复合生防菌剂对烟草黑胫病的防治效果和根际土壤微生物群落结构的影响

The Control Effects of Compound Biological Control Agents in Preventing Tobacco Black Shank and Their Impact on Soil Microbial Community Structure

摘要

为筛选烟草黑胫病绿色防控的生防资源，明确河南省农业科学院烟草研究所自主研制的多黏类芽孢杆菌—绿色木霉复合生防菌剂的防病效果及根际微生态调控机制，以元泰丰土壤生态调理剂、阿耶早微生物菌剂、枯草芽孢杆菌WP为对照，通过盆栽与田间小区试验评价各微生物菌剂对烟草黑胫病的防控效果，并采用高通量测序技术分析其对烟株根际土壤微生物群落结构的影响。结果表明，4种微生物制剂均可极显著降低烟草黑胫病的发病率与病情指数；盆栽条件下复合生防菌剂防治效果达88.97%，极显著高于元泰丰土壤生态调理剂（66.75%），与其余2种微生物制剂防治效果间无显著差异；田间条件下，第2次调查结果表明，复合生防菌剂的防治效果显著高于元泰丰土壤生态调理剂和枯草芽孢杆菌WP的防治效果，且2次防治效果均高于70.00%，复合生防菌剂的防治效果更稳定。微生物测序结果表明，复合生防菌剂可降低根际真菌群落多样性与总丰度，提升细菌群落丰富度，通过下调担子菌门、毛霉门致病相关真菌丰度，上调绿弯菌门、酸杆菌门等有益细菌门类占比，优化根际微生态。综上，该复合生防菌剂防病效果突出且稳定，可作为烟草黑胫病绿色防控的优选生防制剂推广应用。

Abstract

To screen for green biological control resources against tobacco black shank disease and clarify the disease suppression efficacy and rhizosphere microecological regulation mechanism of the Bacillus polymyxa-Trichoderma viride compound biocontrol agent independently developed by the Tobacco Research Institute of Henan Academy of Agricultural Sciences, in this study, microbial agents including Yuantaifeng soil ecological regulator, Ayezao microbial agent, and Bacillussubtilis were used as controls. Through pot and field plot experiments, the disease control effects of various microbial agents against tobacco black shank disease were evaluated, and high-throughput sequencing technology was employed to analyze their impact on the microbial community structure in the rhizosphere soil of tobacco plants. The results showed that all four microbial agents significantly reduced the incidence rate and disease index of tobacco black shank disease. Under pot conditions, the compound biocontrol agent achieved an control effect of 88.97%, significantly higher than that of the Yuantaifeng soil ecological regulator(66.75%), with no significant difference compared to the other two microbial agents. Under field conditions, the second investigation results showed that the contorl effect of the compound biocontrol agent was significantly higher than that of Yuantaifeng soil ecological conditioner and Bacillus subtilis, and both contorl effects were higher than 70.00%, and the contorl effect of the compound biocontrol agent was more stable. Microbial sequencing revealed that the compound biocontrol agent reduced the diversity and total abundance of fungal communities in the rhizosphere while increasing bacterial community richness. By downregulating the abundance of pathogenic fungi such as Basidiomycota and Mucoromycota and upregulating the proportion of beneficial bacterial phyla such as Chloroflexi and Acidobacteria, it optimized the rhizosphere microecology. In summary, this compound biocontrol agent exhibited outstanding and stable disease suppression efficacy and could be recommended as a preferred microbial agent for green biological control of tobacco black shank disease.

Graphical abstract

关键词

烟草 / 复合生防菌剂 / 高通量技术 / 防治效果 / 黑胫病

Key words

tobacco / compound biocontrol agent / high-throughput sequencing techndogy / control efficacy / black shank disease

烟草黑胫病是由烟草疫霉（Phytophthora parasitica var. Nicotianae tucker）引起的毁灭性病害，是我国烟草的主要病害，每年造成烟草严重的经济损失^[1-3]。该病害的有效防治越来越成为学者和植烟人员关注的焦点^[4-5]。一直以来，烟草黑胫病防治的最主要的措施是化学防治，大量使用化学药剂使病菌逐渐产生抗性，导致防治效果降低。另外，化学农药的使用次数及使用量的逐渐加大，不仅严重污染了土壤环境，而且增加了烟叶化学农药残留的风险^[6-9]。近年来，生物菌剂、生物抗菌素及天然植物源农药在农业生产中得到广泛的研究与应用，烟草绿色防控逐渐成为烟草病虫害防控的重要手段，生物农药的筛选与应用具有重要的现实意义^[10]。

