烟草棒孢霉叶斑病防治药剂的筛选

Screening of Agents for Control of Tobacco Corynespora Leaf Spot

摘要

为筛选有效防治烟草棒孢霉叶斑病的药剂，采用菌丝生长速率法测定10种杀菌剂（98%氟啶胺、95%苯醚甲环唑、98%吡唑醚菌酯、97%咪鲜胺、95%丙环唑、96%菌核净、96%异菌脲、98%嘧菌酯、95%醚菌酯和98%唑醚菌胺）对3株多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）DWZ、WZ-16和WZ-45菌株菌丝生长的毒力，同时测定10种杀菌剂（200 g/L氟唑菌酰羟胺·苯醚甲环唑SC、40%菌核净WP、3%中生菌素WP、20%噻菌铜SC、50%氟啶胺WP、50%氯溴异氰尿酸WP、57.6%氢氧化铜WDG、25%咪鲜胺EC、解淀粉芽孢杆菌LB21 AS和贝莱斯芽孢杆菌MH24 AS）对烟草棒孢霉叶斑病的田间防治效果。结果表明，10种杀菌剂对烟草棒孢霉叶斑病病原菌菌丝生长表现出不同程度的抑菌作用，抑菌活性由强到弱依次为咪鲜胺（0.23 mg/L）、氟啶胺（0.23 mg/L）、苯醚甲环唑（0.40 mg/L）、吡唑醚菌酯（1.05 mg/L）、丙环唑（1.06 mg/L）、异菌脲（1.08 mg/L）、菌核净（3.76 mg/L）、嘧菌酯（5.22 mg/L）、醚菌酯（18.03 mg/L）和唑醚菌胺（200.25 mg/L）。田间试验结果表明，10种药剂防治效果存在差异，200 g/L氟唑菌酰羟胺·苯醚甲环唑SC处理的田间防治效果最好，施药12 d后防治效果达79.51%；其次依次为20%噻菌铜SC和50%氟啶胺WP，其相对防治效果分别为69.75%和68.47%。综上，田间进行烟草棒孢霉叶斑病的防治时，可选用200 g/L氟唑菌酰羟胺·苯醚甲环唑SC，按推荐剂量600 mL/hm²施用为宜。

Abstract

In order to screen the effective agents to control the tobacco Corynespora leaf spot, in this study, the mycelial growth rate method was employed to determine the toxicity of ten fungicides(98% of Dimethachlon, 95% of fluazinam, 98% of difenoconazole, 97% of propiconazol, 95% of pyraclostrobin, 96% of Ametoctradin, 96% of iprodione, 98% of azoxystrobin, 95% of kresoximmethyl, and 98% of prochloraz) on the mycelial growth of three Corynespora cassiicola strains, namely DWZ, WZ-16, and WZ-45. Meanwhile, the field control effect of 10 kinds of fungicides(200 g/L of Pydiflumetofen·Difenoconazole SC, 40% of Dimethachlon WP, 3% of Zhongshengmycin WP, 20% of Thiodiazole copper SC, 50% of fluazinam WP, 50% of chloroisobromine-cyanuric-acid WP, 57.60% of Cu(OH)₂ WDG, 25% of prochloraz EC, Bacillus amyloliquefaciens LB21 AS, and Bacillus velezensis MH24 AS) on tobacco Corynespora leaf spot was measured. The results showed that 10 fungicides showed different bacteriostatic activity against mycelium growth of 3 strains of tobacco Corynespora leaf spot pathogenic fungi. The bacteriostatic activity in the descending order was prochloraz(0.23 mg/L), fluazinam(0.23 mg/L), difenoconazole(0.4 mg/L), pyraclostrobin(1.05 mg/L), propiconazol(1.06 mg/L), iprodione(1.08 mg/L), dimethachlon(3.76 mg/L), azoxystrobin(5.22 mg/L), kresoxim-methyl(18.03 mg/L), and Ametoctradin(200.25 mg/L). The results of the field trials showed that there were differences in the control effect of the 10 agents. The field control effect of 200 g/L of Pydiflumetofen·Difenoconazole SC was the best, it was 79.51% after 12 days of application. Followed by 20% of Thiodiazole copper SC and 50% of fluazinam WP, their relative control effect was 69.75% and 68.47%, respectively. In conclusion, it was recommended to use 200 g/L of Pydiflumetofen·Difenoconazole SC at the recommended dose of 600 mL/ha for field control of tobacco Corynespora leaf spot.

