荫生烟草NuTPS2814基因的克隆及其青枯病菌抗性分析

Cloning of NuTPS2814 Gene in Nicotiana umbratica and Analysis of Its Resistance to Ralstonia solanacearum

摘要

为挖掘荫生烟草中参与芳樟醇生物合成的关键基因，并解析其在青枯病抗性中的功能，采用同源克隆法克隆了芳樟醇合成相关基因NuTPS2814，通过生物信息学分析、基因表达模式分析、酶学性质分析系统解析了该基因的功能，并利用体外抑菌试验和烟苗处理抗性试验，探究了NuTPS2814代谢产物对烟草青枯病菌的抑制效果。结果表明，NuTPS2814编码蛋白与芳樟醇合成酶蛋白序列具有较高的相似性，并含有萜类合酶催化活性中心DDxxD和NDIxSxxxE结构域。NuTPS2814与拟南芥香叶基芳樟醇合酶AtTPS04在系统进化树中聚为同一簇。在不同类型烟草种质资源的表达分析发现，NuTPS2814基因可能在荫生烟草中特异性表达。异源合成的NuTPS2814可以催化香叶基焦磷酸（GPP）合成芳樟醇，表明其具有单萜合酶的活性。NuTPS2814代谢产物对烟草青枯病菌GD具有显著的抑制效果，其最小抑菌浓度为100 mg/L，最小致死浓度为400 mg/L，且其抑制强度随NuTPS2814代谢产物浓度的升高而增强。利用NuTPS2814代谢产物预处理烟草幼苗可以显著增强烟苗的青枯病抗性。综上，NuTPS2814基因是在荫生烟草中特异表达的一个芳樟醇合成基因，其代谢产物在烟草青枯病菌抗性中发挥重要作用。

Abstract

To identify key genes involved in the biosynthesis of linalool in Nicotiana umbratica, and elucidate their functions in resistance to Ralstonia solanacearum, in this study, a linalool-synthesis-related gene, NuTPS2814, was cloned using homologous cloning technology, and its function was systematically elucidated by bioinformatic analysis, expression pattern analysis, and enzyme property analysis. Additionally, in vitro antibacterial antibacterial assays and tobacco seedling treatment resistance tests were conducted to evaluate the inhibitory effects of the metabolites of against Ralstonia solanacearum. The results showed that the protein encoded by NuTPS2814 gene exhibited high sequence similarity to linalool synthase proteins, it contained the catalytic active centers DDxxD and NDXxSxxxE domains of terpenoid synthase. NuTPS2814 was clustered with geranyl linalool synthase AtTPS04 in Arabidopsis thaliana in the phylogenetic tree. Expression analysis across various tobacco germplasm resources suggested that the NuTPS2814 gene might be specifically expressed in Nicotiana umbratica. The heterologously synthesized NuTPS2814 could catalyze the synthesis of linalool from geranyl pyrophosphate(GPP), demonstrating its activity as a monoterpene synthase. The metabolites of NuTPS2814 showed a significant inhibitory effect on tobacco Ralstonia solanacearum GD, with a minimum inhibitory concentration of 100 mg/L and a minimum lethal concentration of 400 mg/L, and its inhibitory potency increased with rising concentrations of NuTPS2814 metabolites. Pre-treating tobacco seedlings with the metabolites of NuTPS2814 could significantly enhance their resistance to Ralstonia solanacearum. In summary, NuTPS2814 was a linalool synthesis gene specifically expressed in Nicotiana umbratica, and its metabolites played an important role in the resistance of tobacco Ralstonia solanacearum.

Graphical abstract

关键词

芳樟醇合成基因 / NuTPS2814 / 体外合成 / 青枯病菌 / 抑菌效果

Key words

linalool synthesis gene / NuTPS2814 / in vitro synthesis / Ralstonia solanacearum / antibacterial effect

荫生烟草（Nicotiana umbratica）是烟草属中的一种野生烟草，原产于澳大利亚北部和昆士兰等热带、亚热带地区。其叶与花冠均释放奶香型挥发性物质，表面密被厚层腺毛，腺毛分泌物黏稠，富含萜类等挥发性有机化合物^[1]。