根际土壤微生物影响烟草黑胫病的发生，土壤中菌群数量的变化会直接影响病害发生率^[11]。芽孢杆菌（Bacillus）环境适应能力强，增殖速度快，可以使植物分泌促生物质、激发诱导抗性，抵御病原菌的入侵来防治植物病害^[12]。HAN等^[13]和师超等^[14]均研究发现，枯草芽孢杆菌对烤烟黑胫病的防治效果明显。吴寿明等^[15]研究发现，随着烟草黑胫病发病程度的增加，变形杆菌门、放线菌门、酸杆菌门、绿弯菌门群落丰度降低。李祝等^[16]研究发现，在烟草苗期蜡状芽孢杆菌1205对黑胫病防治效果较好。杨珍福等^[17]研究发现，铜绿假单胞菌YN201458对烟草黑胫病的防治效果可达76.07%。王静等^[18]研究发现，链霉菌F8对烟草黑胫病的防治效果可达70.30%。龙春瑞等^[19]研究发现，木霉菌和青霉菌灭活菌丝体复合物可以有效防治烟草黑胫病。黄建等^[20]研究发现，寡雄腐霉菌对烟草黑胫病的防治效果显著。王耀晨^[21]研究发现，花椒籽—生物炭—枯草芽孢杆菌生防菌肥能够降低烟草黑胫病发病程度，减少土壤中病原菌数量。王爱萍等^[22]研究发现，麦田土壤子囊菌门和担子菌门与土壤有效磷呈正相关。戴瑞卿等^[23]研究发现，健康草莓根际土壤的子囊菌门和担子菌门、被孢霉属相对丰度均较低。贾海江等^[24]研究发现，生物炭菌剂通过改变根际土壤微生物区系的变化来提高烟草黑胫病的防治效果。伍超等^[25]研究发现，在使用67%唑醚·丙森锌和35%喹啉铜·四霉素处理10 d后使用木霉复合菌剂，可以降低烟草黑胫病致病菌属的丰富度，增加有益菌属的丰富度，从而实现烟草黑胫病的高效防控。

本研究通过盆栽试验和田间药效试验验证复合生防菌剂以及微生物菌剂对烟草黑胫病的防治效果，并研究其对烟株根际土壤微生物群落多样性和丰度的影响，以期为有效防治烟草黑胫病提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）由烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室分离保存。

1.1.2 供试微生物菌剂

元泰丰土壤生态调理剂（有益活性菌≥2.0×10⁹个/mL，煤泥、褐煤为主要原料）购自元泰丰（包头）生物科技发展有限公司；阿耶早微生物菌剂（有益活性菌≥2.0×10⁹个/mL，主要成分是阿氏芽孢杆菌）购自河北萌帮水溶肥料股份有限公司；复合生防菌剂（V_{多黏类芽孢杆菌}∶V_绿色木霉=1∶1发酵液，其中多黏类芽孢杆菌发酵液活菌量为1.2×10⁹ cfu/mL，绿色木霉发酵液孢子量为1.4×10⁸个/mL）为河南省农业科学院烟草研究所自主筛选并发酵制备；枯草芽孢杆菌可湿性粉剂（100亿个/g）购自陕西恒田生物农业有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 盆栽试验

试验设置4个处理：元泰丰土壤生态调理剂25 mL/株，阿耶早微生物菌剂3.3 mL/株，复合生防菌剂0.4 mL/株，枯草芽孢杆菌0.2 g/株；同时以清水为对照。重复3次，每个重复4株烟苗。烟苗移栽后，每盆接入烟草黑胫病病原菌1 mL于烟株根茎部，12 h后用相应的微生物制剂进行灌根处理，10 d后再次灌根。

1.2.2 田间试验

试验在许昌市河南省农业科学院烟草研究所黑胫病病圃地进行。前茬作物为烟草，3月下旬整地起垄，5月初移栽，烟草品种为中烟100，株行距为0.5 m×1.2 m。土壤肥力中等，灌溉方便，耕作精细，管理同常规烟叶生产。

试验设置5个处理，同1.2.1，3次重复，每小区40株，15个小区随机排列。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 烟草黑胫病调查