关键词

烟草 / 棒孢霉叶斑病 / 菌丝生长速率法 / 多主棒孢霉 / 杀菌剂 / 毒力 / 田间防治效果

Key words

tobacco / Corynespora leaf spot / mycelial growth rate method / Corynespora cassiicola / fungicide / toxicity / field control effect

烟草棒孢霉叶斑病（Corynespora leaf spot）为烟草成熟期发生的具有破坏性的叶部病害，近年来已在我国广西^[1]、贵州^[2]、江西^[3]和重庆^[4]等烟区间隙性暴发。发病初期，病斑为水渍状浅绿色小点，后逐渐变为褐色，具浅黄色的晕圈，进而扩大为近圆形或不规则的大型病斑。当环境相对湿度较高时，病斑中心可产生深褐色或黑色霉状物，发病严重时可造成烟叶减产50%以上。该病害由多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）引起。多主棒孢霉寄主范围广泛，能够侵染380属530余种植物^[5]。此外，其在线虫^[6]、海绵^[7]和人类相关病例研究中^[8]亦有相关报道。棒孢霉叶斑病病原菌存在多种致病模式，没有明确的地理和寄主植物界限^[9]；该病原菌变异性较强，即使在相同气候条件下分离的病原菌，在真菌生长、产孢以及致病性方面也存在较大差异^[10]。

目前，在烟叶生产中，化学防治仍然是烟草棒孢霉叶斑病最经济有效的方法之一。冉茂等^[11]研究了6种杀菌剂对重庆烟草棒孢霉叶斑病的防治效果，结果表明，80%代森锰锌悬浮剂、50%多菌灵可湿性粉剂和75%百菌清可湿性粉剂对烟草棒孢霉叶斑病的防治效果较好，相对防治效果分别为89.08%、87.74%和83.88%。覃茜等^[12]研究杀菌剂对烤烟棒孢霉叶斑病的防治效果，结果表明，咪鲜胺和甲基硫菌灵的室内抑菌效果最好，其EC₅₀分别为2.00、2.10 mg/L。潘忠梅等^[13]评价了5种杀菌剂和1种生防菌剂YC2140对贵州烟草棒孢霉叶斑病的防治效果，结果表明，氟啶胺悬浮剂和咪鲜胺水乳剂的防治效果分别为78.77%和77.85%。雷雪梅等^[1]测定了10种杀菌剂对广西烟草多主棒孢霉的抑菌活性，结果表明，咪鲜胺、氟啶胺和吡噻菌胺的活性较强。

目前，有关烟草棒孢霉叶斑病防控药剂的筛选报道较少。此外，各烟区由于地理位置、气候条件以及病害发生蔓延等方面存在差异，药剂的防治效果也各有不同。近年来，烟草棒孢霉叶斑病在贵州湿度较高的各大烟区发病较为频繁，防控难度较大，亟待寻找新的高效防控药剂。

本研究采用菌丝生长速率法测定10种常见杀菌剂原药对烟草棒孢霉叶斑病病原菌多主棒孢霉的毒力，并在此基础上测定10种杀菌剂制剂对烟草棒孢霉叶斑病的田间防治效果，旨在为烟草棒孢霉叶斑病的有效防控提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试菌株：贵州省烟草科学研究院农艺研发中心微生物实验室前期采集具有明显症状的叶片，经组织分离纯化，命名为DWZ、WZ-16和WZ-45，经分子生物学方法鉴定为多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）。

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g，以蒸馏水定容至1 L。

10种药剂：96%菌核净原药，购自江西禾益化工股份有限公司；95%苯醚甲环唑原药，购自江苏莱科化学有限公司；95%丙环唑原药，购自海南正业生物科技股份有限公司；98%吡唑醚菌酯，购自江西欧氏化工有限公司；98%唑醚菌胺，由南京农业大学杀菌剂生物学实验室提供；96%异菌脲原药，购自安道麦辉丰（江苏）有限公司；98%氟啶胺原药，购自河北兴柏农业科技股份有限公司；98%嘧菌酯原药，购自江苏长青农化股份有限公司；95%醚菌酯原药，购自山东潍坊润丰化工股份有限公司；97%咪鲜胺原药，购自安徽广信农化股份有限公司。

