微生物菌剂与甲霜·霜霉威复配对烟草黑胫病的防治效果

The Control Effect of Microbial Inoculum Combined with Metalaxyl Propamocarb on Tobacco Black Shank

摘要

为了探究微生物菌剂与化学药剂联合防控烟草黑胫病的效果，采用菌丝生长速率法分别测定了微生物菌剂GKZ和化学药剂25%甲霜·霜霉威WP对烟草黑胫病菌的室内毒力，利用含药平板法测定二者的生物相容性，并通过盆栽和大田试验分别测定微生物菌剂GKZ、25%甲霜·霜霉威WP和复配剂（V_GKZ∶V_{25%甲霜·霜霉威}=1∶1）对烟草黑胫病的防治效果。室内毒力测定结果显示，微生物菌剂GKZ对烟草黑胫病菌具有较好的抑制效果，其EC₅₀为1.31×10⁴ cfu/mL，25%甲霜·霜霉威WP对烟草黑胫病菌的EC₅₀为0.87 mg/L。相容性试验结果表明，0.87 mg/L的25%甲霜·霜霉威WP对微生物菌剂中的菌株生长无显著抑制作用。盆栽试验结果表明，复配剂处理对烟草黑胫病的防治效果最高（60.18%），显著高于微生物菌剂GKZ（38.71%）和25%甲霜·霜霉威WP（35.29%）单独处理。大田试验结果表明，复配剂对烟草黑胫病的防治效果高于单剂或与其相当，3个处理间无显著差异。综上，微生物菌剂GKZ与25%甲霜·霜霉威WP复配使用能够提高对烟草黑胫病的防治效果，同时可有效降低25%甲霜·霜霉威WP的使用量。

Abstract

In order to explore the effect of microbial inoculum combined with chemical agent on tobacco black shank, in this study, the indoor toxicity on tobacco black of microbial inoculum GKZ and 25% of metalaxyl propamocarb(WP) was determined by mycelial growth rate method, and the biocompatibility between the two was measured by plate with drug method. Also, the control effect on tobacco black shank disease of microbial inoculum GKZ, 25% of metalaxyl propamocarb WP, and the compound agent(V_GKZ∶V_WP=1∶1) was tested through pot and field experiments. The indoor toxicity results showed that the microbial inoculum GKZ could effectively restrain tobacco black shank and its EC₅₀ was 1.31×10⁴ cfu/mL, while the EC₅₀ against tobacco black shank of 25% of metalaxyl propamocarb WP was 0.87 mg/L. The compatibility test results showed that 0.87 mg/L of 25% of metalaxyl propamocarb WP had no significant inhibitory effect on the growth of strains in microbial inoculum. The pot experiment results showed that the compound agent had the highest control effect on tobacco black shank disease(60.18%), significantly higher than that of the microbial inoculum GKZ(38.71%) alone and 25% of metalaxyl propamocarb WP(35.29%) alone. The results of field experiments showed that the control effect of the compound agent on tobacco black shank was higher than the single agent or equivalent, and there were no significant differences among the treatments. In conclusion, the combination application of the microbial inoculum GKZ and 25% of metalaxyl propamocarb WP could improve the control effect on tobacco black shank and effectively reduce the use of metalaxyl propamocarb WP.

关键词

烟草黑胫病 / 菌药复配 / 菌丝生长速率法 / 毒力测定

Key words

tobacco black shank / combination of microbial inoculum and drug / mycelial growth rate method / toxicity determination

烟草黑胫病是烟草中具有毁灭性的真菌病害，该病菌可以侵染烟株根部和茎部，侵染后快速破坏维管束的结构和功能，使烟株枯萎、烟叶受损，严重影响烟叶的产质量^[1-4]。目前，防治烟草黑胫病的手段仍多采用化学防治，但是长期使用化学农药增加病原菌的抗药性^[5-6]，存在农药残留、环境污染、烤后烟品质下降等一系列问题，不利于我国烟草产业的良性循环发展^[7-9]。生物防治具有低毒、高效、安全、对环境友好等特点，并且还能促进植物的生长，符合烟草绿色发展的需要，但在田间使用时易受环境和施用方式的影响，导致防治效果不稳定^[10-11]。为了解决化学杀菌剂存在的抗药性及残留和生防制剂见效慢、防效不稳定等问题，可以将生防菌剂和化学杀菌剂联合使用来提高防治效果^[12]。

