按20%的接种量，接种完成后分别在26、30、34 ℃条件下恒温发酵，发酵10 d时测定色价。

1.2.4.3 发酵时间试验

按20%的接种量，在30 ℃恒温发酵，分别在发酵9、11、13 d时测定色价。

1.2.5 玉米红曲固体发酵正交试验

在单因素试验结果的基础上，以不同接种量（10%、20%、30%）、不同发酵温度（26、30、34 ℃）、不同发酵时间（9、11、13 d）条件下发酵，即三因素三水平的正交试验（表1）。

1.3 红曲色素提取与色价测定

1.3.1 液态发酵红曲色素色价提取与测定

从发酵培养基中各吸取1 mL培养物，注入10 mL圆底连盖离心管内，再加入9 mL 70%乙醇，混匀，60 ℃水浴1 h后，用70%乙醇定容至10 mL，然后放入离心机，1 000 r/min离心10 min。离心完成后，取上清液，稀释一定倍数后，用分光光度计于505 nm 处测量稀释液的吸光度。

色价（U/mL）=A×10×稀释倍数（1）

式中，A为测定的吸光值；10为提取液总体积（mL）。

1.3.2 固体发酵产物红曲色素色价提取与测定

将样品0.2~1.0 g置于100 mL容量瓶中，用70%乙醇溶液溶解并定容至刻度，60 ℃水浴1 h，取出冷却后，用70%乙醇定容至100 mL，过滤，将滤液70%乙醇稀释一定倍数后（使最终吸光值为0.2~0.8），于505 nm 处测量稀释液的吸光度。

色价（U/g）=（A×100×稀释倍数）/m（2）

式中，A为测定的吸光值；100为提取液总体积（mL）；m为称取样品的质量（g）。

1.4 数据分析

试验数据用Excel记录整理，然后采用GraphPad Prism 6.01软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 杂粮红曲液态发酵结果

分别以糯米粉、玉米粉、马铃薯粉和红薯粉为碳源，添加量分别为2%、4%和6%进行红曲液态发酵，并在发酵第5、7、9天取样进行红曲色素色价测定，比较不同碳源、不同添加浓度下的红曲色素色价，结果见图1。

由图1可知，4种淀粉类杂粮均可作为红曲发酵的碳源，不同添加浓度、不同发酵时间下，色价不同。糯米粉的最适添加量为2%，玉米粉、马铃薯粉和红薯粉的最适添加量为4%，在发酵7 d时红曲色价最高，4种杂粮碳源发酵产物色调外观没有明显差别。在此基础上，进行一次发酵验证试验，结果表明（表2），在合适添加比例和合适发酵时间时，发酵7 d时，糯米粉、玉米粉与马铃薯粉色价显著高于红薯粉（P<0.05），马铃薯粉的色价最高；其余各个发酵时间段杂粮的红曲色价差异均不显著。

2.2 玉米红曲固态发酵单因素试验分析

基于液态发酵结果，考虑成本与原料处理方式的便捷性，固态发酵选用玉米作为发酵基质，研究了玉米红曲的制备工艺及影响其色素色价的因素。

2.2.1 接种量对玉米红曲色价的影响

接种量高低与菌丝生成和初始含水量有关，最终会影响代谢产物的积累。从表3可以看出，接种量为20%时红曲色价最高，显著高于接种量为10%和30%（P<0.05），且接种量为10%和30%之间差异不显著。

2.2.2 发酵温度对玉米红曲色价的影响

由表3可知，30 ℃发酵的色价最高，其次是34 ℃，极显著高于26 ℃发酵（P<0.01）。

2.2.3 发酵时间对红曲色价的影响

紫红曲霉菌丝的生成及代谢产物的积累，均需要一定时间。由表3可知，发酵11 d时红曲色价最高，极显著高于发酵9 d和13 d（P<0.01），但发酵9 d色价显著高于发酵13 d（P<0.05）。

