77份山西黍稷DNA二维码身份证的构建

Construction of 77 Two-Dimensional DNA Identity Cards of Shanxi Broomcorn Millet

摘要

为了更好地管理黍稷资源，分辨其身份以及追溯来源，创建一个高效可行的种质资源鉴定系统十分必要。以山西省内各地77份黍稷资源为材料，用上海生工生物股份有限公司合成上游5'端加FAM （blue）荧光基团标记对77份黍稷资源进行PCR及毛细管电泳。结果发现，仅用5个标记组合（RYW3、RYW6、RYW20、RYW37和RYW40）可区分全部材料。其中，组合RYW6+RYW37可区分60份；组合RYW6+RYW20+RYW37可区分69份；组合RYW6+RYW20+RYW37+RYW40可区分73份；组合RYW3+RYW6+RYW20+RYW37+RYW40可区分全部77份。77份材料在8个位点共检出79个等位变异，每个位点检出平均为9.875个，检测到的有效等位变异（Ne）为2.675 9，Shannon多样性指数（I）为0.991 6，Nei's基因多样性指数（Nei）为0.426 0，多样性信息含量（PIC）为0.553 3。在此基础上，利用ID analysis 4.0在线条形码生成器将对应字符串生成可扫描的条形码 DNA 分子身份证；利用二维码在线技术将材料基本信息转化成可扫描的二维码DNA分子身份证。

Abstract

In order to better manage broomcorn millet resources, distinguish their identities and trace their sources, it is necessary to create an efficient and feasible germplasm resource identification system. In this study, 77 broomcorn millet resources in Shanxi Province were used as the materials. PCR and capillary electrophoresis were carried out on 77 broomcorn millet resources with FAM(blue) fluorescent group labeling at the upstream 5 ' end synthesized by Shanghai Sangon Biological Co., Ltd. It was found that only five marker combinations(RYW3, RYW6, RYW20, RYW37, and RYW40) could distinguish all materials. Among them, the combination of RYW6+RYW37 could distinguish 60 materials, the combination of RYW6+RYW20+RYW37 could distinguish 69 materials, the combination of RYW6+RYW20+RYW37+RYW40 could distinguish 73 materials, and the combination of RYW3+RYW6+RYW20+RYW37+RYW40 could distinguish all 77 materials. A total of 79 alleles were detected in 77 materials at 8 loci, with an average of 9.875 detected at each locus. The effective allele variation(Ne) detected was 2.675 9, Shannon diversity index(I) was 0.991 6, Nei's gene diversity index(Nei) was 0.426 0, and polymorphism information content(PIC) was 0.553 3. On this basis, the ID analysis 4.0 online barcode generator was used to generate a scannable barcode DNA molecular identity cards. Using two-dimensional code online technology, the basic information of the materials was transformed into scannable two-dimensional code DNA molecular identity cards.

Graphical abstract

关键词

SSR / 黍稷 / 二维码 / 山西

Key words

SSR technology / broomcorn millet / two-dimensional code / Shanxi

黍稷（Panicum miliaceum L.），又名黍子、稷子、糜子、糜黍，具有早熟、生育期短，耐旱、水分利用效率高，耐瘠、丰产潜力大等特性。它是干旱半干旱地区人们日常生活保障的特色粮食作物，也是重要的救灾作物^[1-2]。黍稷是起源于中国黄河流域黄土高原地区最古老的作物^[3]，而山西是其起源中心和种质资源的遗传多样性中心。目前，全世界有26 197份黍稷资源保存在中国、俄罗斯、印度、美国、乌克兰、波兰、墨西哥、日本的10家研究机构中，中国国家种质资源库现有黍稷资源9 885份，其中山西有1 592份^[4-6]。近年来，由于新种质资源的不断收集、引进和分散保存，造成种质间重复引进、同种异名、同名异种以及亲缘关系不清等问题，而且目前对黍稷资源进行系统化整理的研究也很少^[7]，严重影响了其高效利用。因此，打造一个准确可靠、操作便捷的鉴定体系成为当务之急。SSR（Simple sequence repeats，SSR）又称微卫星，是广泛应用于作物染色体图谱构建、品种选育鉴定等方面的DNA分子标记技术^[8]。DNA分子身份证是在SSR基础上，将不同资源基因层面的差异用数字转化成字符串、条形码和二维码，使每份资源拥有特定的数字代码，便于保护种质资源的知识产权^[9-11]。本研究拟利用8个SSR标记来分析山西省不同市县的77份黍稷种质资源，通过构建条形码DNA分子身份证和二维码DNA分子身份证，旨在为种质资源精准鉴定创造高效便捷条件。