韩瑞华等^[2]研究表明，玫瑰黄链霉菌菌悬液与甲霜灵复配剂对烟草疫霉菌丝生长抑制率和室内盆栽防效均显著高于单剂。贾海江等^[13]研究表明，寡雄腐霉与氟噻唑吡乙酮联合使用防治烟草黑胫病，能够有效降低氟噻唑吡乙酮的使用量，提高防病效果，促进烟草生长。宋瑞敏等^[14]研究表明，暹罗芽孢杆菌与氟噻唑吡乙酮可以有效防治烟草黑胫病、促进幼苗生长，同时减少氟噻唑吡乙酮的使用量。张鑫^[15]研究表明，利用壳寡糖与解淀粉芽孢杆菌两者的协同关系和互补式作用机制形成的生防效应可达到兼顾防病、促生及土壤改良的目的。然而，前人研究菌药协同防治作物病害均为单一菌剂与化学药剂联用，单一菌剂功能单一，防效较复合菌剂不稳定，近年来不同功能的菌株复配是热门研究^[16]，但复合菌剂与化学药剂协同防治植物病害鲜有报道。甲霜灵为苯基酰胺类杀菌剂，对卵菌菌丝和孢子萌发有很好的抑制作用^[17]，霜霉威盐酸盐属于氨基甲酸酯类杀菌剂，对黄瓜霜霉病、辣椒疫病有良好的防治效果^[18-19]。复合药剂甲霜·霜霉威对烟草黑胫病防效的研究报道少，与复合菌剂协同防治烟草黑胫病的研究更为空白。

本试验开展了复合微生物菌剂联合25%甲霜·霜霉威WP施用对烟草黑胫病的防治效果研究，通过测定复合微生物菌剂对烟草疫霉的抑菌效果、化学杀菌剂对烟草疫霉的毒力系数、微生物菌剂主要菌种和化学杀菌剂的相容性、盆栽试验和田间试验评价其对烟草黑胫病的防治效果，旨在为烟草黑胫病的可持续防治提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

中烟100，由青岛中烟种子有限责任公司提供。

病原菌：烟草疫霉（Phytophthora nicotianae），由河南省农业科学院烟草研究所植物保护研究室分离鉴定并保存。

微生物菌剂GKZ：主要菌种为生防贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）和棘孢木霉（Trichoderma asperellum），由河南省农业科学院烟草研究所提供，委托河南崤函生物科技有限公司加工生产，水剂，有效活菌数≥2.0×10⁹ cfu/mL。

化学药剂：25%甲霜·霜霉威WP，购于江苏宝灵化工股份有限公司。

1.2 试验设计

1.2.1 微生物菌剂GKZ对烟草疫霉的抑制效果测定

将微生物菌剂GKZ按照0（CK）、20、2.0×10²、2.0×10³、2.0×10⁴、2.0×10⁵、2.0×10⁶、2.0×10⁷、2.0×10⁸、2.0×10⁹ cfu/mL梯度稀释后均匀涂布燕麦培养基（OA）上，平板中央接种5 mm疫霉菌饼培养5 d，利用十字交叉法测量各处理疫霉菌菌落生长直径，计算各处理对疫霉菌的相对抑菌率以及GKZ对烟草疫霉的抑制中浓度^[20-22]。

抑菌率＝（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%（1）

1.2.2 化学药剂25%甲霜·霜霉威对烟草疫霉的室内毒力测定

采用菌丝生长速率法^[23]测定25%甲霜·霜霉威WP对烟草疫霉抑菌率。根据预试验结果，配制含25%甲霜·霜霉威WP分别为0.01、0.05、0.25、1.25、6.25、10.00 mg/L的OA平板，平板中央接种5 mm疫霉菌饼培养。待对照处理平板的烟草疫霉菌即将长满平板时，利用十字交叉法测量菌落直径，计算各药剂浓度对病原菌的抑制率，并求出EC₅₀值。

1.2.3 微生物菌剂与化学药剂的相容性测定

将贝莱斯芽孢杆菌单菌落接种于LB液体培养基中，28 ℃、180 r/min振荡培养48 h，无菌水配制成芽孢量1×10⁴ cfu/mL的菌悬液，吸取菌悬液100 μL，均匀涂布于含25%甲霜·霜霉威WP 0.87、1.25、6.25、10.00 mg/L的NA培养基上，24 h后计数贝莱斯芽孢杆菌菌落数量及抑菌率。将5 mm棘孢木霉菌饼接种于含上述浓度药剂的PDA平板中心处，待对照平板棘孢木霉即将长满平板时，利用十字交叉法测量棘孢木霉菌落直径，计算抑菌率。