每天观察烟苗的发病情况，直至对照处理开始发病时，按照国家标准GB/T 23222—2008《烟草病虫害分级及调查方法》^[26]调查各处理烟株烟草黑胫病的发病情况，直至病情稳定，计算发病率、病情指数和防治效果。

发病率=发病株数/调查总株数×100%（1）

病情指数=（Σ（各级病株×相对极值））/（调查总株数×9）×100（2）

防治效果=（清水病情指数－处理施药后病情指数）/清水病情指数×100%（3）

1.3.2 烟草根际土壤收集方法

在烟草黑胫病发病稳定时，每处理选取5株烟，采用抖根法^[27]收集烟株根际土壤，混匀后用无菌离心管盛装，置于干冰中，带回实验室-80 ℃保存，在上海派森诺生物科技股份有限公司进行扩增子测序，分析4种微生物制剂对烟株根际土壤微生物群落结构的影响。

1.4 数据分析

用Excel 2007软件对调查的数据进行统计，用SPSS 22.0软件中的邓肯（Duncan）新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 盆栽试验中微生物制剂对烟草黑胫病的防治效果

从表1可以看出，4种微生物制剂的发病率和病情指数极显著低于对照（P<0.01），防治效果极显著高于对照（P<0.01）；复合生防菌剂的病情指数极显著低于元泰丰土壤生态调理剂（P<0.01），其对烟草黑胫病的防治效果极显著高于元泰丰土壤生态调理剂（P<0.01），与阿耶早微生物菌剂和枯草芽孢杆菌WP发病率、病情指数和防治效果没有显著差异，但其防治效果略高于2种微生物菌剂，说明复合生防菌剂可以很好地防治烟草黑胫病。

2.2 田间试验微生物制剂对烟草黑胫病的防治效果

从表2可以看出，6月30日和7月15日的调查结果表明，4种微生物制剂的发病率和病情指数极显著低于对照（P<0.01），防治效果极显著高于对照（P<0.01）。复合生防菌剂在6月30日的防治效果与其他3种微生物菌剂的防治效果没有显著差异，在7月15日的防治效果显著高于元泰丰土壤调理剂和枯草芽孢杆菌WP（P<0.05），与阿耶早微生物菌剂没有显著差异，其防治效果略高于阿耶早微生物菌剂，说明复合生防菌剂可以很好地防治烟草黑胫病。

2.3 微生物制剂对烟草根际土壤微生物多样性的影响

各处理的平均覆盖值均为1.00，表明真菌群落覆盖度高。复合生防菌剂、阿耶早微生物菌剂和枯草芽孢杆菌WP施用后Shannon指数和Chao1指数较对照降低，表明烟株根际土壤微生物真菌群落多样性和群落丰富度降低，4种微生物制剂施用后Pielou's evenness指数变化不大，说明烟株根际土壤微生物真菌群落均匀度大致相同（表3）。进一步分析真菌群落数的变化，发现真菌群落数在各分类水平上均低于对照（表4），可见复合生防菌剂对土壤根际土壤真菌的影响和枯草芽孢杆菌WP均呈现广谱的丰富度下降，整体影响模式一致。

各处理的平均覆盖值均为1.00，表明细菌群落覆盖度高。复合生防菌剂使用后Shannon指数和Chao1指数较对照升高，表明烟株根际土壤微生物细菌群落多样性和群落丰富度升高，4种微生物制剂施用后Pielou's evenness指数变化不大，说明烟株根际土壤微生物细菌群落均匀度大致相同（表5）。进一步分析各处理细菌群落数的变化，发现细菌群落数在各分类水平上基本均低于对照（表6），可见复合生防菌剂对土壤根际细菌的影响和其他3种微生物制剂相似。

2.4 不同微生物制剂对土壤微生物丰度的影响

复合生防菌剂处理后烟株根际土壤微生物真菌优势菌群组成和其他处理类似（表7）。在门水平上，优势菌群依次均为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、毛霉门（Mucoromycota）。复合生防菌剂处理后子囊菌门占比较对照升高9.69%，担子菌门和毛霉菌门占比较对照分别降低18.75%和79.72%。复合生防菌剂处理后子囊菌门占比高于其他3种微生物菌剂；阿耶早微生物菌剂、复合生防菌剂和枯草芽孢杆菌WP处理后担子菌门低于元泰丰土壤生态调理剂；4种微生物制剂处理后毛霉菌门占比较对照均降低，且降幅明显。在属水平上，4种微生物制剂处理后烟株根际土壤镰孢菌属（Fusarium）、被孢霉属（Mortierella）和曲霉菌属（Aspergillus）丰度较对照均降低。复合生防菌剂处理后，烟株根际土壤链格孢属真菌（Alternaria）丰度高于其他处理。4种微生物制剂处理后烟株根际土壤真菌属总丰度较对照均降低（图1）。