1 材料和方法

1.1 供试材料

试验材料来源如表1所示。

本研究所用黍稷资源共77份，来自山西省各地区（大同市13份：灵丘县3份、浑源县2份、天镇县5份、怀仁县2份、阳高县1份；朔州市11份：朔城区4份、应县5份、平鲁区2份；忻州市22份：代县2份、河曲县5份、偏关县1份、岢岚县1份、五台县9份、保德县2份、五寨县2份；太原市4份：尖草坪区3份、阳曲县1份；阳泉市3份：城区1份、盂县1份、平定县1份；晋中市13份：榆次区3份、昔阳县1份、平遥县2份、寿阳县2份、和顺县1份、太谷县1份、介休市2份、榆社县1份；吕梁市5份：方山县1份、汾阳市1份、柳林县1份、离石区1份、文水县1份；长治市襄垣县1份；临汾市襄汾县1份；运城市4份：万荣县1份、闻喜县3份），详见表1。

1.2 基因组DNA提取与质量检测

77份材料种植于人工气候箱中，剪取三叶期黍稷叶片，采用改良CTAB法^[12]提取基因组DNA，DNA质量检测方法同石甜甜等^[13]。

1.3 引物选择

毛细管电泳荧光引物为单色荧光，用上海生工生物股份有限公司合成上游5'端加FAM（blue）荧光基团标记对77份黍稷材料进行PCR扩增及毛细管电泳。8对荧光SSR标记信息见表2。

1.4 构建分子身份证

用Gene Marker V2.2.0读取数据，获得SSR扩增片段的精确分子量，并进行数字+英文字母编码。将每对标记扩增所有样品的不同带型，按分子量从大到小用数字1~9依次表示，超出9的用英文字母A~Z依次表示，无带用0表示。用PopGen 1.32^[14]计算遗传多样性指数，用PowerMarker 3.25^[15]分析多态性信息含量（PIC），采用资源特征分析软件ID Analysis 4.0确定标记及标记顺序，构建字符串形式的DNA分子身份证^[16]。利用在线条形码生成器（http：//barcode.cnaidc.com/app/html/bcgcode128.php）将对应字符串生成可扫描的条形码DNA分子身份证；利用二维码在线技术（https：//cli.im/）将材料基本信息（包括名称、统一编号、来源地和字符串DNA分子身份证）转化成可扫描的二维码，即二维码DNA分子身份证。

2 结果与分析

2.1 基于荧光SSR的山西黍稷核心种质的遗传多样性

用8对荧光SSR标记，扩增77份山西黍稷核心种质，分析其遗传多样性，结果见表3。

由表3可知，77份材料在8个位点共检出79个等位变异，每个位点检出4~29个（平均9.875个）；检测到的有效等位变异（Ne）为1.13（RYW18）~9.38（RYW37），平均值为2.68；Shannon多样性指数（I）为0.29（RYW18）~2.63（RYW37），平均值为0.99；Nei's基因多样性指数（Nei）为0.12（RYW18）~0.89（RYW37），平均值为0.43；多样性信息含量（PIC）为0.25（RYW18）~0.95（RYW37），平均值为0.55。8个标记中有5个标记具有高度多态性（PIC>0.5），为高多态性SSR。