1.2.4 微生物菌剂与化学药剂复配对盆栽烟草黑胫病的防治效果

试验设3个处理：微生物菌剂GKZ 2 mL/株；25%甲霜·霜霉威WP 0.1 g/株；复配剂（25%甲霜·霜霉威WP 0.05 g/株+微生物菌剂1 mL/株）；清水为对照。育苗基质装入小花盆（上口直径6.5 cm、高8.0 cm），移入长势一致的烟苗（中烟100，苗龄35 d左右，4片真叶），将烟草疫霉在180 r/min、28 ℃摇床中振荡培养7 d（孢子量≥1×10⁵ cfu/mL），用细胞破碎仪将摇好的疫霉菌液破碎20~30 s，每株烟苗灌根接入1 mL烟草疫霉菌液。24 h之后灌根各处理药剂（各处理药剂加入到20 mL清水中灌根），15 d之后进行第2次灌根，30 d之后进行第3次灌根。每个处理10株烟苗，3次重复。

1.2.5 微生物菌剂与化学药剂复配对大田烟草黑胫病的防治效果

试验安排在河南省农业科学院烟草研究所黑胫病病圃，2024年4月17日整地起垄，起垄时双条沟条施复合肥（N-P-K为15-15-15）35 kg/m²，芝麻饼肥40 kg/m²，硫酸钾15 kg/m²。5月3日移栽，移栽时穴施提苗肥即复合肥（N-P-K为15-15-15）5 kg/m²。株距0.5 m，行距1.2 m，土壤肥力中等，烟草品种为中烟100。试验设置3个处理：微生物菌剂（有效活菌数≥2.0×10⁹ cfu/mL）30 L/hm²；5%甲霜·霜霉威WP 1 500 g/hm²；复配剂（25%甲霜·霜霉威WP 750 g/hm²+微生物菌剂15 L/hm²）；清水为对照。分别在烟草移栽期（5月3日）、团棵期（6月18日）和旺长期（7月23日）对烟草茎基部进行灌根处理。每个处理60株烟草，3次重复。

1.3 测定项目及方法

观察烟草黑胫病的发病情况，于清水对照处理开始发病时，按国家标准GB/T 23222—2008《烟草病虫害分级及调查方法》^[24]调查各处理烟株黑胫病的发病情况，直至病情稳定，并计算发病率、病情指数和防治效果。

1.4 数据分析

数据处理采用Excel、SPSS 22.0统计软件。利用Duncan氏新复极差法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 微生物菌剂GKZ对烟草疫霉的抑制效果

由表1可知，孢子量为20~2.0×10⁹ cfu/mL的微生物菌剂均对烟草疫霉有一定的抑制作用。当含菌量为2.0×10⁹ cfu/mL时，抑制率最高，为89.71%，抑制中浓度为1.31×10⁴ cfu/mL。

2.2 化学药剂25%甲霜·霜霉威对烟草疫霉的毒力

室内毒力测定结果表明（表2），随着化学药剂25%甲霜·霜霉威WP质量浓度的升高，烟草疫霉的菌落直径越来越小，抑制率越高。当25%甲霜·霜霉威WP质量浓度为10.00 mg/L时，对烟草疫霉的抑制作用最好，其EC₅₀为0.87 mg/L。说明25%甲霜·霜霉威WP对烟草疫霉具有较好的毒力。

2.3 微生物菌剂与化学药剂的相容性

由表3可知，0.87 mg/L的25%甲霜·霜霉威WP对贝莱斯芽孢杆菌和棘孢木霉的抑制率均为0，随着25%甲霜·霜霉威WP质量浓度的增加，其对贝莱斯芽孢杆菌和棘孢木霉的抑菌率也增高，但对棘孢木霉的抑菌率增长变化不大。当25%甲霜·霜霉威WP质量浓度为10 mg/L时，对棘孢木霉的抑菌率仅为2.76%，对贝莱斯芽孢杆菌的抑菌率为20.39%。说明0.87 mg/L的25%甲霜·霜霉威WP与贝莱斯芽孢杆菌和棘孢木霉相容性很好，可作为复配剂。

2.4 不同处理对盆栽烟草黑胫病的防治效果

不同处理对烟草黑胫病盆栽试验的防治效果如表4所示。

盆栽试验结果表明（表4），施用微生物菌剂、25%甲霜·霜霉威WP以及复配剂后，烟草黑胫病的发病率和病情指数均低于清水对照，处理后的病情指数与清水对照有极显著差异（P<0.01），其中复配剂的病情指数最低，其防治效果达到68.77%，显著高于单剂（P<0.05）。上述结果表明，微生物菌剂和25%甲霜·霜霉威WP复配剂可以用来较好地防治烟草黑胫病，且防治效果明显好于单剂。