芳樟醇是一种广泛存在于植物中的链状单萜烯醇类化合物，分子式为C₁₀H₁₈O。该化合物为无色油状液体，具有甜嫩新鲜的铃兰样花香。芳樟醇应用领域广泛，在日化工业中，常被用于香水、清洁剂等产品配方，并作为合成乙酸芳樟酯等高价值香料的重要原料^[2]。在医药工业中，其是制备维生素E的重要中间体香叶基丙酮、橙花叔醇、法尼基丙酮和异植醇的重要原料^[3]。此外，芳樟醇还表现出广谱的抗菌活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、黑曲霉菌、桔青霉菌等均有显著抑制作用^[4-7]，同时兼具除臭剂、杀虫剂、杀螨剂等生物活性^[8-9]。

青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引发的细菌性病害，是一种重要的植物土传病害，寄主植物多达50余科200多个属^[10-12]。青枯病的典型特征是发病时间短，蔓延速度快。植物被青枯雷尔氏菌侵染后，顶端幼嫩的组织如幼叶、新生叶等出现萎蔫，在叶片还未退黄变枯前，植株快速脱水、青枯、凋萎。青枯病在茄子、番茄、辣椒、花生、烟草等多种作物中发生，可造成作物大量死亡甚至绝收，危害严重，目前尚无有效的解决办法^[13-17]。

已有研究发现，青枯病菌分泌的效应蛋白RipI能够促进谷氨酸脱羧酶与钙调蛋白的相互作用，进而提升γ-氨基丁酸的合成，从而改变植物代谢并促进细菌生长^[18]。青枯病菌在侵染和致病过程中，涉及趋化作用、次生代谢及抗菌物质解毒等过程的相关基因，表达水平发生显著变化。这些基因均受致病调控因子HrpG统一调控，是青枯病菌实现致病共生或互利共生的必要条件^[19]。

为研究荫生烟草NuTPS2814基因代谢产物对烟草青枯病菌的抑菌效果，本研究通过同源克隆法成功克隆到1个荫生烟草芳樟醇合成基因NuTPS2814，进而从转录表达、酶学特性及代谢产物抑菌活性3个层面，对该基因的生物学功能进行了系统鉴定与验证。

1 材料和方法

1.1 供试材料及试剂

烟草种子由国家烟草种质资源中期库（青岛）提供，其幼苗培养于中国农业科学院烟草研究所温室。烟草青枯病菌GD由中国农业科学院烟草研究所遗传育种中心提供。

ClonExpress II One Step Cloning Kit（C112-01）、RNA Trizol（R401-01）、HiScriptIII RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（R323-01）、FastPure Plasmid Mini Kit（DC201-01）购自南京诺唯赞生物科技有限公司；Trans-T1克隆感受态细胞（CD501-02）、BL21感受态细胞（CD901-02）购自北京全式金生物技术股份有限公司；香叶基焦磷酸（Sigma-Aldrich）（G6772-1VL）购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 NuTPS2814基因的克隆

本研究前期利用三代测序技术获得了荫生烟草花蕾的全长转录组数据，从中筛选到1个完整的单萜合酶基因NuTPS2814。根据NuTPS2814的序列信息，设计特异引物NuTPS2814-F（5'-ATGGATTCCTCA TCAATCTCCT-3'）和 NuTPS2814-R（5'-TT ATATAAAACATGATCTTAAC-3'）。提取荫生烟草花蕾总RNA反转录为cDNA。使用引物NuTPS2814-F和NuTPS2814-R，以cDNA为模板，进行PCR扩增反应。反应体系为95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，50 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，32个循环；72 ℃延伸10 min。利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，随后将获得的PCR产物与Blunt载体（C601-01，南京诺唯赞生物技术有限公司）进行连接、转化，并挑选阳性克隆进行测序。测序验证准确后，即获得含有NuTPS2814基因编码区序列的克隆质粒Blunt-NuTPS2814。

1.2.2 NuTPS2814基因在不同烟草中的表达

　分别提取了荫生烟草（WT49，Nicotiana umbratica）、非洲烟草（WT14，Nicotiana africana）、莲座叶烟草（WT34，Nicotiana rosulata）、洞生烟草（WT39，Nicotiana cavicola)、红花大金元（HD，Nicotiana tabacum）和中烟300（P001，Nicotiana tabacum）的叶片和花蕾的总RNA，分别以上述烟草叶片和花蕾的混合cDNA为模板，使用引物NuTPS2814-F和NuTPS2814-R进行PCR扩增，分析其在不同烟草物种的表达情况。为证明cDNA模板的一致性，利用烟草内参基因Tob103（GenBank号：U60495）的引物Tob103-F（5'-GCAAAGATGGA GTTATGATA-3'）和 Tob103-R（5'-CAAACGAA GAATAGCATGAGG-3'）进行PCR扩增。

