玉露香梨花青苷调控基因PbrMYB19的克隆及功能分析

Cloning and Functional Analysis of Anthocyanin Regulatory Gene PbrMYB19 in Yuluxiang Pear

摘要

花青苷含量决定了果实色泽，是衡量果实商品价值的重要指标之一，其生物合成受到MYB转录因子的调控，然而关于MYB负调控梨果实花青苷合成的机制尚未完全明确。基于前期转录组学数据的差异表达基因中筛选到1个MYB基因家族成员PbrMYB19，暗示其可能参与调控果实花青苷生物合成。为明确其结构和功能，为进一步解析PbrMYB19对果实花青苷的调控机制奠定基础，试验以玉露香梨果皮cDNA为模板，克隆PbrMYB19全长，利用生物信息学软件对该基因的结构、亲缘关系、保守结构域及顺式作用元件进行预测，采用qRT-PCR对不同颜色果皮中PbrMYB19基因表达水平进行分析，并通过果实瞬时表达系统验证其功能。结果表明，PbrMYB19基因开放阅读框为714 bp，编码237个氨基酸，分子质量为26.85 ku，预测亚细胞定位于细胞核。系统发育树分析结果表明，PbrMYB19与已报道花青苷转录抑制子FaMYB1和PbrMYB120在同一个进化分支上，且其蛋白C端存在EAR类似抑制序列。PbrMYB19基因启动子序列包含光调控元件、植物激素响应元件。通过qRT-PCR分析发现，红色和黄色果皮中PbrMYB19基因的表达水平显著高于绿色果皮。构建过表达载体和瞬时转化果实结果表明，PbrMYB19过表达显著抑制果皮花青苷积累。

Abstract

Anthocyanin content determines fruit color, which serves as a significant indicator for assessing the commercial value of fruits. The biosynthesis of anthocyanin is regulated by MYB transcription factors, however, the precise mechanism underlying the negative regulation of MYB on anthocyanin synthesis in pear fruit remains to be fully elucidated. Based on the previous transcriptomic data, a member of the MYB gene family, PbrMYB19, was screened out from the differentially expressed genes, suggesting that it may be involved in the regulation of fruit anthocyanin biosynthesis. To clarify its structure and function, and lay the foundation for further elucidating the regulatory mechanism of PbrMYB19 on fruit anthocyanins, in this study, the full-length PbrMYB19 was cloned by using the cDNA of Yuluxiang pear peel as a template. The structure, genetic relationship, conserved domain, and cis-acting elements of this gene were predicted via bioinformatics software. The expression level of PbrMYB19 gene in peels with different colors was analyzed by fluorescence quantitative PCR, and its function was verified by the fruit transient expression system. The results showed that the open reading frame of PbrMYB19 gene was 714 bp, encoding 237 amino acids, with a relative molecular weight of 26.85 ku, and the subcellular localization was predicted in the nucleus. Phylogenetic tree analysis showed that PbrMYB19 was on the same evolutionary branch as the reported anthocyanin transcription inhibitors FaMYB1 and PbrMYB120, and there was an EAR-like inhibitory sequence at the C-terminal of its protein.In addition, the promoter sequence of PbrMYB19 gene contained light regulation elements and plant hormone response elements. QRT-PCR analysis showed that the expression level of PbrMYB19 gene in red and yellow peels was significantly higher than that in green peels. Overexpression vector of PbrMYB19 gene was constructed, and the fruit was transiently transformed. It was found that PbrMYB19 overexpression significantly inhibited anthocyanin accumulation in peels.

Graphical abstract

关键词

梨 / PbrMYB19基因 / 克隆 / 系统发育树 / 功能验证

Key words

pear / PbrMYB19 gene / cloning / phylogenetic tree / functional verification

花青苷是一类重要的次生代谢产物，其含量决定多种水果颜色，是果实外观品质的重要指标之一^[1-2]。研究证明，花青苷具有较强的抗氧化活性，在生物和非生物胁迫中发挥着重要作用^[3]。此外，花青苷能清除自由基、抗肿瘤，有益于人体健康^[4]。果实花青苷的积累过程受激素、低温、高温、强光、UV-B辐射等因素的影响^[5]。目前，果实花青苷分子调控机制解析已成为植物次生代谢研究热点。

