低温胁迫对扁桃优株生理特性的影响

Effect of Low Temperature on Physiological Characteristics of Almond Strains

摘要

以2个扁桃优株（先锋一号、桃巴旦）后代叶片为试验材料，设置 5 个温度水平（4（CK）、2、0、-2、-4 ℃）和4个处理时间（1、2、3、4 h），探究低温处理期间2个扁桃优株膜结构稳定性、过氧化物酶活和渗透调节物质含量的变化，以期筛选出抗寒性较好的优株，为扁桃实生后代优株选择提供帮助。结果表明，在同一低温-4 ℃胁迫处理下，先锋一号的后代的相对电导率、丙二醛含量、过氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、多酚氧化酶（PPO）活性随处理时间延长均呈先降后升的趋势，桃巴旦的后代的相对电导率、丙二醛含量则呈递增趋势，在-4 ℃、4 h处理下达到最大值，桃巴旦后代的可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸、SOD活性、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性随处理时间延长呈先降后升的趋势。在相同时间4 h处理下，先锋一号的后代的脯氨酸含量随着胁迫温度降低总体呈下降趋势，在-2 ℃、4 h处理下降幅最大；桃巴旦的后代的丙二醛、可溶性糖、脯氨酸含量、SOD活性含量随着胁迫温度降低总体呈上升趋势，其中脯氨酸含量和SOD活性在-4 ℃、4 h处理下增幅最大。桃巴旦后代的抗寒性显著优于先锋一号后代，其后代可以耐受更低的温度（-4 ℃）和更长时间的低温。桃巴旦后代的抗寒性突出，在实际生产中可作为优良砧木。

Abstract

In this study, with two almond strains(Xianfeng 1, Taobadan) offspring leaves as test material, five temperature level(4(CK), 2, 0, -2, and -4 ℃) and 4 processing time(1, 2, 3, and 4 h) were set to explore during the low temperature treatment, membrane structure stability, change of peroxidase activity and osmotic material content of the two almond strains, in order to screen out the strains with better cold resistance, provide help for selcection of almond offspring strains. The results showed that under the same low-temperature stress treatment of -4 ℃, the relative conductivity, malondialdehyde content, activity of peroxidase(POD), superoxide dismutase(SOD), and polyphenols oxidase(PPO) of Xianfeng 1 offspring all decreased first and then increased with the extension of treatment time. The relative conductivity and malondialdehyde content of the Taobadan offspring showed an increasing trend, reaching the maximum values under the treatment of -4 ℃ and 4 h. The content of soluble protein, soluble sugar, and proline, the activity of SOD and phenylalanine ammonia lyase(PAL) of Taobadan offspring decreased first and then increased with the extension of treatment time. At the same time of 4h treatment, the proline content of Xianfeng 1 offspring showed a trend of overall decrease and the decreasing range was the highest under the treatment of -2 ℃ and 4 h. The content of propanondialdehyde, soluble sugar, and proline, the SOD activity of Taobadan offspring showed a trend of overall incrase and the increasing range of the proline content and the SOD activity was the highest under the treatment of -4 ℃ and 4 h. The cold resistance of Taobadan offspring was significantly better than that of Xianfeng 1. The Taobadan offspring could be tolerate to lower temperature(-4 ℃) and longer duration. Therefore, the Taobadan offspring had the outstanding cold resistance and could be used as the excellent stock in production.

Graphical abstract

关键词

扁桃 / 低温胁迫 / 渗透调节 / 酶活性

Key words

almond / low temperature stress / osmoregulation / enzyme activity

Author summay

郝丽叶（1999-），女，河北邯郸人，在读硕士，研究方向：果树遗传育种。

扁桃（Amygdalus communis L.）属蔷薇科（Roseceae）李亚科（Prunoideae）桃属（Amygdalus）扁桃亚属，是世界闻名的干果之一，营养丰富，经济价值高^[1-2]。我国栽培扁桃主要分布在新疆喀什地区的莎车、英吉沙、泽普、疏附、叶城等县^[3]，由于受到早春低温及倒春寒的影响，分布范围较小。近几年，莎车地区春季的异常低温令扁桃倒春寒频发^[4]，也使当地扁桃面临减产或绝产的危险。因此，研究扁桃倒春寒伤害机制，探讨减轻扁桃生长过程中低温伤害的有效方法，以期为阐明扁桃低温逆境生理、实现扁桃抗低温逆境栽培提供理论依据。

