玫瑰（
Rosa rugosa Thunb.）是蔷薇科蔷薇属植物，具有极高的经济价值和生态价值
[1-2]。作为全球最重要的观赏花卉之一，玫瑰广泛应用于切花、盆栽、园林绿化及精油提取等领域。此外，玫瑰花瓣富含多酚类、黄酮类等活性成分，在食品、化妆品及医药行业具有广泛应用。新疆和田地区作为国内四大玫瑰产区（山东、甘肃、云南、新疆）之一，位于中国极端干旱的塔克拉玛干沙漠南缘。该地区因其自然地理环境以及水土光热条件的独特性，为玫瑰的生长和发育提供了理想的条件，拥有超过2 000 a的玫瑰栽培历史
[3-5]。然而，随着玫瑰的大规模种植，其生长发育过程易受到病毒的威胁。这些病毒病害通常影响叶片、根部、花朵以及枝干。尽管病毒性病害很少直接导致严重后果，却显著影响玫瑰的产量和品质
[6]。病毒病害已经成为制约玫瑰产业发展的主要因素之一。
植物病毒是一种极其微小的、由蛋白质外壳和遗传物质（多数为RNA，少数为DNA）构成的非细胞型分子生物，植株感染后，直接表现出系统性变色、坏死、畸形的症状，导致作物的产量和品质下降。菜豆普通花叶病毒（Bean common mosaic virus，BCMV）在世界范围内分布广泛并可造成菜豆严重减产
[7]，大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus，SMV）在大豆生产中会造成品质的严重下降
[8]，地黄灼烧病毒（Rehmannia torradovirus virus，ReTV）严重危害地黄田间生长
[9]，辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus，PMMoV）严重威胁辣椒等茄科园艺作物的生产安全
[10]。近年来，全球范围内已报道多种侵染玫瑰的病毒，如月季潜隐病毒1（Rose cryptic virus 1，RCV1）、小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）和蔷薇黄脉病毒（Rose yellow vein virus，RYVV）
[11-12]。RCV1属于双生病毒科，基因组为单链RNA，编码多个功能蛋白，其中，外壳蛋白（CP）在病毒粒子组装和宿主识别中起关键作用。ZYMV是一种马铃薯Y病毒科成员，主要通过蚜虫传播，其基因组编码一个大分子多聚蛋白，经蛋白酶切割后形成多个功能蛋白。RYVV则属于花椰菜花叶病毒科，基因组结构及功能尚未完全解析，侵染玫瑰后可导致玫瑰叶片黄脉、畸形等症状。RCV1、ZYMV、RYVV等植物病毒广泛分布，且严重威胁新疆和田地区玫瑰产业的发展。目前，RCV1、ZYMV、RYVV等玫瑰病毒病的防治主要依赖健康种苗、化学防治及农业管理措施，但由于病毒传播途径多样（如介体传播、嫁接传播等），防治效果有限
[13]。因此，开展玫瑰病毒的分子检测及遗传多样性研究，对制定精准防控策略具有重要意义。
本研究通过对新疆和田地区玫瑰病毒病的田间调查，结合RT-PCR检测及生物信息学分析，明确了RCV1、ZYMV和RYVV的流行情况及其遗传多样性，旨在为该地区玫瑰病毒病的防控提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 试验材料
于2024年5月在新疆和田地区和田县及于田县玫瑰主要种植区进行了田间调查，采集具有花叶、黄化、褪绿等疑似玫瑰病毒病叶片样品共计62份。标记采集时间、地点、症状后置于冰盒中，带回实验室保存于-80 ℃冰箱，用于核酸提取及后续试验。
1.2 试验方法
1.2.1 病毒鉴定引物设计
结合疑似玫瑰病毒病植株的田间症状及已报道相关文献
[5]，本研究合成了10条特异性引物（
表1）用于病毒样品的分子检测与鉴定。引物由有康生物（新疆乌鲁木齐）有限公司合成。
1.2.2 玫瑰叶片总RNA提取及cDNA合成
