基于LiCl法优化酿酒葡萄叶片的RNA提取

Optimization of RNA Extraction from Wine Grape Leaves Based on LiCl Method

摘要

为获得纯度高、质量好的酿酒葡萄植株叶片RNA以用于荧光实时定量分析，为后续以酿酒葡萄叶片RNA为材料研究相关转录水平的调控提供技术保障，以经典酿酒葡萄赤霞珠叶片为试验材料，比较分析了重蒸酚法、Trizol法、改良的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法和LiCl法（基于改良的SDS法）4种方法对酿酒葡萄叶片RNA提取的影响。结果表明，重蒸酚法提取RNA浓度较低，完整性较差，存在部分降解；Trizol法提取的RNA则有部分DNA污染；改良CTAB法提取浓度较高，但蛋白和DNA污染严重；LiCl法提取结果显示，28S的条带亮度是18S的2倍，条带无拖尾，完整性较好，存在DNA污染和少量的蛋白污染。进一步在LiCl法基础上利用醋酸钠、DNAase消化、苯酚抽提法进一步优化，并采用荧光实时定量验证，结果表明，醋酸钠的加入RNA质量无明显改善；然而，经氯仿和水饱和酚（体积比1∶1）抽提2次，氯仿抽提1次，氯仿和水饱和酚（体积比1∶1）抽提1次，并经DNAase进行消化，最终提取出质量浓度为173.611 µg/mL、A_260/280为1.803纯度高、完整性较好且无蛋白和DNA污染的葡萄叶片总RNA；经实时荧光定量PCR进一步验证，该方法提取的RNA经反转录后获得较好的扩增曲线以及融解曲线，并能够对相关基因进行定量分析。

Abstract

In order to obtain RNA from wine grape leaves with high purity and good quality for fluorescence real-time quantitative analysis，and to provide technical support for subsequent studies on the regulation of transcription levels using wine grape leaf RNA as materials and have certain application value, in this study, classic wine grape Cabernet Sauvignon leaves were used as the experimental materials. Effects of four methods，including resteaming phenol，Trizol，improved cetyltrimethyl ammonium bromide(CTAB), and LiCl(based on improved SDS)，on RNA extraction from wine grape leaves were compared and analyzed. The results showed that the concentration of RNA extracted by resteaming phenol was low，the integrity was poor，and there was partial degradation．In addition，the RNA extracted by Trizol method had some DNA contamination．In the modified CTAB method，the extraction concentration was high，but the protein and DNA contamination was serious．In the RNA swim lane extracted by LiCl method，the brightness of the 28S band was twice of that of the 18S band．The band has no dragging phenomenon，and the extracted RNA integrity was good，but there was still DNA contaminationn and a small amount of protein contamination．Further，on the basis of LiCl method，sodium acetate, digestion by DNAase, and phenol extraction method were used for optimization. The results showed that the addition of sodium acetate did not improve the quality of RNA．However，total RNA from grape leaves with high purity，good integrity, and no protein and DNA contamination (173.611 µg/mL，A_260/280=1.803) was extracted by extracting chloroform and water-saturated phenol(1∶1) twice，chloroform once, chloroform and water-saturated phenol(1∶1) once，and digestion by DNAase．The results of real-time fluorescence quantitative PCR further verified that the RNA extracted by this method obtained good amplification curve and melting curve after reverse transcription，and could be used to quantitatively analyze related genes．

Graphical abstract

关键词

酿酒葡萄 / 赤霞珠 / RNA提取 / LiCl法优化 / qRT-PCR

Key words

wine grape / Cabernet Sauvignon / RNA extraction / LiCl method optimization / Real-time fluorescence quantitative PCR(qRT-PCR)

葡萄隶属于葡萄科（Vitaceae）葡萄属（Vitis），是一种原产于西亚、欧洲和北非落叶藤本植物，它是世界第三大果树^[1]，国际葡萄和葡萄酒组织（OIV）发布的2021年全球葡萄酒行业最新数据报告显示，2020年中国葡萄种植面积位列全球第3，仅次于西班牙和法国^[2]。葡萄的使用用途分为2种，一种是鲜食葡萄，也可制作成葡萄干；另一种为酿酒葡萄^[3]。调研结果发现，葡萄酒行业具有很大的市场潜力，酿酒葡萄作为葡萄酒的原料，是葡萄酒品质的决定性指标，赤霞珠作为经典酿酒葡萄备受关注。