花青苷的生物合成途径在高等植物中高度保守^[6-8]。研究发现，苯丙氨酸氨解酶（PAL）、4-香豆基-辅酶A连接酶（4CL）、查尔酮合成酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）、类黄酮-3'-羟基酶（F3'H）、类黄酮-3'，5'-羟基酶（F3'5'H）、黄烷酮3-羟基酶（F3H）、二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）、花青素合成酶（ANS）和UDP-葡萄糖-类黄酮类3-O-葡萄糖基转移酶（UFGT）等参与花青苷的生物合成^[9-10]，而这些结构基因的表达受转录因子在转录水平上的调控，尤以R2R3-MYB、碱性-螺旋-环-螺旋和WD40蛋白组成的转录激活复合体（称为MBW复合体）研究最多^[11]。其中，MYB对花青苷的合成起到关键的调控作用^[12]。根据MYB所含的R基序不同，可以分为4类：R1-MYB、R3-MYB、R4-MYB和R2R3-MYB，其中隶属于第6亚族SG6的R2R3-MYB类参与激活花青苷的生物合成途径，例如苹果MdMYB10、MdMYB1和MdMYB110a，草莓FaMYB10，杨梅MrMYB1，梨PyMYB10、PyMYB114^[13-16]参与MBW复合体的形成，进而上调花青苷结构基因的表达水平^[17-19]。此外，也存在2类对花青苷生物合成起负调控的MYB抑制子：第1类是R3-MYB抑制子，当R3-MYB结合bHLH蛋白时，竞争性限制了MBW复合体的形成，造成了花青苷结构基因的转录活性的被动抑制^[20-21]。其已在番茄、越桔和沼泽越桔中鉴定出抑制果实花青苷积累的R3-MYB^[22-23]。第2类抑制子属于SG4的R2R3-MYB，能够直接抑制花青苷结构基因的表达，主要因为它们具有乙烯响应元件结合因子相关的两亲性抑制（EAR）基序^[21]。据报道，SG4 MYB在包括苹果、葡萄、桃子和草莓在内的许多水果品种中抑制果实花青苷的产生^[24-28]。

前期针对梨果实色泽变化的转录组数据研究发现，MYB家族成员基因PbrMYB19在果实色泽变化期间差异表达，但具体功能尚不清楚。本研究以玉露香梨果皮cDNA为模板，克隆调控果实花青苷的MYB转录因子基因PbrMYB19（Pbr013413），并对其结构、编码蛋白的理化性质进行生物信息学分析，同时构建过表达载体后在苹果果实上进行瞬时表达验证观察表型，以期为下一步解析和丰富梨果实中MYB类转录因子对花青苷合成的调控模式研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试梨品种为玉露香梨（Pyrus bretschneideri Rehd. cv. Yuluxiang），于2020年8月开始在山西农业大学园艺学院试验站收集转色期果实，立即运回实验室后用削皮刀削取果皮，液氮处理后储存至-80 ℃冰箱，用于RNA的提取。未着色的红星苹果（Malus domestica L. cv. Delicious）购于山西太谷农家果园。完成瞬时转化和花青苷诱导后，仔细削取菌液处理的果皮，用于花青苷含量测定。

1.2 玉露香梨PbrMYB19基因的克隆

用液氮将果皮研磨成粉末，运用改良CTAB法^[29-30]提取果皮的总RNA，按照cDNA试剂盒（TaKaRa）说明书将总RNA反转为cDNA后备用。

通过白梨基因组数据库（http://peargenome.njau.edu.cn/）获得PbrMYB19基因CDS序列，用Primer Premier 5.0软件设计引物（表1），PCR克隆目的基因。PCR反应体系：模板cDNA 2 μL，上下游引物（10 mol/L）各1 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，加DEPC水至20 μL。PCR反应程序：94 ℃预热6 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环。之后，PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，将回收纯化后的电泳产物与入门克隆载体PNC-AEnTopo连接，筛选阳性克隆后送至通用生物（安徽）股份有限公司，利用SnapGene 4.1.9软件对测序得到的PbrMYB19编码区序列进行比对。

1.3 PbrMYB19基因的生物信息学分析

利用DNAMAN软件对PbrMYB19基因进行氨基酸翻译和多重序列比对，利用在线分析工具ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）进行蛋白特性分析，利用在线分析工具Protscale（https://web.expasy.org/protscale/）进行亲疏水性分析，利用在线分析工具NetPhos 3.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）进行磷酸化位点预测，利用在线分析工具SignalP（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）进行信号肽分析，利用NCBI网站CCD工具（https://ww.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）进行蛋白保守结构域分析，利用在线分析工具SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_ sopma.html）进行蛋白二级结构预测，利用在线分析工具SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）进行蛋白三级结构预测，利用在线分析工具Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）进行亚细胞定位预测分析，利用MEGA.07进行系统进化树构建，利用在线分析工具PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析顺式作用元件^[31]。