低温是制约植物生长发育和地理分布的主要环境因子^[5-6]。扁桃的形态结构会因低温而发生改变，并利用一系列生理生化反应来响应低温环境，抵御低温带来的伤害^[7]。此外，冻害后扁桃叶片中还有一些与抗寒性密切相关的生理指标，如渗透调节物质^[8]、过氧化程度^[9]、过氧化物酶活性^[9-10]等。可作为抗寒性的评价指标。李永等^[11]通过低温胁迫试验发现，低温胁迫引起连翘叶片相对电导率和MDA含量升高，连翘叶片通过多种途径抵御低温伤害，SP、SS、SOD在胁迫前期发挥主要作用，胁迫增强时Pro和POD发挥更为主要的作用。也有学者研究发现，砧木抗寒性越强，细胞膜结构越稳定，以便积累大量的可溶性糖、游离脯氨酸等渗透调节物质，且SOD、POD、CAT的活性也相对较高^[12-15]。郝庆等^[16]得出巴旦木在花期和幼果期分别能耐４ ℃和0.5 ℃的短时低温，当温度降到0.2~1.4 ℃时花和花芽停止生长。国内外关于低温胁迫对扁桃渗透调节物质等生理指标的影响做了大量的研究工作，但由于扁桃品种不同等原因，研究结果之间存在较大的差异。因为低温胁迫可以是一个短期影响，也可以是一个长期缓慢的过程，所以植物对其响应也存在时间的长短问题。目前关于扁桃叶片抗寒生理特性方面的研究鲜有报道。

前人相关研究多以单因素低温处理为研究内容^[17-18]，但低温及持续时间对扁桃春季低温冻害程度是不同的，新疆地区扁桃抗寒性研究主要针对扁桃枝条和花芽，而有关叶片方面的研究相对较少。因此，本研究通过人工模拟低温，探索不同时间（1~4 h）和低温处理下，扁桃叶片生理生化特征的变化，分析其生长季的抗寒性，为扁桃实生后代优株选择提供帮助。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料为塔里木大学园艺与林学学院园艺试验站扁桃种质资源圃多年筛选的实生后代2株（先锋一号和桃巴旦），树龄为18 a。2022年3月1日，最低温达-4 ℃，采集2个实生后代的枝条近200根，每个枝条带10个叶片。用自来水冲洗，除去表面污染物，再用蒸馏水冲洗3次，用干净的滤纸吸干外界水分，放入报纸中，做好标记备用。

1.2 试验设计

用低温实验箱进行低温处理，设置4、2、0、-2、-4 ℃共5个低温处理，分别持续1、2、3、4 h，共20个处理。每个测定3次重复，枝条经低温胁迫处理后，用液氮速冻放入-80 ℃超低温冰箱备用。

1.3 生理指标的测定方法

相对电导率（REC）的测定参考毕润霞等^[19]的电导率法；丙二醛（MDA）含量、游离脯氨酸（Pro）含量、可溶性蛋白质（WSP）含量的测定参考李合生^[20]的方法；可溶性糖（WSS）含量的测定参考高俊风^[21]的方法；愈创木酚法测定过氧化物歧化酶（POD）活性^[22]；氮蓝四唑（NBT）光化还原法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性^[23]；紫外吸收法测定过氧化氢酶活性（CAT）；苯丙氨酸法测定苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性，领苯二酚法测定多酚氧化酶（PPO）活性。

1.4 统计分析

原始数据用Microsoft Excel软件进行预处理和绘图，预处理后的数据用方差分析的SPSS 22.0软件进行分析，利用origin 2022软件进行相关性分析与制图。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对2个扁桃后代电解质渗出率的影响

许多逆境引起的伤害首先都发生在质膜上^[24]。在相同处理时间内不同的低温处理下，-2 ℃时2个扁桃优株的电导率显著高于其他处理（图1）。在同一低温不同持续时间的处理下，2个优株表现出不同的趋势，先锋一号的后代和桃巴旦的后代在-2 ℃处理时随着处理时间的延长分别呈先下降后上升和先上升后下降趋势。先锋一号的后代和桃巴旦的后代在（-2 ℃、4 h）处理下电导率显著高于（-2 ℃、3 h）处理（1.7倍、2.4倍），说明细胞膜在一定温度范围内受到了严重伤害。