随着葡萄基因组全序列的测序完成，葡萄分子生物学研究领域已经扩展到基因组学、蛋白质组学、植物生理及病理等各个方向，更精确到基因分析、cDNA文库构建、蛋白质的互作研究等^[4]。而无蛋白和DNA污染且浓度高的RNA则是上述研究工作的基础。研究发现，植物各组织总RNA提取比动物或者微生物组织总RNA提取难度要大得多，根本原因在于植物组织具有坚硬的细胞壁，细胞内含有多种丰富的次级代谢产物，破碎细胞后，此类物质将在不同时间以不同形式干扰RNA的提取。另外，组织细胞内、操作过程中产生的核糖核酸抑制剂均会对分离样品中的RNA进行降解，其高稳定性是造成RNA分离困难的主要原因。葡萄的不同组织在不同发育阶段其结构和成分有着或多或少的差异^[5]，特别是葡萄中含有大量干扰RNA提取的物质：如多酚和多糖类，其中，多酚在提取RNA的过程中非常容易被氧化为醌类物质，RNA可以与其发生不可逆结合，影响RNA提取的纯度^[6-7]；多糖则由于其许多理化性质与RNA相似，在提取的过程中会与RNA结合形成难以分开的共沉淀^[8]。基于以上原因，最终导致葡萄组织RNA的提取效率不高，且往往耗费大量的时间及试验成本，成为急需解决的问题。

目前，植物RNA的提取方法有很多种，常用方法有异硫氢酸胍法^[9-10]、苯酚法、改良Gomez法、LiCl-尿素法、CTAB法和改良CATB法^[11-12]、SDS法和改良SDS法、Trizol法、成品试剂盒法^[13]等。针对试验材料的不同，不同的方法各有其优劣性。王暑辉等^[14]对SDS酚法进行改进，从侧柏中提取RNA；淦国英等^[15]采用改良CTAB法从香蕉叶片中提取了高质量的RNA。针对葡萄组织中多酚、多糖类物质含量较高，张今今等^[16]比较了改良SDS-酚法、成品试剂盒和异硫氰酸胍法这3种完全不同的方法，以期获得质量高、完整性好的总RNA；YANG等^[17]采用SiO₂自旋柱的提取方法，成功从葡萄果实中提取出可用于病毒RT-PCR的高质量 RNA；房经贵等^[18]采用CTAB法从葡萄冬芽中提取RNA，李红熙等^[19]采用CTAB结合SDS法从蛇龙珠葡萄中提取的RNA可以满足RT-PCR的要求；付阳等^[20]采用改良CTAB法从山葡萄提取了适用于RT-PCR、构建cDNA文库等研究的总RNA；RNA试剂盒法是获取植物高质量RNA样品的常用技术^[13]，具有操作简便、耗时短和试验重复性好的优点^[21]；杨晓燕等^[13]将3种常用的试剂盒进行改进，从葡萄叶片中提取出适合转录组测序的RNA；BEUVE等^[22]采用试剂盒法成功从黑比诺葡萄的绿叶中提取出可用于检测葡萄卷叶病毒的总RNA。尽管已经有很多研究者经过大量试验对这4种RNA提取法进行调整、优化，进而用来提取不同植物叶片的总RNA，但对酿酒葡萄赤霞珠叶片总RNA的提取尚未见系统的研究与分析。

基于试验方法的广泛性及试验条件的要求，本研究采用重蒸酚法、Trizol法、改良CTAB结合SDS法以及LiCl法（基于改良SDS法）4种方法，从经典酿酒葡萄赤霞珠叶片中提取总RNA，通过比较4种方法提取得到的总RNA的纯度和浓度确定较适合的提取方法，并在此基础上进行优化，最终获得适用于实时荧光定量PCR分析的最优方法，旨在为后续以酿酒葡萄赤霞珠叶片为材料进行研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本研究所用植物材料为实验室种植的3年生赤霞珠（Cabernet Sauvignon），于2022年3月种植于营养土∶蛭石∶椰糠体积比为7∶2∶1的土壤中，在光暗交替（光照16 h）、温度为25 ℃的温室中常规化管理，于赤霞珠植株生长至10片叶时采样。

1.2 RNA提取方法

1.2.1 Trizol法（Trizol method）

RNase free 2 mL EP管中加入0.2 g新鲜叶片，放入无菌氧化锆，加入600 µL Trizol，50 Hz破碎180 s，具体操作参照文献[23]进行。

1.2.2 重蒸酚法（Resteam phenoi method）

将0.2 g新鲜叶片经液氮研磨成粉末，加入1.2 mL预热后的重蒸酚和10 µL（3 mol/L）NaAC，后续参照苗琪^[24]的研究方法进行。

1.2.3 CTAB结合SDS法（Improved CTAB method）

称取0.4 g 新鲜叶片于研钵中，加入0.05 g PVP，加入适量液氮迅速研磨成粉末，参照HENRIQUE等^[25]以及王杰等^[26]的研究方法进行。

1.2.4 LiCl法（LiCl method）

称取0.1 g的新鲜叶片，用液氮在研钵中研磨成粉末，参照张彦苹等^[27]以及彭婧等^[28]的方法提取，采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性和纯度。

1.3 LiCl法的优化处理

在LiCl法基础上利用醋酸钠、DNAase消化、苯酚抽提法进一步优化（表1）。

1.4 RNA检测

采用琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像仪上观察RNA条带，以筛选出浓度高、无污染的赤霞珠植株叶片总RNA。同时采用超微量分光光度计（Micro Drop）测定1 µL样品中RNA浓度，并分别检测260 nm和280 nm下吸光光度值，并计算A_260/280值^[29]。