复合生防菌剂处理后烟株根际土壤微生物细菌优势菌群组成和其他处理类似（表8）。在门水平上，优势菌群依次均为放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）、芽单孢菌门（Gemmatimonadetes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）。复合生防菌剂处理后放线菌门、变形菌门和拟杆菌门较对照分别降低2.69%、28.59%和42.90%，绿弯菌门、酸杆菌门和芽单胞菌门较对照分别升高86.21%、62.72%和101.33%，与阿耶早微生物菌剂处理后土壤微生物细菌优势菌群占比变化一致。在属水平上，经4种微生物制剂处理后烟株根际土壤细菌属总丰度较对照均增加（图2）。

3 结论与讨论

本研究表明，复合生防菌剂对烟草黑胫病具有很好的防治效果。刘畅等^[28]研究发现，假单胞杆菌与绿色木霉发酵液复配能够降低烟田根茎类病害的发病率和病情指数。这与本研究结果一致。通过对烟株根际土壤微生物分析发现，复合生防菌剂处理后烟株根际土壤微生物真菌群落多样性和群落丰富度较对照均降低，细菌群落多样性和群落丰富度均升高。烟株土壤根际微生物真菌和细菌群落数在各分类水平上均低于对照。另外，复合生防菌剂处理后烟株根际土壤微生物优势菌群组成和对照以及其他3种微生物菌剂类似，在门水平上，真菌优势菌群依次均为子囊菌门、担子菌门、毛霉门，细菌优势菌群依次均为放线菌门、变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、芽单孢菌门、拟杆菌门。在属水平上，复合生防菌剂和其他3种微生物菌剂处理后烟株根际土壤真菌属总丰度较对照均降低，细菌属总丰度较对照均升高。

土壤微生物在调控植物生长和抗病等方面有非常重要的作用，植物可通过调整根际微生物来缓解生物或非生物胁迫所造成的危害^[29-30]。有益活菌通过改变微生物和酶的活性参与自身的养分转化，其中微生物菌群可以将基肥及土壤中的大量元素释放出来供给植物，与植物根系形成互利共生关系，显著改善有机物质的形成和转化，提高营养物质的可利用性，抑制有害菌群的增长、减少植株死亡率，为烟草良好生长补充养分^[31-32]。千慧敏等^[33]研究发现，铜绿假单胞杆菌对烟草黑胫病和根黑腐病有较好的防治效果，是具有生防潜力的菌株。复合生防菌剂处理后与其结果一致，另外，本研究表明，烟株根际土壤真菌属总丰度较对照降低，细菌属总丰度较对照增加，推测其防病机制可能是通过降低烟株根际土壤中有害真菌的相对丰度的同时提高有益细菌属的相对丰度。李奇等^[34]研究证明，土壤调理剂中的矿物质能增加担子菌门的相对丰度，降低子囊菌门的相对丰度，进而改善土壤微域环境。本研究使用的元泰丰土壤生态调理剂是以煤泥、褐煤等矿物质为主要原料，施用后烟株根际土壤担子菌门的相对丰度较对照升高，子囊菌门的相对丰度较对照降低与其结果相同。本试验使用的阿耶早微生物菌剂中的有效成分为阿氏芽孢杆菌，其铁载体活性、溶磷量和解钾量较高，具有重金属抗性，可以有效促进植株生长发育^[35]。赵志祥等^[36]研究表明，枯草芽孢杆菌Ya-1改变了接种病原菌辣椒根际真菌群落多样性和结构，降低了真菌群落的复杂度和根际土壤中病原菌的丰度。本研究使用的枯草芽孢杆菌WP同样改变了烟株根际土壤真菌微生物群落结构，降低了微生物群落的复杂度，从而对烟草黑胫病起到了一定的防治作用。

综上所述，复合生防菌剂可以改变烟株根际土壤微生物，进而对烟草黑胫病有良好的防治效果，且能够达到与微生物药剂相同的效果，具有一定的推广应用价值。

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基金资助

河南省烟草公司科技项目(2023410000240021)

河南省农业科学院科技创新团队(2025TD42)