2.3 玉米红曲发酵正交试验分析

各因素对玉米红曲色价影响正交试验结果如表4所示。

从表4可以看出，各因素对玉米红曲色素影响的顺序依次为：接种量>发酵时间>发酵温度，最佳组合工艺为A2B2C2，即接种量为20%，发酵温度30 ℃，发酵时间11 d。为了验证该组合，在此条件下进行了3次平行发酵，发酵后红曲的平均色价为102.81 U/g，与发酵时间因素确定的结果基本一致，与同样规模条件下发酵的红曲米色价103.95 U/g基本一致。玉米红曲在优化工艺下发酵的结果见图2，可以看到玉米红曲的色泽鲜亮，是优良的天然红色素原料，可作为食品添加剂与着色剂。

3 结论与讨论

3.1 杂粮碳源对红曲液态发酵色价的影响

玉米、马铃薯、红薯等杂粮除淀粉含量高外，还含有1%~8%的蛋白质及0.1%~4%的脂质，可为红曲霉生长提供充足的碳源与氮源，促进菌丝的生长。不同添加量发酵结果显示，添加量过高，色价反而会降低。可能有几个原因：一是添加量过高，导致发酵液稠度较高，培养基渗透压增高，不利于通氧与溶氧；二是淀粉被大量分解成寡糖和葡萄糖，产生了葡萄糖抑制效应，也增加了培养基渗透压，从而抑制了次级代谢产物色素的合成；三是添加量增加，其中的不溶性膳食纤维等物质也随之增加，可能导致溶氧或传质受限，生物量下降，酶活性下降等。CHEN等^[12]研究显示，过多的马铃薯渣添加量会抑制红曲菌丝生长和色素的产量。4种碳源比较，马铃薯粉作为碳源，在30 ℃、150 r/min、7 d条件下发酵红曲色素色价较高，且显著高于红薯粉，可能与其能提供速效碳氮源、适宜的渗透环境及磷、钾离子含量有关，后者可促进次级代谢产物合成^[13-14]。30 ℃发酵7 d时，糯米粉在2%的添加量，获得与玉米粉、马铃薯粉4%的添加量一致的红曲色素色价水平，可能与糯米含有较多支链淀粉，容易被淀粉酶快速分解为葡萄糖和麦芽糖有关。这与侯敏等^[11]研究的以麦芽糖作为碳源时水溶性色素色价最高，以淀粉作为碳源时菌丝生物量最高，且水溶性与醇溶性色素色价均较高的结果基本一致。最佳发酵条件下，4%红薯粉为碳源时色价最低（183.3 U/mL），可能与其高果胶提高发酵液黏度、降低溶氧，限制了微生物的代谢有关。郭红珍等^[15]研究表明，与以淀粉、麦芽糖、葡萄糖作为碳源比较，以玉米粉作为红曲液态发酵的碳源，菌丝生长量和红曲色素产量最高。本试验结果也显示，玉米粉是红曲发酵生产红曲色素的优良碳源。

此外，杂粮中天然存在的酚酸（如绿原酸）可作为前体物质，经红曲霉转化生成具有更强抗氧化活性的红曲橙色素衍生物^[16]。陈慎等^[17]研究表明，液体发酵中，碳源种类与红曲色素产量及桔霉素的产量有一定关系，以葡萄糖、麦芽糖、甘露醇作为碳源时，红曲色素色价分别达到了218.40、206.52、145.08 U/mL，明显高于以大米粉为碳源的72.02 U/mL。本研究表明，以糯米粉、玉米粉、马铃薯粉和红薯粉为碳源液态发酵时，在较佳的发酵条件下，色价为183.30~195.30 U/mL。可见，与大米相比，马铃薯、玉米等价格更低、营养更全面，富含抗性淀粉及微量元素，既降低了生产成本，又通过发酵进一步提升了功能成分含量，为杂粮精深加工提供了新途径。