2.2 基于SSR的山西黍稷核心种质DNA分子身份证的构建

对毛细管电泳结果进行“数字”编码，将RYW3、RYW5、RYW6、RYW18、RYW20、RYW35、RYW37和RYW40引物的特征编码结合形成特定的字符串。鉴定8对荧光SSR对供试材料的区分程度，发现任何1对荧光SSR均不能将全部供试种质资源分开。分子身份证的最终目的是对所有供试材料赋予可辨的分子身份证，同时又要满足用最少的标记区分最多材料的要求。因此，通过逐步增加标记设定标记组合，筛选可以将全部材料完全区分的标记。整合PIC值大和区分率高的荧光SSR标记，结果发现仅用5对标记即可区分全部材料。其中，组合RYW6+RYW37可区分60份；组合RYW6+RYW20+RYW37可区分69份；组合RYW6+RYW20+RYW37+RYW40可区分73份；组合RYW3+RYW6+RYW20+RYW37+RYW40可区分全部77份。单个荧光SSR标记对于黍稷种质的区分见表4，不同荧光SSR组合对于黍稷种质的区分见表5。

对毛细管电泳结果按表4进行数学+英文字母+符号编码，将RYW3、RYW6、RYW20、RYW37和RYW40用于DNA分子身份证的构建。按上述顺序将5对荧光SSR对应的编码组合，构成黍稷核心种质DNA分子身份证，即字符串DNA分子身份证，77份黍稷材料的字符串DNA分子身份证见表6。将上述字符串DNA分子身份证导入在线条形码生成器，获得条形码DNA分子身份证。将各供试材料的基本信息和字符串DNA分子身份证录入在线二维码生成框，得到二维码DNA分子身份证。77份黍稷材料的条形码和二维码DNA分子身份证见图1、2。

3 讨论

3.1 荧光SSR在黍稷遗传多样性上的应用

毛细管电泳检测技术具有一系列优点，在小麦^[17-18]、玉米^[19]、油菜^[20]、烟草^[21]等植物中广泛应用，但在黍稷上相关报道不多^[22-24]。王璐琳等^[23]用15对荧光SSR检测132份黍稷种质资源，引物平均等位基因数为7个，I值为0.529 8，PIC值为0.486 4。寇淑君等^[24]利用22对标记检测131份黍稷种质资源，平均每对SSR标记扩增出5.82个主要等位变异，I值为1.206 2，PIC值为0.587 4。本研究的平均等位基因数为9.875 0，I值为0.991 6，PIC值为0.553 3，具有较高的利用价值。

3.2 黍稷分子身份证的构建和实际应用

种质资源的分子身份证与其地理来源密切相关^[25-28]，地理来源接近的分子身份证类似^[29-32]；地理来源存在较大差异，则分子身份证很容易区别开来^[33-36]。陈巍等^[37]构建中国桃品种分子身份证，发现来源于吉林的吉林8501和吉林8601，其分子身份证分别为432566620382554和4325766103855545，极为相似；而分别来源于新疆的喀什3号和陕西的陕甘山桃，其分子身份证分别为4367566143957525和1502233222010434，差异较大。本试验也有类似结果。基于荧光SSR构建的分子身份证中，气死风粘糜（序号35）和灰粘糜（序号36）均来自忻州市五台县，其分子身份证分别为7A0k2和5A0k2，差别不大；而二白黍（序号7）和白软黍（序号61）来自大同和运城，其分子身份证分别为091d9和560H2，地理来源差异较大，其分子身份证也有较大差别。本研究利用5个SSR标记来构建77个黍稷种质资源的分子身份证，并结合图1的77份黍稷资源的条形码与二维码身份证表述材料信息，能够实现该作物种质资源更加高效规范的管理，为今后的种质资源管理提供依据。

4 结论

用5个荧光高基元SSR标记组合构建的77份山西黍稷资源二维码DNA分子身份证，为标准化管理该作物种质以及后续追溯作物来源提供了参考。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31271791)

国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-06-14.5-A16)

山西省现代农业产业技术体系建设（杂粮）项目(2022-03)

山西省重点研发项目(2022ZDYF110)