10种制剂：200 g/L氟唑菌酰羟胺·苯醚甲环唑SC（75 g/L氟唑菌酰羟胺+125 g/L苯醚甲环唑），购自先正达（中国）投资有限公司；40%菌核净WP，购自江西禾益化工公司；3%中生菌素WP，购自山东兆丰年生物科技有限公司；20%噻菌铜SC，购自浙江龙湾化工有限公司；50%氟啶胺WP，购自江苏优嘉植物保护有限公司；50%氯溴异氰尿酸WP，购自陕西亿田丰作物科技有限公司；57.6%氢氧化铜WDG，购自澳大利亚纽发姆有限公司；25%咪鲜胺EC，购自江苏省扬州市苏灵农药化工有限公司；5×10¹⁰ cfu/g解淀粉芽孢杆菌LB21 AS及5×10¹⁰ cfu/g贝莱斯芽孢杆菌MH24 AS，均由国家生物农药工程中心发酵生产。

1.2 试验方法

1.2.1 杀菌剂对烟草棒孢霉叶斑病病原菌室内毒力测定

采用菌丝生长速率法^[14]进行病原菌菌丝室内敏感性测定。将96%菌核净和98%吡唑醚菌酯原药分别溶解于丙酮中，95%苯醚甲环唑、98%唑醚菌胺、95%丙环唑、96%异菌脲、98%氟啶胺、98%嘧菌酯、95%醚菌酯和97%咪鲜胺原药分别溶解于甲醇中，配制成1.0×10⁴ mg/L的母液，于4 ^oC下避光保存。其中，苯醚甲环唑和丙环唑的有效成分质量浓度分别为0、0.16、0.31、0.63、1.25、2.50、5.00 mg/L；菌核净和唑醚菌胺的有效成分质量浓度分别为0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 mg/L；异菌脲、氟啶胺和咪鲜胺的有效成分质量浓度分别为0、0.03、0.06、0.13、0.25、0.50、1.00 mg/L；吡唑醚菌酯的有效成分质量浓度分别为0、0.31、0.63、1.25、2.50、5.00、10.00 mg/L；嘧菌酯和醚菌酯的有效成分质量浓度分别为0、1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00 mg/L。将供试菌株多主棒孢霉DWZ、WZ-16、WZ-45活化后，置于真菌培养箱中培养5 d。使用无菌打孔器在菌落边缘选取直径为6 mm的菌碟，分别将其接种于含药平板上，每个处理设置5次重复。接种病原菌后，将平板置于28 ^oC的真菌培养箱中进行黑暗培养。待对照菌落直径长至培养皿直径的2/3时，采用十字交叉法测量菌落直径，并计算各药剂不同剂量下对病原菌菌丝生长的抑制率。

抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-接种病原菌菌饼直径）×100%（1）

1.2.2 杀菌剂组合对烟草棒孢霉叶斑病的田间防治效果测定

田间药效试验在贵州省遵义市务川县（28°52N、107°89E）自然发病烟田进行，此时试验地烟田病叶率约为10%。选取烟株长势一致的试验田，进行小区划分，每个小区面积约为27 m²，各小区随机分布，并设置保护行，避免交叉影响。每个小区种植烟株40株，每个处理重复3次。共设10个药剂处理，共施2次药，施药间隔为6 d。药剂浓度处理见表1。其中，用水量为900 L/hm²。使用背负式电动喷雾器（型号：DSF01A-20-100，贵州黔丰源农业科技开发有限公司）对烟株叶片表面和背面进行均匀喷雾，直至液滴即将滑落，以喷施清水作为对照。于8月17日进行第1次施药，8月23日进行第2次施药。在第1次施药后6、12 d时，各小区随机选取20株烟株调查烟叶发病情况，计算各处理的病情指数。参照GB/T 23222—2008^[15]进行病害分级。

病情指数=∑（各级病株数×该病级值）/（调查总株数×最高级值）×100（2）

相对防治效果=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100%（3）

1.3 数据分析

使用Excel 2019进行数据处理，采用SPSS 7.5软件对相关试验数据进行单因素方差分析，应用最小显著差数法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同杀菌剂对烟草棒孢霉叶斑病病原菌室内毒力测定结果