2.2 低温胁迫对2个扁桃后代丙二醛含量的影响

丙二醛是膜脂过氧化的最终产物，也是膜系统损伤的典型指标之一^[24]。在同一处理时间内，不同低温处理的2个优株丙二醛含量变化趋势基本一致，MDA含量随温度下降而升高（图2）。随着温度的逐渐下降，丙二醛的含量先是迅速上升，当温度达到-4 ℃时，先锋一号的后代的丙二醛含量上升缓慢。4 h条件下，先锋一号的后代和桃巴旦的后代在（2 ℃、4 h）、（0 ℃、4 h）、（-2 ℃、4 h）、（-4 ℃、4 h）处理的MDA含量分别较（4 ℃、4 h）处理增加21.72%、96.63%、98.50%、22.10%和103.57%、69.05%、117.26%、98.81%。MDA含量的大幅增加，说明扁桃叶片的膜透性增加，细胞膜系统受到严重损伤。

2.3 低温胁迫对2个扁桃后代可溶性蛋白含量的影响

可溶性蛋白有利于细胞维持渗透压平衡，提高抗寒性^[25]。2个优株可溶性蛋白质含量在4 h时随温度降低呈现缓慢上升趋势，上升幅度较小（图3）。在同一低温不同胁迫时间处理下，先锋一号的后代的可溶性蛋白含量变化趋势一致，随处理时间延长呈先上升后下降趋势。-4 ℃条件下除（-4 ℃、1 h）处理外，（-4 ℃、2 h）、（-4 ℃、3 h）、（-4 ℃、4 h）处理间差异不显著（图3-a）。桃巴旦的后代的可溶性蛋白含量变化趋势不同，-2 ℃条件下各时间处理均显著低于（-2 ℃、1 h）处理，分别较（-2 ℃、1 h）处理降低9.10%、5.45%、4.85%。

2.4 低温胁迫对2个扁桃后代可溶性糖含量的影响

可溶性糖作为一种渗透调节物质，在植物抗寒能力调节中起着重要作用^[25]。在不同的低温处理下，2个优株在4 h时的可溶性糖含量变化趋势不同（图4），先锋一号的后代随温度降低呈先下降后上升趋势，在（2 ℃、4 h）、（0 ℃、4 h）、（-2 ℃、4 h）、（-4 ℃、4 h）处理的可溶性糖含量较（4 ℃、4 h）处理分别降低18.68%、26.72%、15.23%、19.83%，随着温度降低，桃巴旦的后代的可溶性糖含量总体呈上升趋势。桃巴旦的后代在（2 ℃、4 h）、（0 ℃、4 h）、（-2 ℃、4 h）、（-4 ℃、4 h）处理的可溶性糖含量较（4 ℃、4 h）处理分别增加35.47%、88.18%、17.24%，在（-4 ℃、4 h）处理的可溶性糖含量较（4 ℃、4 h）处理减少8.87%。在同一低温下，先锋一号的后代的可溶性糖含量随处理时间延长呈先降后升趋势，桃巴旦的后代在0 ℃以下的各处理与先锋一号的后代的变化趋势一致。

2.5 低温胁迫对2个扁桃后代脯氨酸含量的影响

作为最重要的有机渗透调节物质之一，植物组织中脯氨酸含量的增多可以提高植物的抗寒性^[25]。在同一处理时间内，2个优株的脯氨酸含量变化趋势不同（图5）。随着温度的降低，先锋一号的后代在4 h条件下的脯氨酸含量呈先下降后上升趋势。桃巴旦的后代在4 h条件下的脯氨酸含量呈先上升后下降再上升趋势，2个优株在（-2 ℃、4 h）处理均达到最小值。在相同低温处理下，2个优株在-2 ℃下的脯氨酸含量随处理时间延长均呈先上升后下降趋势，先锋一号的后代和桃巴旦的后代在（-2 ℃、4 h）处理较（-2 ℃、1 h）处理分别降低15.08%和33.47%。

2.6 低温胁迫对2个扁桃后代POD活性的影响

POD是低温胁迫下避免膜脂过氧化、维持膜完整性的主要酶^[24]。随着温度降低，2个优株的POD活性变化趋势不同（图6）。先锋一号的后代在4 h时的POD活性呈先升高后降低再升高趋势，在4 h条件下最低值出现在（-2 ℃、4 h）处理，为195.65 U/g，较（4 ℃、4 h）处理降低了40.91%，桃巴旦的后代在4 h时的POD活性呈先下降后上升再下降趋势，最低值出现在（-4 ℃、4 h）处理，为227.51 U/g，较（4 ℃、4 h）处理降低了55.10%。随着处理时间延长，2个优株的POD活性变化趋势亦不同。先锋一号的后代和桃巴旦的后代在0 ℃以下的处理分别呈先降后升和先升后降趋势。