1.4 PbrMYB19在苹果果实中瞬时表达

利用Nimble Cloning（NC）克隆方法^[32]，将连接入门载体PNC-AEnTopo的PbrMYB19基因导入PNC-Cam2304过表达载体，重组载体命名为PbrMYB19-OE。之后将过表达载体导入农杆菌EHA105并划线培养，挑取单菌落加入1 mL LB液体培养基（含抗生素）在28 ℃、180 r/min摇床中培养，随后将1 mL菌液倒入50 mL液体培养基中在28 ℃、180 r/min摇床中培养12~16 h。离心收集菌体，弃去培养基，利用重悬液将菌体重悬，调节OD₆₀₀至0.3左右，遮光室温培养3 h。用5 mL注射器吸取重悬菌液，将针头缓慢插入苹果表皮注射重悬菌液，后将苹果放入光照培养箱中诱导3~5 d。

1.5 基因的表达分析

分别在果实成熟前期、成熟后期和贮藏期收集玉露香梨果皮，分别呈现绿色、红色、黄色。利用试剂盒SYBR Premix Ex Taq Ⅱ kit（Vazyme）进行实时荧光定量PCR。利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物（表1），对荧光值变化曲线和熔解曲线进行分析后，通过2^-∆∆Ct方法计算PbrMYB19在不同处理时期的相对表达量。每个处理重复3次，每个重复有5~7个果实。

1.6 花青苷含量测定

参考UBI等^[33]的方法，盐酸-甲醇溶液（V∶V=1∶99）浸提，使用分光光度计在530、620、650 nm处测定吸光度值。

1.7 数据处理

采用Microsoft Excel 2017进行数据整理和图表制作，采用SPSS 21.0软件进行统计分析，采用AVONA进行各处理间的显著性检验（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 玉露香梨PbrMYB19基因的克隆与理化性质分析

PbrMYB19基因序列与氨基酸序列如图1所示。

以玉露香梨果皮cDNA为模板，PCR扩增并进行亚克隆测序，结果显示（图1），PbrMYB19基因完整的开放阅读框长度为714 bp，共编码237个氨基酸，与梨基因组数据库中序列对比一致。理化性质分析表明，PbrMYB19分子质量为26.85 ku，分子式为C₁₁₅₆H₁₈₅₄N₃₅₆O₃₆₀S₁₁，总原子数为3 737个，理论等电点pI为8.90；不稳定指数为49.13，被归类为不稳定蛋白。PbrMYB19编码蛋白含有带正电荷的氨基酸残基（Asp+Glu）28个，含有带负电荷的氨基酸残基（Arg+Lys）34个。

2.2 PbrMYB19蛋白的结构分析

通过Conserved Domain Search对PbrMYB19基因编码的蛋白保守结构域进行分析，结果显示，其属于PLN03091超基因家族（图2-A）。对PbrMYB19基因编码蛋白进行磷酸化位点预测，结果表明（图2-B），PbrMYB19基因含有7个Thr位点，1个Tyr位点，19个Ser位点。信号肽分析结果显示，该蛋白不存在信号肽。亲疏水性分析结果表明，该基因编码蛋白亲水的氨基酸（负值）多余疏水的氨基酸（正值），属于亲水蛋白，其中，第80位分值最高，为2.100，疏水性最强；第125位分值最低，为-3.156，亲水性最强（图2-C）。

对PbrMYB19基因编码的蛋白进行二级结构预测，结果显示（图2-D），该蛋白α-螺旋占比为36.71%，延伸链占比为5.06%，β-转角占比为5.91%，自由卷曲占比为52.32%。PbrMYB19基因编码的蛋白含有多个β/α/β类Rossmann折叠区域（图2-E）。此外，利用在线分析工具Plant-mPLoc进行亚细胞定位预测分析，结果表明，PbrMYB19基因编码的蛋白位于细胞核中。

系统进化树分析表明（图3-A），梨PbrMYB120和草莓FaMYB1对花青苷的生物合成起负向调控的作用^[18,26]，而梨PbrMYB19也聚类于这一进化分支，推测PbrMYB19具有相似的功能。PbrMYB19的氨基酸序列与拟南芥AtMYB4、草莓FaMYB1、马铃薯PhMYB4、白梨PbrMYB120进行多重序列比对，结果显示（图3-B），PbrMYB19的C端有与FaMYB1、PbrMYB120等相似的EAR抑制序列。