称取0.1 g玫瑰叶片样品于离心管中，加入液氮充分研磨成粉末，按照RNA提取试剂盒（天根生物技术有限公司）的操作说明进行植物总RNA提取，并采用琼脂糖凝胶电泳、Nanodrop、Qubit和Agilent 2100检测RNA完整性和纯度。以提取的总RNA为模板进行反转录合成cDNA，反应体系和步骤按照通用型RT-PCR试剂盒说明书（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）进行。
1.2.3 玫瑰病毒样品的RT-PCR鉴定
以反转录合成的cDNA模板进行RT-PCR扩增。扩增体系为（20 μL）：2×
Taq Master Mix（Dye Plus）10 μL，正反向特异性引物各0.5 μL（10 mmol/L），cDNA 2 μL，ddH
2O 7 μL。扩增反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30ｓ，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34个循环；72 ℃延伸 10 min，-20 ℃保存。RT-PCR扩增结束后，取5 μL RT-PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。将扩增的特异性片段进行胶回收并连接pGEM-T（Promega）载体，然后经过测序获得病毒样品的基因序列。利用NCBI核酸数据库（
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）对获得病毒样品序列进行分析，进而根据相似性确定病毒种类。
1.2.4 遗传多样性分析
通过NCBI网站功能基因序列的Blast比对，获得22条与本研究相似序列（来自不同的国家和寄主），使用MEGA 7.0软件对这23条序列进行遗传多样性分析
[12-14]。采用General Time Reversible 模型和Construct/Test Maximum Likelihood Tree方法构建系统发育树，自展值为1 000，去掉低于50%的进化树分支。
1.3 数据分析
采用Microsoft Excel 2010对收集的病毒样品信息及病毒检测数据进行统计分析，并计算不同地区玫瑰病毒检出率；利用R 4.4.2软件进行制图，并采用Adobe lIIustrator 2021对图形进行修改。
2 结果与分析
2.1 和田玫瑰病毒病的田间调查
对新疆和田玫瑰产区病毒病发生情况田间调查发现，玫瑰病毒症状主要表现为叶缘呈现不规则的黄色病斑，严重时干枯坏死；部分叶片小而皱缩、叶缘轻微上卷，轻者褪绿变黄，严重时叶片发红；叶脉褪绿黄化，生长受阻，植株矮化（
图1）。玫瑰病毒病大田发病较轻，发病率为5%~15%。本研究对田间玫瑰的症状进行了初步归类，然后再通过分子生物学进行进一步验证。
2.2 玫瑰病毒病的分子鉴定
对采自和田地区的62份玫瑰疑似病株样品进行总RNA提取，凝胶电泳结果显示（
图2-A），总RNA中的28S rRNA和18S rRNA条带清晰，表明RNA完整性较好可用于后续试验。以cDNA为模板，进行RT-PCR扩增，结果显示（
图2-B），62份玫瑰疑似病株样品中仅检测出3种病毒，分别为RCV1、RYVV、ZYMV。其中，55个样品RT-PCR扩增条带大小为762 bp，与RCV1鉴定引物的目的片段大小一致。进一步对扩增产物进行了测序鉴定，将获得的序列在NCBI中比对后发现，序列与RCV1的序列高度相似，表明该病毒为RCV1。9个玫瑰疑似病株样品RT-PCR扩增条带大小为599 bp（
图2-C），经测序和序列比对后发现，序列与ZYMV的序列高度同源，表明该病毒为ZYMV。33个玫瑰疑似病株样品RT-PCR扩增条带大小为465 bp（
图2-D），经测序和序列比对后发现，序列与RYVV的序列高度同源，表明该病毒为RYVV。