3.2 接种量对玉米红曲色价的影响

接种量与初始含水量和生物量有关，合适的接种量可维持适度的营养与空间竞争，能让菌体快速占据底物空间、缩短延滞期，有利于色素的积累；接种量过高可能导致底物快速消耗及溶氧不足，从而抑制次级代谢，或导致产物早期进入分解阶段；接种量过低，可能导致初始生物量太少，会延长发酵时间，色素不能在同一时段积累。本研究表明，在3个接种量梯度中，20%接种量的色价显著高于接种量为10%和30%。这与李大鹏等^[18]研究表明的用20 g玉米固态发酵，9%为最适接种量有差异，暗示着接种量还受一次发酵基质的多少、浸泡时间有关系，具体影响需要进一步研究。红曲色价受多种因素影响，研究发现，不同批次的发酵，红曲色价差异较大。接种量与初始含水量和生物量有关，本研究仅按照种子液的接种体积计算，没有测定接种前菌丝体的浓度或干质量，可能导致正交试验与单因素试验的结果差异较大。因此，要精确考查接种量的影响，应在种子液培养完成后，测定菌丝体生物量，再根据菌丝浓度计算种子液取量。

3.3 温度对玉米红曲色价的影响

温度通过调控红曲霉细胞膜流动性及关键酶活性，影响菌丝体生长及色素合成，高温利于菌丝体的生长，而低温利于色素的合成。本研究设计26、30、34 ℃等3个梯度恒温发酵，结果显示，30 ℃发酵，玉米红曲色价最高，其次是34 ℃时，26 ℃时色价最低。结果与李大鹏等^[18]报道的30 ℃及WANG等^[19]研究表明的28~32 ℃最适区间一致。徐勇等^[20]设置25、30、35、40 ℃温度梯度，研究了温度对红曲菌M7液态发酵色素产量的影响，结果表明，低温25 ℃和高温40 ℃均不利于色素的产生，而30 ℃时红斑素和红曲红素产量达到最高，35 ℃时红曲素与红曲黄素产量达到最大。有研究表明^[21-22]，先高温（30~34 ℃）发酵可促进菌体快速增殖，再低温（26~30 ℃）发酵可诱导次级代谢产物积累，是提升红曲霉的红曲色素与MK 产量的有效策略。因此，可以进一步研究双阶段发酵法对玉米红曲色价的影响，探索针对菌株的最适菌丝生长温度和培养时间，以及最适产物积累温度及持续时间。

3.4 发酵时间对玉米红曲色价的影响

菌丝的生长和产物的积累均需要一定的时间。本研究发现，玉米红曲的色价随发酵时间的延长呈现先升高后降低的趋势，在9~13 d的发酵段，以发酵11 d时的色价最高，发酵时间延长至13 d，色价下降明显，提示过长的发酵时间可导致代谢产物进入降解阶段，需通过补料工艺或两阶段发酵策略进一步延长高效生产期。可见，在合适的发酵时间停止发酵，不仅可获得较优质的发酵产物，还可节约时间、增加资源的循环利用率。

本研究表明，玉米粉、马铃薯粉、糯米粉、红薯粉等富含淀粉的物质是紫红曲霉液态发酵生产红曲色素的优质碳源，以马铃薯粉和玉米粉较好。玉米粉、马铃薯粉、红薯粉的最适添加量为4%，糯米粉的最适添加量为2%。玉米粒可作为紫红曲霉固态发酵的优质底物，在接种量为20%，发酵温度为30 ℃，发酵时间为11 d时，获得的红曲色素产量最高。因此，以玉米、马铃薯、红薯等大产量杂粮作为红曲的发酵基质，不仅可以整合杂粮的特殊营养成分，开发农副产品的附加值，降低红曲生产成本，还可以改善红曲品质，提高红曲色素色价和MK产量。

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基金资助

2025年广西壮族自治区大学生创新训练计划项目(S202516205071)

广西农业职业技术大学重点科研项目(XKJ2418)