2.5 微生物菌剂与化学药剂复配对大田烟草黑胫病的防治效果

大田试验结果表明（表5），施用微生物菌剂、25%甲霜·霜霉威WP以及复配剂后对烟草黑胫病都有一定的防治效果。3次调查结果均显示，与对照相比，单独施用25%甲霜·霜霉威WP病情指数最低，防治效果最高。其次为微生物菌剂GKZ与25%甲霜·霜霉威WP复配处理，防治效果稍低于单独施用25%甲霜·霜霉威WP处理，但二者无显著差异。微生物菌剂GKZ与25%甲霜·霜霉威WP复配处理防治效果比单独施用微生物菌剂GKZ处理高，且二者间差异不显著。综上所述，微生物菌剂和25%甲霜·霜霉威WP复配剂对烟草黑胫病有一定防治效果，距离施用药剂时间越短，防治效果越高。

3 结论与讨论

3.1 微生物菌剂GKZ与25%甲霜·霜霉威WP对烟草疫霉的毒力

微生物菌剂GKZ是细菌贝莱斯芽孢杆菌与真菌棘孢木霉按一定比例复合而成，贝莱斯芽孢杆菌能分泌脂肽类抗生素、酶、抗菌蛋白、植物激素、聚酮类抗生素、挥发性抑菌代谢物等多种生物活性物质，对抑制病原菌起着重要作用^[25]。张文静等^[26]研究表明，贝莱斯芽孢杆菌XDY66对辣椒疫霉有较强的拮抗作用。棘孢木霉能产生多种酶类和次生代谢产物，可降解病原菌的细胞壁，抑制病原菌的生长和繁殖。李小杰等^[27]研究表明，1×10⁶ cfu/mL菌液浓度的棘孢木霉对鸢尾丝囊霉菌有92.63%的平板抑制率。鸢尾丝囊霉菌和烟草疫霉都属于卵菌。本研究微生物菌剂GKZ对烟草疫霉有很好的抑制效果，EC₅₀值为1.31×10⁴ cfu/mL，与张文静等^[26]和李小杰等^[27]研究结果一致。精甲霜灵为甲霜灵的异构体之一，蒋冰心等^[28]采用菌丝生长速率法测定了8种杀菌剂对大豆疫霉的室内毒力，结果表明，甲霜灵对大豆疫霉的EC₅₀值为0.123 3 μg/mL，霜霉威对大豆疫霉的EC₅₀值为48.342 9 μg/mL。本研究结果显示，25%甲霜·霜霉威WP对烟草疫霉EC₅₀值为0.87 mg/L。这与蒋冰心等^[28]研究结果一致。

3.2 微生物菌剂GKZ与25%甲霜·霜霉威复配对烟草黑胫病的防治效果

本研究盆栽试验结果表明，复配剂处理对烟草黑胫病的防治效果最高，为68.77%，显著高于微生物菌剂GKZ和25%甲霜·霜霉威WP单独处理，复配剂防治效果高于2种单剂，可能是因为有化学药剂与微生物菌剂发生了协同作用，增强了复配剂防治效果。大田试验结果表明，微生物菌剂GKZ、25%甲霜·霜霉威WP和复配剂处理后的烟株病情指数均低于对照，其中复配剂对烟草黑胫病的防治效果要显著高于微生物菌剂GKZ单剂，与25%甲霜·霜霉威WP相当，各处理间无显著差异。袁梦蕾等^[29]研究表明，土壤水分、温度和pH值对淡紫紫孢菌微菌核的定殖均有显著影响，含水量过高或过低均不利于生防菌增殖。本试验田间试验防治效果与盆栽试验结果稍有不同，这可能因为盆栽在温室中进行，保持28 ℃基本不变和适量的水分浇灌，适宜的温度和水分非常有利于微生物菌剂GKZ中菌种贝莱斯芽孢杆菌和棘孢木霉的生存定殖；而大田环境相对复杂，高温干旱或持续降雨都会影响微生物菌剂的定殖，进而影响复配剂防治效果。但总体来说，微生物菌剂GKZ与25%甲霜·霜霉威WP复配对烟草黑胫病具有较好的防治效果，说明生物防治与化学防治联合防治烟草病害具有良好的可行性。另外，复配剂的使用能够延缓病原菌的抗药性，提高防病效果，增大杀菌谱。但微生物菌剂和25%甲霜·霜霉威WP的联合抑菌机制是空间竞争、营养竞争以及抗生素与化学药剂的双重作用，抑或是其他，以及其对烟草根际微生物的影响还需进一步研究。

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基金资助

河南省烟草公司科技项目(2024410000240049)

中国烟草总公司烟粮融合项目（110202201026（LS-10））

河南省农业科学院科技创新团队项目(2025TD42)