2.7 低温胁迫对2个扁桃后代SOD活性的影响

SOD是一种重要的膜保护酶，其活性可反映细胞对低温胁迫的适应性^[24]。在相同的处理时间内，2个优株的SOD活性变化趋势不同（图7）。随着胁迫温度的降低，先锋一号的后代在4h时的SOD活性呈先降低后升高趋势，在（0 ℃、4 h）处理降低幅度最大，较（4 ℃、4 h）处理降低了47.90%。桃巴旦的后代在4h时的SOD活性呈缓慢上升趋势，在（-4 ℃、4 h）处理下出现最高值，达675.03 U/g，较（4 ℃、4 h）处理增加了81.37%。在相同低温处理下，随着处理时间的延长，2个优株在0 ℃以下的处理均呈先下降后上升再下降趋势。

2.8 低温胁迫对2个扁桃后代CAT活性的影响

CAT在保护细胞内成分的活性状态方面起着重要作用。CAT对温度也有一个适应过程^[24]。在不同低温处理下，2个优株的CAT活性表现出相同的规律（图8）。2个优株在3 h时的CAT活性随着温度降低呈下降趋势，（2 ℃、3 h）、（0 ℃、3 h）、（-2 ℃、3 h）和（-4 ℃、3 h）处理较（4 ℃、3 h）处理分别降低42.91%、66.26%、55.32%、68.08%和50.15%、61.97%、23.67%、25.68%。在同一低温处理下，随着胁迫时间的增加，先锋一号的后代在温度为4 ℃和-2 ℃时的CAT活性呈先升高后降低趋势，桃巴旦的后代在-2 ℃时的CAT活性呈下降-上升-下降趋势，桃巴旦的后代在0 ℃时呈先升高后降低趋势。

2.9 低温胁迫对2个扁桃后代PPO活性的影响

PPO的活性变化与低温胁迫时间有关。在相同时间处理下，2个优株的PPO活性变化趋势不同（图9）。随着温度降低，先锋一号的后代在4 h时的PPO活性呈先升后降趋势，（2 ℃、4 h）处理达到峰值，较（4 ℃、4 h）处理增加约1.3倍，表明扁桃通过增加PPO活性适应低温胁迫的能力是有限的。桃巴旦的后代在4 h时的PPO活性初期缓慢下降，而后大幅上升，然后再下降，（0 ℃、4 h）处理达到峰值，较（4 ℃、4 h）处理增加约6倍。在相同温度处理下，随着处理时间的延长，先锋一号的后代和桃巴旦的后代在-4 ℃时的PPO活性分别呈现先降后升和先升后降趋势。

2.10 低温胁迫对2个扁桃后代PAL活性的影响

PAL的活性变化与低温胁迫有关。在同一时间处理下，随着温度降低，2个优株在4 h时的PAL活性均呈先降后升趋势（图10）。先锋一号的后代和桃巴旦的后代分别在（-2 ℃、4 h）和（2 ℃、4 h）处理出现最低值（1.92、0.43 U/g），较（4 ℃、4 h）处理分别降低了53.85%和89.25%，先锋一号的后代在（0 ℃、4 h）、（-2 ℃、4 h）、（-4 ℃、4 h）处理之间差异不显著，桃巴旦的后代在（4 ℃、4 h）、（-2 ℃、4 h）、（-4 ℃、4 h）处理之间差异不显著。2个优株在初期（4 ℃、4 h）处理时PAL酶活性较高。在相同温度处理下，2个优株的PAL活性变化趋势不同。先锋一号在0 ℃和-2 ℃的PAL活性随处理时间延长呈下降趋势，在-4 ℃时呈升高趋势。先锋一号的后代在-2 ℃时（-2 ℃、2 h）处理增加幅度最大，桃巴旦的后代在-4 ℃时呈下降趋势。

2.11 不同生理指标之间相关性分析

从图11可以看出，MDA与POD、SOD之间存在显著的相关性（P<0.05），MDA与POD之间存在显著的正相关，MDA与SOD之间存在显著的负相关。SOD与CAT、PAL之间的相关性达到极显著的水平（P<0.01）。SOD与PAL之间的相关性达到极显著正相关的水平。各指标之间存在或多或少的相关性，且每一指标与至少另一指标具有显著或极显著的相关性。各指标间存在密切的生物学相关性，共同抵御低温带来的不利影响。

3 结论与讨论

低温胁迫是北方果树普遍的一种自然灾害，长期的极低温度及早春的大幅度变温容易导致扁桃发生冻害。在长期低温胁迫下，植物细胞膜会形成机械损伤，引起枝条抽干或死亡。低温强度是植物发生冻害的主要原因，植物抗寒性与低温、低温持续时间长短关系密切^[26]。