1.2.3 NuTPS2814的生物信息学分析

使用本研究获得的NuTPS2814蛋白序列与其他物种的芳樟醇合成酶蛋白序列进行比对。利用MEGA7软件将NuTPS2814与拟南芥中26个萜烯合酶进行序列比对，并通过邻接（Neighbor-Joining，NJ）法构建系统发育进化树（Bootstrap=1 000）。

1.2.4 NuTPS2814原核表达载体构建和大肠杆菌转化

利用同源重组法将NuTPS2814的序列连接到原核表达载体pGEX4中。利用引物pGEX-F：5'-CGTGGATCCCCGGAATTC-3'和pGEX-R：5'-CCGCTCGAGTCGACCCGGG-3'给NuTPS

2814序列添加接头，随后在同源重组酶的作用下，将NuTPS2814序列连接到经BamH I和EcoR I消化的pGEX4载体中，构建pGEX4-NuTPS2814，然后将其转化到大肠杆菌DH5α菌株中，37 ℃倒置暗培养12 h。采用菌落PCR进行阳性克隆筛选，挑选阳性单克隆菌落并提取质粒。经测序鉴定正确后，即成功构建烟表达载体pGEX4-NuTPS2814。

1.2.5 NuTPS2814原核表达和酶活性测定

蛋白诱导表达及纯化。将pGEX4-NuTPS2814质粒转化BL21感受态细胞，挑取单克隆接种至1 mL含100 mg/L氨苄霉素LB（Luria-Bertani）液体培养基，于37 ℃、220 r/min摇床培养箱中暗培养过夜。随后将种子菌液按照1∶100（V/V）比例接种至15 mL含100 mg/L氨苄霉素LB培养基，于37 ℃、220 r/min摇床培养箱中培养过夜，随后将15 mL菌液转至600 mL含100 mg/L氨苄霉素的LB培养基中，于37 ℃、220 r/min摇床培养箱中暗培养2.5 h至OD₆₀₀为0.5~0.6。加入IPTG至终浓度为0.075 mmol/L，转移至14 ℃、160 r/min摇床培养箱中暗培养8 h。于4 ℃、6 000 r/min离心收集菌体。加入30 mL裂解液（50 mmol/L HEPES，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF）、100 μL溶菌酶（3 mg/mL），重悬沉淀，冰上匀速（50 r/min）孵育1 h。超声破碎细胞（超声3 s，间停3 s，总时间30 min）至菌液清透，菌液于4 ℃、6 000 r/min离心30 min，重复离心1次，取上清液进行后续蛋白纯化。移上清液至平衡后的GST亲和琼脂糖珠，于4 ℃、50 r/min孵育1 h，后于1 000 r/min离心1 min收集琼脂糖珠。采用15 mL裂解液洗涤糖珠3次，于1 000 r/min离心1 min。将洗涤后的琼脂糖珠移至层析柱中，加入5 mL洗脱液（50 mmol/L HEPES，15 mmol/L还原性谷胱甘肽）进行洗脱，依次收集8~10管洗脱蛋白（500 μL/管）。取洗脱蛋白20 μL，加入蛋白上样缓冲液，沸水浴5~10 min，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测蛋白诱导表达情况，用于酶活性测定。

酶促反应，取1 mg/mL GPP 10 μL（Sigma-Aldrich，G6772）、1 mol/L DTT 10 μL、NuTPS2814蛋白100 μL、酶活缓冲液（250 mmol/L HEPES，pH值为8.0，10%（V/V）甘油，100 mmol/L MgCl₂，0.25 mmol/L MnCl₂）1 830 μL，于玻璃离心管中混匀，加入2 mL正己烷，32 ℃水浴反应3 h。涡旋振荡2 min，2 000 r/min离心2 min，取上层正己烷，经无水硫酸钠吸附掉多余水分，随后经0.22 μm有机滤膜过滤后，取300 μL进行气相色谱—质谱（GC-MS）分析（赛默飞气质联用仪GCMS Trace1300+ISQ7000）。进样量为1 μL。色谱条件为60 ℃保温3 min，10 ℃/min升温至280 ℃，保持5 min，氦气流速1 mL/min。质谱条件为离子源温度300 ℃，接口温度为250 ℃，scan模式采集m/z 50~500。