2.3 PbrMYB19基因启动子顺式元件分析

对PbrMYB19基因起始密码子前2 000 bp序列顺式元件预测分析，结果发现（表2），PbrMYB19基因启动子除含有典型的TATA-box和CAAT-box核心启动子元件外，还含有4个光响应元件GT1-motif、2个脱落酸反应顺式作用元件ABRE、1个厌氧诱导所需元件ARE、1个分生组织表达调控元件CAT-box、1个赤霉素响应元件P-box和1个MYB结合位点MYB-binding site。

2.4 PbrMYB19基因的表达分析

PbrMYB19基因的相对表达量情况如图4所示。

从图4可以看出，PbrMYB19基因在绿色、红色、黄色果皮中均有表达，但在绿色果皮中的表达量明显低于在红色和黄色果皮中，在红色和黄色果皮中表达量无明显差异。

2.5 PbrMYB19基因功能验证

为了进一步验证PbrMYB19基因的功能，构建了该基因的过表达载体，导入农杆菌EHA105。之后，将农杆菌用重悬液悬浮注射苹果表皮，以含有空载体的农杆菌作为对照，经过在光照培养箱内诱导花青苷，结果发现，苹果表皮注射PbrMYB19过表达载体部位没有红色产生，而对照仍然变红（图5-A）。其中，PbrMYB19过表达处理后花青苷含量是对照的27.99%（图5-B）；与之相反，PbrMYB19基因在过表达部位表达量明显高于对照（图5-C）。可见，过表达PbrMYB19对果实中花青苷的生物合成起到抑制作用。

3 结论与讨论

衡量玉露香梨果皮着色的一个重要的指标是花青苷的含量多少，而MYB转录因子通过转录调控酶的表达进而影响花青苷的合成。本研究从玉露香梨果皮中克隆了PbrMYB19基因，通过对其生物信息分析显示，PbrMYB19开放阅读框有714 bp，编码237个氨基酸，属于转录因子MYB基因家族R2R3-MYB类中的一员。前人的研究已表明，PbrMYB120和FaMYB1是花青苷合成调控的转录抑制子^[18,26]，预测进化树同为一支的PbrMYB19可能对花青苷合成起抑制的作用。序列比对发现，PbrMYB19在C端存在1个EAR抑制基序，结合已发现的苹果MdMYB32的EAR基序可以影响ANS的表达水平^[34]，MdMYB16的EAR基序可以影响UFGT和ANS的启动子活性^[35]，进一步说明PbrMYB19具有花青苷抑制子功能。更重要的是，qRT-PCR分析发现，PbrMYB19基因在绿色果皮与红色和黄色果皮中的表达差异显著，而果皮从绿色转变为红色和黄色又是由光照引起的，且PbrMYB19基因的启动子序列中存在光响应元件，说明PbrMYB19基因的表达可能与光照有关。此外PbrMYB19基因的启动子区域还存在多种植物激素响应元件，说明PbrMYB19基因的表达可能也受到了激素的影响。

利用果实瞬时表达技术验证花青苷调控基因的功能已有广泛报道^[36]。本研究尝试用转色期玉露香梨果实注射过表达载体，以期获得抑制果实花青苷积累的表型。然而，玉露香梨果实含水量较高，果实注射孔腐烂严重，导致同源表达试验失败。对于遗传转化体系较困难的木本植物，异源表达验证基因功能也是常用的手段之一。例如，LI等^[37]利用烟草和草莓花托，通过瞬时表达系统验证了梨花青苷调控基因PyWRKY31或PyWRKY26与其伴侣PyMYB10、PyMYB114和PybHLH3共转化后促进花青素的积累效果。所以，本研究选择较易着色的苹果果实异源过表达PbrMYB19基因，结果发现，该基因参与果实着色和花青苷负调控作用。总之，PbrMYB19基因过表达能够抑制果实花青苷积累，具体调控机制还需进一步验证。

本研究通过克隆和生物信息学分析玉露香梨果皮的PbrMYB19基因，结果发现，其编码的蛋白质具有MYB转录因子家族的特征，并在进化上与已知的花青苷合成抑制子PbrMYB120和FaMYB1密切相关。进一步的qRT-PCR分析揭示了PbrMYB19在不同色泽果皮中的表达差异，以及其启动子中光响应元件的存在，暗示了光照和植物激素可能对其表达有影响。通过在苹果果实中的异源过表达试验，研究证实了PbrMYB19基因能够抑制花青苷的积累。研究结果为深入理解PbrMYB19在梨果着色过程中的调控机制奠定了基础，并为未来梨果品质改良提供了分子层面的参考。

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基金资助

山西省高等学校科技创新项目(2021L101)

山西农业大学科技创新基金项目(2017YJ45)

山西农业大学大学生创新创业训练项目(20-100)