由表2可知，10种杀菌剂原药对3株多主棒孢霉菌丝生长均表现出不同程度的抑菌作用，其抑菌活性由最强到最弱依次为咪鲜胺（EC₅₀值范围0.20~0.25 mg/L，平均值为0.23 mg/L）、氟啶胺（EC₅₀值0.20~0.27 mg/L，平均值为0.23 mg/L）、苯醚甲环唑（EC₅₀值0.27~0.62 mg/L，平均值为0.40 mg/L）、吡唑醚菌酯（EC₅₀值0.69~1.15 mg/L，平均值为1.05 mg/L）、丙环唑（EC₅₀值0.95~1.23 mg/L，平均值为1.06 mg/L）、异菌脲（EC₅₀值0.86~1.26 mg/L，平均值为1.08 mg/L）、菌核净（EC₅₀值3.05~4.94 mg/L，平均值为3.76 mg/L）、嘧菌酯（EC₅₀值5.05~5.49 mg/L，平均值为5.22 mg/L）、醚菌酯（EC₅₀值16.63~19.21 mg/L，平均值为18.03 mg/L）、唑醚菌胺（EC₅₀值为166.90~233.57 mg/L，平均值为200.25 mg/L）。此外，烟草棒孢霉叶斑病不同菌株对同种药剂的敏感性也存在差异。菌株DWZ对菌核净、苯醚甲环唑、丙环唑、吡唑醚菌酯、异菌脲和咪鲜胺的EC₅₀值均低于菌株WZ-16和WZ-45；菌株WZ-45对唑醚菌胺、醚菌酯和氟啶胺的EC₅₀值低于菌株DWZ和WZ-16；菌株WZ-16对嘧菌酯的EC₅₀值低于菌株DWZ和WZ-45。

2.2 杀菌剂组合处理对烟草棒孢霉叶斑病的田间防治效果

田间防治效果结果表明（表3），10种杀菌剂制剂对烟草棒孢霉叶斑病表现出不同的田间防控效果。第1次施药后12 d，200 g/L氟唑菌酰羟胺·苯醚甲环唑SC处理的田间防控效果最高，防治效果为79.51%，其次依次为20%噻菌铜SC和50%氟啶胺WP，其相对防治效果分别为69.75%和68.47%。

3 结论与讨论

不同种类的杀菌剂对病原菌的作用机制各有特点，因此，筛选更多种类的有效药剂是必要的。本研究中，室内毒力测定结果表明，咪鲜胺、氟啶胺和苯醚甲环唑等原药对烟草棒孢霉叶斑病病原菌多主棒孢霉菌丝生长表现出较强的毒力，其平均EC₅₀值分别为0.23、0.23、0.40 mg/L。而醚菌酯和唑醚菌胺等原药对多主棒孢霉菌丝生长的抑制效果较差，其EC₅₀值平均分别为18.03、200.25 mg/L。此结果与覃茜等^[12]和雷雪梅等^[1]的室内毒力测定结果存在差异，这可能是由于病原菌多主棒孢霉变异性强，导致不同地区的病原菌对药剂耐受性存在差异。此外，试验方法的差异性（如PDA培养基成分差异）亦可能对结果的一致性产生影响，不同研究中所采用的培养基配方及培养条件的差异会使杀菌剂毒力测定结果出现偏差。醚菌酯属于真菌线粒体电子传递链能量合成抑制剂，对菌丝生长的抑制活性较弱，而对孢子萌发的抑制活性较强。目前，已有相关研究报道，醚菌酯存在抗药性风险^[16]，其对多主棒孢霉的防治效果较差可能表明目前烟草致病菌同样存在抗药性风险。唑嘧菌胺是一种嘧啶胺类杀菌剂，主要用于防治葡萄、蔬菜、马铃薯等作物上的晚疫病及霜霉病。唑嘧菌胺防治效果较差，可能与该药剂的作用靶标为卵菌纲低等菌^[17]，而对其他致病菌如半知菌门类的高等真菌活性弱有关。此外，田间试验中的部分药剂因无法获得原药未能进行室内活性测定，有待后续进行研究。

咪鲜胺（Prochloraz）是麦角甾醇生物合成抑制类的广谱杀菌剂，在防治子囊菌和半知菌引发的植物病害方面应用广泛，且与大多数杀菌剂混用均有良好的防治效果^[18]。氟啶胺（Fluazinam）属于广谱、高效的吡啶胺类保护性杀菌剂，病原菌对其产生抗性的风险较低，且与其他类型杀菌剂不产生交互抗性，作用机理独特。目前，该药剂已登记用于防控多种植物病害^[19]，其对多主棒孢霉的抑菌活性进一步扩大了其对烟草病原菌的抑菌谱。苯醚甲环唑（Difenoconazole）是一种广谱高效的三唑类杀菌剂，其主要通过抑制病原菌麦角甾醇的生物合成进而发挥作用^[20]。目前该药剂与嘧菌酯、氟唑菌酰羟胺的复配剂已经在烟草上登记，用于烟草赤星病的防控。鉴于该药剂对病原菌菌丝生长的强抑制活性，推测其对烟草棒孢霉叶斑病可能具有一定的治疗作用。