1.2.6 NuTPS2814基因的表达模式分析

利用OD₆₀₀为0.1的青枯病菌GD人工接种荫生烟草茎基部，于接种后0、12、24 h收集叶片并提取总RNA，并反转录为cDNA。根据NuTPS2814基因的编码序列设计特异性引物NuTPS2814-qF（5'-TGGAA

TGTGGGTGAAACCAACA-3'）和NuTPS2814-qR（5'-TCATGCCCTGCTGTTACATCC-3'），以烟草Tob103基因作为内参基因，设计特异性内参引物Actin-qF（5'-ATGAGAGAGTGCATAT

CGAT-3'）和Actin-qR（5'-TTCACTGAAGAAG

GTGTTGAA-3'）。利用实时荧光定量PCR技术检测NuTPS2814基因的表达量。试验设置3次生物学重复和3次技术重复，采用2^-△△Ct方法计算NuTPS2814基因的相对表达量。

1.2.7 NuTPS2814代谢产物的体外抑菌效果分析

NuTPS2814代谢产物的制备。利用1.2.5中提到的原核表达和酶促反应方法，扩大体系制备酶促反应液，酶促结束后，80 ℃水浴10 min终止反应，然后10 000 r/min离心5 min，取上清液作为其代谢产物。

菌液抑菌试验。在20 mL NB液体培养基中分别加入0、100、200、300、400 mg/L NuTPS2814代谢产物，3次重复，随后加入100 μL OD₆₀₀值为0.02的青枯病菌GD，28 ℃摇床中培养，分别在0、12、24 h收集1 mL菌液。利用紫外分光光度计，在600 nm波长下测定菌液OD值，并拍照记录菌液生长情况，确定其最小抑菌浓度和最小致死浓度。

平皿抑菌试验。分别配制含有0、100、200、300、400 mg/L NuTPS2814代谢产物的NB固体培养基，随后加入100 μL OD值为0.02的青枯病菌GD，混匀后涂布NB固体培养基，设置3个重复，28 ℃恒温箱中培养48 h，观察菌落的生长情况并拍照。

抑菌斑直径测定。将OD₆₀₀为0.1的青枯病菌GD均匀涂布在NB固体培养基上，在平板中央放置5 mm厚的滤纸，分别滴加0、100、200、300 mg/L NuTPS2814代谢产物，3个重复，28 ℃恒温箱中培养48 h，测量抑菌斑直径并拍照。

1.2.8 NuTPS2814代谢产物预防烟草青枯病效果分析

烟草品种为易感青枯病的红花大金元，选取三或四叶期幼苗，移栽于直径为9 cm的一次性花盆中，统一条件下栽培管理。接种青枯病菌GD前，每隔3 d在根部浇灌浓度为200 mg/L的NuTPS2814代谢产物5 mL，每个处理10株，3次重复，连续浇灌处理3次，于最后1次处理24 h后接种青枯菌5 mL，接种15 d后统计发病率和病情指数。

发病率=发病烟株数/总烟株数×100%（1）

病情指数=∑（相应发病级别的病株数×发病级别数值)/（最高发病级别数值×调查总烟株数量）×100（2）

1.3 数据分析

采用Excel整理与统计数据，采用t-test进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 NuTPS2814基因的克隆及生物信息学分析

以荫生烟草花蕾cDNA为模板，使用特异性引物对NuTPS2814进行PCR扩增，获得全长为2 595 bp的NuTPS2814基因编码序列（CDS）序列。NuTPS2814基因编码865个氨基酸（等电点为6.02，分子质量为98.71 ku）。将辣椒、番茄中已报道的芳樟醇合成酶与NuTPS2814的氨基酸序列进行多序列比对分析，结果表明（图1），NuTPS2814与芳樟醇合成酶蛋白序列具有较高的相似性，并含有萜类合酶催化活性中心DDxxD和NDIxSxxxE结构域，但不含有叶绿体转运肽序列。以其他野生烟草及栽培烟草种质资源的cDNA为模板，对NuTPS2814基因进行PCR扩增，结果显示（图2），在非洲烟草（WT14）、莲座叶烟草（WT34）、洞生烟草（WT39）、红花大金元（HD）和中烟300（P001）的cDNA中均未扩增到NuTPS2814基因序列，说明NuTPS2814基因可能在荫生烟草中特异性表达。