在低温胁迫下，植物需要兼顾细胞的行为和活性，特别是保持具有生物活性的细胞膜和蛋白质结构的稳定性，才能在逆境中生存^[27]。相对电导率是判断植物抗逆性强弱的重要指标，能够反映细胞膜受损程度^[28]。丙二醛（MDA）也被认为是植物氧化应激和细胞膜对低温响应的有机统一性的可靠标志^[29]。在本研究中，随着温度的降低，2个优株的相对电导率和丙二醛含量总体呈上升趋势，在-2 ℃处理下大幅度上升，-4 ℃处理下急剧下降，与杨春祥等^[30]、祝成瑶^[31]的研究结果一致，前者说明一定的低温对细胞膜造成了伤害，在低温胁迫下扁桃发生应激反应。但是持续的降温导致相对电导率和丙二醛含量降低，分析原因可能是低温造成细胞膜严重受损，膜脂过氧化程度降低造成。

可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸是可以提升能量，提高细胞质浓度和信号转导的重要调节物质^[32]。本试验中，3种物质在低温处理的后期均表现出上升的趋势，先锋一号的后代在前期的可溶性蛋白含量趋势与后期的表现趋势基本一致，分析原因可能是随着胁迫温度的降低，植株体内的淀粉等大分子物质的分解速度会加快，从而使其含量不断上升；提高了细胞液的含量，提高了保水性，减少了组织水势，减少了结冰，细胞渗透压进一步调节。因此可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸在植物对抗低温胁迫中发挥着重要作用。而在低温处理的前期，先锋一号的后代的脯氨酸和可溶性糖含量均呈下降趋势，分析原因可能是脯氨酸在初期参与指导蛋白质的合成因此降低，初期可溶性糖含量积累较少可能是导致先锋一号抗寒性弱的原因之一。在仁用杏^[33]、葡萄^[34]、香蕉^[35]、睡莲^[36]等植物上也发现了类似的结果，说明在遭受低温胁迫时，扁桃叶片可通过代谢增加体内渗透调节物质，从而保护机体免受低温伤害。

在低温胁迫下植物同样会产生一些自我保护的物质如POD、CAT、SOD等保护酶，它能将有害过氧化物分解掉，以便减缓对植物细胞的伤害^[37]。本试验中，相同时间下，2个优株的SOD、POD酶活性随温度的降低均呈现波状变化，即SOD和POD在胁迫的初期活性上升而后下降，然后再上升，分析原因可能是低温条件下，植株的正常氧化代谢受到抑制，活性氧生成迅速，从而增加了植物的抗氧酶活力；结果表明，SOD、POD酶活力随胁迫温度的降低而降低，说明其细胞的结构已被破坏，从而使其对活性氧的清除能力减弱。这与冯昌军等^[38]、叶亚新等^[39]、张溪荷等^[40]的结论相似。低温胁迫下CAT酶活性并不总是增加，相同时间下，2个优株的CAT酶活性随胁迫温度的降低呈降低趋势，说明扁桃叶片的CAT酶活性在较低的低温胁迫下可能受到了限制，在黄瓜幼苗和约书亚树幼苗叶片中都存在此现象^[41-42]。

多酚氧化酶是一种具有促进多酚的生物降解的主要酶，其作用是将多酚氧化酶转化为苯二酚，提高植物的抗逆性^[43]。苯丙氨酸解氨酶（PAL）是酚类物质中最重要的限制速度的酶^[44]，其对植株的抗性起着重要的促进作用。本研究中，随着胁迫时间延长，先锋一号的后代和桃巴旦的后代在-2和-4 ℃时的PPO活性均呈先上升后下降的趋势，不论胁迫时间如何，桃巴旦的后代在-4 ℃处理下，PPO耐冷系数最高。先锋一号的后代和桃巴旦的后代在-4和-2 ℃时的PAL活性与上述的变化规律一致，说明扁桃叶片通过提高PPO、PAL活性适应低温胁迫的能力是有限的，这与谢小玉等^[45]的研究结果一致，与蔡建超等^[46]的研究结果不太一致，推测可能是扁桃存在特有的调控机制，具体原因有待进一步研究。

本研究表明，桃巴旦后代的低温耐性显著优于先锋一号的后代，桃巴旦后代的抗寒性突出，表现在桃巴旦的后代在-2 ℃低温胁迫处理下生理特性显著的优于先锋一号的后代，因此，桃巴旦的后代的抗寒性特性可作为优良砧木的特征。

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基金资助

新疆维吾尔自治区科技创新基地建设项目(PT1806)

新疆建设兵团重点领域科技攻关项目(2021AB022)

塔里木大学校长基金项目(TDZKSS202159)