本研究选择不同作用机理杀菌剂进行田间试验，其中包括室内毒力测定中表现较好的咪鲜胺、氟啶胺等相关制剂，同时也选择了常易与棒孢霉叶斑病混合发生的野火病、细菌性角斑病和赤星病等病害的防控药剂，包括3%中生菌素WP、40%菌核净WP、57.60%氢氧化铜WDG和芽孢杆菌等。这些细菌性药剂和广谱性药剂也对烟草棒孢霉叶斑病亦具有一定的防控效果，推测这可能是由于棒孢霉叶斑病发生时，其他叶际致病菌也参与危害，而这些药剂通过抑制其他潜在病原菌而表现出一定的防控效果。室内对菌丝生长抑制活性较好的咪鲜胺和氟啶胺，在田间用药12 d后的防治效果仍大于62%，进一步证实了这些药剂室内敏感性与田间防治效果的一致性。棒孢霉叶斑病的发生与流行是病原菌孢子萌发入侵和菌丝扩展形成病斑的过程，通常存在多次侵染循环。因此，烟草棒孢霉叶斑病的防治需综合考虑同时对病原菌孢子萌发、菌丝生长、孢子形成等多个生活史阶段的抑制。

不同作用机制的杀菌剂对病原菌生活史各阶段的抑制效应存在差异。保护性杀菌剂（氯溴异氰尿酸、氢氧化铜和咪鲜胺）与生防菌剂（贝莱斯芽孢杆菌MH24和解淀粉芽孢杆菌LB21）在首次施药后6 d的防治效果优于中生菌素和菌核净等治疗性杀菌剂，但施药12 d后防治效果降低，此类杀菌剂适用于病害预防时施用；治疗性杀菌剂（如氟啶胺、噻菌铜、中生菌素和菌核净）在2次施药后的防治效果均高于1次施药后的防治效果，此类杀菌剂适用于病害发生较轻时进行防控；复配剂氟唑菌酰羟胺·苯醚甲环唑防治效果最佳，源于氟唑菌酰羟胺^[21]（琥珀酸脱氢酶抑制剂，抑制能量代谢）与苯醚甲环唑^[20]（三唑类，抑制生物膜合成）的协同作用：前者阻断病原菌能量供应以抑制病斑扩展，后者干扰菌丝生长以限制菌落扩张，二者分别针对病原菌侵染后不同阶段形成防控闭环，从而实现优于单剂的持续控病效果。本研究选择的代表性复配剂200 g/L氟唑菌酰羟胺·苯醚甲环唑SC处理的田间防治效果最好（79.51%），优于室内毒力测定中表现突出的咪鲜胺（62.98%）和氟啶胺（68.47%），这进一步说明病害防治中多种作用位点复配剂的优势。鉴于此，当包括烟草棒孢霉叶斑病在内的多种叶部病害混合发生时，需针对性的选择不同作用机理的复配剂，或采用药剂混配的方式进行病害防控。氟唑菌酰羟胺（Pydiflumetofen）作为一种新型吡啶酰胺类杀菌剂，可以靶向抑制呼吸链复合物Ⅱ中的泛醌还原反应，广谱高效^[21]。目前，先正达南通作物保护有限公司已开展200 g/L氟唑菌酰羟胺·苯醚甲环唑SC用于烟草赤星病防治的登记。有研究表明，氟唑菌酰羟胺与苯醚甲环唑复配剂在烟叶上半衰期为4~9 d，属于易降解农药，对环境安全^[22]。因此，在烟草棒孢霉叶斑病发生期间，推荐使用氟唑菌酰羟胺·苯醚甲环唑SC杀菌剂进行田间防控。

通过室内毒力测定及田间药效试验，筛选出200 g/L氟唑菌酰羟胺·苯醚甲环唑SC杀菌剂按推荐剂量600 mL/hm²应用时，对烟草棒孢霉叶斑病相对防治效果最好，为79.51%。其次依次为20%噻菌铜SC 1 950 mL/hm²和50%氟啶胺WP 525 mL/hm²，其相对防治效果分别为69.75%和68.47%。因此，田间进行烟草棒孢霉叶斑病的防治时，可选用200 g/L氟唑菌酰羟胺·苯醚甲环唑SC按推荐剂量600 mL/hm²施用。

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基金资助

国家自然科学基金(32460698)

国家自然科学基金(32160522)

中国烟草总公司科技项目（110202101045（LS-05））

贵州省“百层次”创新型人才项目（黔科合平台人才-GCC〔2022〕028-1）

贵州省烟草公司遵义市公司科技项目(2022XM09)

贵州省科技创新人才团队项目（黔科合平台人才-CXTD〔2023〕021）