为分析NuTPS2814与拟南芥萜烯合酶之间的亲缘关系，利用MEGA5软件对NuTPS2814和26个拟南芥萜烯合酶的氨基酸序列进行系统发育进化树分析，结果表明（图3），NuTPS2814与拟南芥芳樟醇合酶AtTPS04聚为同一簇。AtTPS04编码一种香叶基芳樟醇合成酶（GES），该酶可催化生成一种C16同系萜烯类植物挥发性防御物质，推测NuTPS2814可能具有类似的催化功能。

2.2 NuTPS2814的原核表达及酶学功能分析

为分析NuTPS2814的生物学功能，对NuTPS2814进行了原核表达，SDS-PAGE检测结果表明，在分子质量为140 ku附近出现了特异条带，该结果与NuTPS2814-GST融合蛋白的预测分子质量大小一致。以NuTPS2814融合蛋白与底物GPP进行体外反应，结果发现（图4），NuTPS2814催化的代谢主产物与芳樟醇标准品的保留时间一致，表明NuTPS2814能够以GPP为底物合成单萜类化合物芳樟醇。

2.3 NuTPS2814代谢产物对烟草青枯菌的抑制作用分析

利用OD₆₀₀为0.1的青枯病菌GD人工接种荫生烟草茎基部，并于接种后0、12、24 h检测烟草叶片NuTPS2814基因的表达。实时荧光定量PCR检测结果显示（图5），NuTPS2814基因的表达量受青枯菌诱导显著上调表达（P<0.05）。为了分析NuTPS2814代谢产物对烟草青枯病菌是否具有抑制作用，本研究将纯化的NuTPS2814代谢产物添加到烟草青枯病菌GD菌液和固体培养基中，分析其抑菌效果；并通过测量抑菌圈直径进一步分析NuTPS2814代谢产物对烟草青枯病菌GD的抑制效果，菌液抑菌试验结果显示（图5），与对照相比，添加100 mg/L NuTPS2814代谢产物的青枯病菌GD菌液OD₆₀₀值在菌液培养12 h显著降低，随着NuTPS2814代谢产物浓度增加，对青枯病菌GD抑制效果逐渐增加，在添加400 mg/L NuTPS2814代谢产物时，OD₆₀₀值约为0，菌液澄清，达到完全致死浓度。24 h时，与对照相比，添加100 mg/L NuTPS2814代谢产物的青枯病菌GD菌液浑浊度明显降低，随着NuTPS2814代谢产物浓度增加，青枯病菌GD菌液的浑浊度逐渐降低；在添加400 mg/L NuTPS2814代谢产物时，菌液基本澄清。

平皿抑菌试验结果显示（图5），与对照相比，随着NuTPS2814代谢产物浓度增加，NB固体培养基上的青枯病菌菌落数量显著降低，在添加400 mg/L NuTPS2814代谢产物时，菌落数量基本为0。

抑菌圈试验结果显示（图5），与对照相比，随着外源NuTPS2814代谢产物浓度增加，抑菌圈直径显著增加，说明NuTPS2814代谢产物对烟草青枯病菌GD的生长具有显著抑制作用，且其抑制强度随浓度的升高而增强。

2.4 NuTPS2814代谢产物对烟草青枯菌的防治效果

从表1可以看出，NuTPS2814代谢产物处理后的烟草青枯病发病率约为53.33%，病情指数为28.67，防治效果为57.01%；而未添加NuTPS2814代谢产物（CK）的烟草青枯病的发病率为96.67%，病情指数为66.67。与CK相比，NuTPS2814代谢产物处理后烟苗发病明显减轻，发病程度降低，处理间差异显著（P<0.05）。说明NuTPS2814代谢产物有效地增强了烟草对青枯病的抗性。

3 结论与讨论

本研究从荫生烟草中成功克隆获得单萜合酶基因NuTPS2814，明确了其在烟草抗青枯病防御中的作用，为野生烟草优异基因资源挖掘和青枯病绿色防控提供新的理论支撑与实践依据。