62份疑似病毒样品中，有56份病毒检测结果呈阳性，检出率为90.32%（
图3）。
由
图3可知，单个病毒侵染的样本有21个，2种及以上病毒复合侵染的样本有35个。复合侵染类型为2种病毒复合侵染（29个）和3种病毒复合侵染（6个）。其中，ZYMV和RCV1复合侵染的样品最多，为26个，RYVV和RCV1复合侵染的样品仅有3个。
2.3 分离物RCV1-1、RYVV-1和ZYMV-1的遗传多样性
为了进一步了解RCV1、RYVV和ZYMV遗传多样性，借助分子生物学技术分别克隆了RCV1、RYVV和ZYMV的部分基因序列RCV1-1、RYVV-1、ZYMV-1。并利用这些基因序列对RCV1、RYVV和ZYMV不同分离物的遗传多样性进行了分析（
图4）。对来自NCBI数据库19个ZYMV分离物序列和本研究分离的ZYMV-1分离物序列进行了系统进化分析，结果显示（
图4），20个ZYMV分离物被分成2个组。其中，组1包含中国分离物（OQ136664、OQ136665、MK033874、PV007922、PV007923、AJ515911、KX421104）、新疆分离物ZYMV-1，韩国分离物（AY278998、AY278999、AJ429071）和法国分离物（KX247947、MW449264）等13个ZYMV分离物；组2包含美国分离物（JN192414、JN192426、JN192410）、加拿大分离物OK558793、澳大利亚分离物KY225547、印度分离物MG967620和约旦分离物PV167215等7个ZYMV分离物。
来自NCBI数据库的6个RYVV分离物和本研究分离的RYVV-1分离物被分成2个组（
图4）。其中，组1包含6个分离物，分别为新西兰分离物（JX887423、JX430789、JX887424、JX430788），土耳其分离物（PQ298785），新疆分离物RYVV-1；组2包含3个分离物，分别为土耳其分离物（PQ298786、PQ298787）和美国分离物NC_020999。
来自NCBI数据库的6个RCV1分离物和本研究分离的RCV1分离物被分成2个组（
图4）。其中，组1包含1个分离物MK075823，该分离物分离于英国的玫瑰；组2包含加拿大分离物（KM598760、MK075828），美国分离物（EU024676、EU413668和NC_010348），新疆分离物（RCV1-1）等6个。
3 结论与讨论
和田地区地处新疆维吾尔自治区最南端，位于欧亚大陆腹地的典型内陆干旱区，是我国重要的玫瑰规模化种植基地
[15]。和田地区独特的光热资源与显著昼夜温差为玫瑰养分积累和品质形成提供了理想条件，但病毒病的侵染严重制约了产业健康发展。病毒侵染可导致玫瑰器官畸形、产量锐减及次生代谢物合成受阻，同时削弱植株抗逆性，加剧病原菌与虫害的连锁危害
[16]。因此，精准鉴定和田地区玫瑰主要种植地流行病毒种类是构建针对性防控体系的前提。本研究采集了和田地区玫瑰主要种植基地玫瑰疑似病样62份，采用分子检测技术鉴定出3种主要病毒，月季潜隐病毒1、蔷薇黄脉病毒和小西葫芦黄花叶病毒。检测结果表明，RCV1的检出率最高，达到了88.7%，是感染和田地区玫瑰的优势病原，在田间呈广泛流行态势，在和田地区玫瑰种植中普遍存在且对玫瑰的危害最为严重。ZYMV的检出率也较高，为53.2%，说明该病毒在和田地区玫瑰种植中同样具有广泛的分布。RYVV的检出率相对较低，但也不能忽视其可能带来的危害，可能存在与其他病毒的协同效益。值得注意的是，56%的样本存在2种及以上病毒复合侵染，凸显混合感染常态化对综合防控策略制定的特殊挑战。
RCV1隶属于双链RNA病毒科（Partitiviridae）隐性病毒属（
Cryptic virus），具有潜伏侵染特性，可通过系统侵染长期定殖于玫瑰植株维管组织
[17-18]。RCV1潜伏期长且早期症状隐蔽，发病后则表现为叶片斑驳黄化、不对称畸形，并伴随植株矮化、花器官发育异常及产量下降（减产率达22%~68%）等典型症状