萜类合酶（TPS）是植物萜类次生代谢物合成的关键限速酶，其保守结构域的差异决定了催化功能的特异性与底物偏好性，是基因功能分类和进化地位判定的核心依据^[20-21]。本研究序列分析结果显示，NuTPS2814蛋白含有植物萜类合酶高度保守的DDxxD、NDIxSxxxE等2个催化活性基序，其中，DDxxD基序主要负责结合Mg²⁺、Mn²⁺等二价金属离子，介导底物香叶基焦磷酸（GPP）的焦磷酸基团定位，是触发萜类碳骨架环化与重排反应的核心结构；NDIxSxxxE基序作为I类萜类合酶的标志性保守序列，可稳定催化中心的空间构象，进一步调控底物结合的专一性^[22-24]。

NuTPS2814缺少多数单萜合酶中常见的RRx8R基序，该基序通常与叶绿体转运肽协同作用，参与酶蛋白向质体的转运^[25]，这与本研究中NuTPS2814无叶绿体转运肽的结构特征高度契合，推测其可能定位于细胞质中，通过非经典的催化途径完成芳樟醇合成。这一推测与拟南芥AtTPS04的特性一致，AtTPS04同样不含RRx8R基序和叶绿体转运肽，定位于细胞质并催化GGPP生成挥发性单萜类防御物质^[20,26]。系统发育进化分析结果进一步证实，NuTPS2814与AtTPS04聚为同一进化分支，二者氨基酸序列同源性较高，结合催化活性基序的一致性，进一步佐证了NuTPS2814可能具有与AtTPS04相似的催化功能和防御相关的生物学特性。

NuTPS2814具有催化特性。以GPP为底物的体外酶促反应结合GC-MS检测结果显示，NuTPS2814可特异性催化GPP生成芳樟醇，产物的保留时间和质谱特征与芳樟醇标准品完全匹配，进一步证实了该蛋白的催化功能特异性，为后续该蛋白的体外高效表达和芳樟醇的规模化制备提供了技术支撑。

芳樟醇不仅是植物与传粉昆虫、植食性昆虫及其天敌之间信息交流的关键化学信号，且在植物对病原体和非生物胁迫的防御响应中发挥着重要作用^[27-29]。芳樟醇能够引起土壤中有益微生物菌群的富集，进一步刺激植物中水杨酸的合成并激活其信号通路，使植物防御能力显著增强。外源施加少量芳樟醇后，作物根结线虫病、真菌病害、病毒病害的发生率显著下降。表明芳樟醇不仅是作物的天然免疫补剂，而且也是调控土壤健康和微生物功能的关键信号分子^[30]。本研究发现，NuTPS2814对烟草青枯病菌GD具有显著抑制效果，且这种抑制作用与其浓度呈正相关，说明NuTPS2814基因可能参与了烟草青枯病菌的抗性防御过程。

青枯病是烟草生产中危害最严重的土传细菌性病害，传统化学防治手段易造成土壤污染和病原菌抗药性，挖掘植物内源抗病基因、解析天然抑菌物质的作用机制，是实现青枯病绿色防控的关键方向。本研究证实，NuTPS2814的代谢产物芳樟醇对烟草青枯病菌GD具有显著的抑制作用，且抑菌效果随浓度的升高而增加，进一步证实了芳樟醇作为天然植物源抑菌物质的应用潜力。NuTPS2814可作为烟草抗病分子育种的优异候选基因，通过基因工程技术构建超表达载体，转化主栽栽培烟草品种，培育高抗青枯病的烟草新种质。此外，本研究明确了芳樟醇对青枯病菌的高效抑菌活性，可为开发植物源生物农药、青枯病绿色防控制剂提供核心功能物质，减少化学农药的使用，实现烟草病害的绿色、生态、可持续防控。

本研究在烟草中克隆了1个单萜合酶基因NuTPS2814，其编码蛋白序列与拟南芥AtTPS04具有较高同源性和相似的结构域，属于典型的I类单萜合酶。NuTPS2814能够以GPP为底物合成单萜类化合物芳樟醇，NuTPS2814的代谢产物可以显著增强其苗期青枯病抗性，可能在烟草对青枯病菌的抗性防御过程中发挥重要作用。荫生烟草NuTPS2814基因的挖掘鉴定，为后续深入研究芳樟醇在植物青枯病抗性中的分子调控机制及青枯病防御奠定基础，同时拓宽了野生烟草种质资源在抗青枯病研究方面的应用，对优异种质资源挖掘利用具有重要意义。

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基金资助

黑龙江烟草工业有限责任公司科技项目(202400000034006)

中国烟草总公司烟草基因组重大专项（110202201002（JY-02）,110202401005（JY-05））