[19]，显著抑制玫瑰经济性状与次生代谢物积累。RCV1的宿主内增殖与传播效率呈现明显环境依赖性。在温度方面，该病毒在15~25 ℃的环境温度下较为活跃，能够较好地在宿主植物体内进行复制和传播。湿度也是影响RCV1生存的重要因素之一。该病毒在相对湿度为60%~80%的环境中生存状况良好。适宜的湿度条件有助于维持病毒粒子的稳定性，同时也有利于病毒通过空气、水滴等媒介进行传播。在高湿度环境下，如湿度超过90%，植物表面容易形成水膜，这为病毒的传播提供了便利条件，病毒可以借助水膜更快速地接触并侵入宿主细胞。相反，当环境湿度低于40%时，病毒的传播能力会受到限制，因为干燥的环境不利于病毒在空气中的悬浮和传播，同时也会影响病毒与宿主细胞的吸附过程。在传播途径上，嫁接传播中接穗与砧木带毒会引发病毒扩散，线虫、蚜虫等媒介生物在取食过程中也能传播病毒。发病规律与环境因素紧密相关，温度、光照、土壤条件等均会影响发病程度，且植株在幼苗期、营养生长期、花期等不同生长阶段对病毒的易感性和发病症状各异。
RYVV隶属双链DNA病毒科花椰菜花叶病毒科（Caulimoviridae）蔷薇杆状DNA病毒属（
Rosadnavirus）
[14]，其病毒粒子呈非包被的杆状结构（长300~350 nm，直径约45 nm），基因组为环状双链DNA。该病毒可系统侵染蔷薇属植物，感染RYVV的玫瑰植株，常见症状为叶片的叶脉变黄，有时也会伴随叶片顶端褪绿斑驳，不同品种感染后的症状存在差异
[20]，例如有的品种感染后出现叶片卷曲和斑驳。也有研究表明，这些症状在未感染RYVV植株上也可能出现，说明并非所有症状都与RYVV感染直接相关。此病毒主要通过嫁接传播，不能通过蚜虫或其他机械方式传播
[21]。
小西葫芦黄花叶病毒是一种对葫芦科作物危害较大的植物病毒，属于马铃薯Y病毒，主要由桃蚜、棉蚜以及其他多种蚜虫以非持久性方式传毒，蚜虫口针取食发病叶片后，可立即通过取食其他叶片传播病毒，没有潜伏期，但传染能力会随传播次数增加迅速下降
[22]。同时也能通过机械接触传播，例如农事操作过程中，发病植株的液汁会存留在手、衣服和农具上，当对健康植株进行农事操作时即可传播。植株感染后病叶出现花叶、斑驳、褪绿黄化、卷曲畸形、新叶变小等症状；严重时也会造成植株矮化、新梢坏死，甚至凋萎死亡，严重影响果实的商品价值
[23]。
本研究深入分析了和田地区玫瑰主要种植地区的病毒侵染类型，为制定具有针对性的防控策略提供了依据。例如，鉴于和田地区玫瑰种植区内RCV1的高检出率，研发特异性抗病品种或抗病毒剂将有助于减轻其对玫瑰的损害。ZYMV的多蚜虫介体传播，可利用“防虫网”物理手段进行阻隔
[24]。此外，本研究揭示了不同病毒在玫瑰植株上的症状表现存在差异。在田间调查时，应观察玫瑰植株的症状表现，并结合实验室检测结果准确识别病毒种类，以便及时采取有效的防控措施。
未检出的病毒样本疑似生理性病害。造成生理性病害的原因较多，根据采集样本前期的生产情况，推测这些疑似病毒病的生理性病害特征可能是由田间管理不当、营养不均衡、水分供应不足或过量、环境因素如高温或低温胁迫等导致的。这些因素可能单独或共同作用，影响玫瑰正常生理机能，从而表现出类似病毒病的症状。因此，在玫瑰种植过程中，除了关注病毒病的防控外，还应加强田间管理，优化水肥供应，合理调控环境条件，以提高玫瑰抗逆性，减少生理性病害发生。同时，对于疑似生理性病害的样本，应进一步开展研究，明确其致病原因，为制定科学防控策略提供依据。
综上，本研究通过系统的田间调查和鉴定，明确了和田地区玫瑰病毒病的主要病毒种类，为后续的防控工作提供了重要参考。未来，将继续加强对和田地区玫瑰病毒病的研究，探索更为有效的防控策略，以保障玫瑰的安全生产。
新疆维吾尔自治区重点研发计划(2021B02005-1)
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