1.5 实时荧光定量PCR分析

参照文献[30]将获得的酿酒葡萄植株叶片RNA样品反转录为cDNA，向8联管内依次添加Primer F、Primer R、dTOP Mix(实时荧光定量检测预混酶试剂)、ddH₂O。Real Time PCR仪器为LightCycle^®480II。

2 结果与分析

2.1 4种不同方法提取赤霞珠葡萄叶片RNA比较

在样品基本一致的前提下，不同提取方法处理样品方式不同，Trizol法是需要借助仪器对植物组织进行破碎，其他方法则需液氮研磨后放-80 ℃保存备用。利用Trizol法提取的RNA时间短，约6.5 h，而利用重蒸酚法提取时间7 h，CTAB结合SDS法用时约为9 h，LiCl法总体用时最长，需要过夜；但是相比前3种方法，LiCl法实际操作时间比较短，且LiCl法不需要组织研磨仪和水浴锅等，操作比较简单。

经4种方法提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示（图1），重蒸酚法和Trizol法提取RNA的18S和28S的条带亮度相近且均很弱，表明提取RNA浓度较低，完整性较差，其中，Trizol法提取的RNA存在基因组DNA污染。改良CTAB法、LiCl法提取的RNA条带则表现出较强的亮度，表明这2种方法提取的赤霞珠总RNA浓度高，其中改良CTAB法提取结果显示有大量弥散条带以及胶孔位置的阻滞条带，表明存在DNA污染以及蛋白污染；LiCl法提取的RNA，28S的条带亮度是18S的2倍，并且条带无拖带现象，表明这种方法提取的RNA完整性较好，浓度较高，但是依然有DNA污染和少量的蛋白污染。总之，上述结果表明，重蒸酚法和Trizol法提取率低，改良CTAB法和LiCl法尽管能够保证浓度，但CTAB法DNA以及蛋白污染程度更高，仅采用上述4种方法均不能直接用于酿酒葡萄赤霞珠叶片RNA的提取，因此，选择完整性高、污染程度较弱的LiCl法继续优化，以期最终提取出完整性好、浓度高、无DNA及蛋白污染的赤霞珠叶片RNA。从重蒸酚提取葡萄叶片中可以发现，尽管提取的RNA完整性较差，但是没有DNA污染。对照组没有优化的LiCl法（只加50 µL的β-疏基乙醇）提取的RNA，浓度和完整性均较好，但是DNA污染比较严重，并且仍存在少量蛋白污染。

2.2 不同处理优化LiCl法

醋酸钠在植物提取总RNA过程中起到去除多糖、基因组DNA、维持提取液的酸性环境、不破坏RNA结构的作用^[31]，因此，首先利用醋酸钠优化LiCl法。由图2-A可知，仅醋酸钠时无电泳条带（Lane2）；当组合25 µL和50 µL β-疏基乙醇时（分别对应Lane3和Lane4），出现蛋白质和DNA污染条带，但所得RNA条带仍不清晰。而仅有50 µL β-疏基乙醇时，尽管存在蛋白质和DNA污染严重，但RNA条带清晰（Lane1）。

为了除去RNA提取中的DNA污染，进一步选用RNase-Free DNase I处理，结果如图2-B所示，用RNase-Free DNase I消化后的2条泳道中28S和18S的条带亮度都比较清晰，无拖尾现象，RNA完整性较好，并且没有出现基因组DNA的条带，表明用这个方法可以有效去除提取总RNA中的DNA污染。对于结果显示的少量的蛋白污染将做进一步优化。

在提取RNA的过程中，氯仿作为有机溶剂可以使蛋白变性，同时对溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质起到一定除杂作用；水饱和酚也具有去除蛋白和DNA污染的作用^[32]。本研究中，采用2种试剂进行多次抽提，并在最后均使用无RNA酶的DNA酶处理消化DNA，结果如图2-C所示，经氯仿和水饱和酚（体积比1∶1）抽提2次的RNA存在严重蛋白污染（图2-C-I），RNA质量浓度为160.950 µg/mL，且A_260/280为1.211（表2），也证实蛋白污染严重；经氯仿抽提1次、水饱和酚抽提2次、氯仿和水饱和酚（体积比1∶1）抽提1次之后的RNA条带比较清晰，完整性比较好（图2-C-II），但仍存在少许的蛋白污染且质量浓度RNA较低（70.204 µg/mL）（表2），可能是由于提取过程中损失较多；经氯仿和水饱和酚（体积比1∶1）抽提5次的RNA无明显的蛋白污染（图2-C-III），但浓度较低（93.652 µg/mL）（表2）；氯仿和水饱和酚（体积比1∶1）抽提2次、氯仿抽提1次、氯仿和水饱和酚（体积比1∶1）抽提1次的RNA，28S和18S的条带亮度都很好，并且条带无拖尾（图2-C-IV），质量浓度为173.611 µg/mL，A_260/280为1.803（表2），表明这种方法提取的RNA完整性好且浓度高。上述结果表明，水饱和酚氯仿优化LiCl中采用方案IV，即氯仿和水饱和酚（体积比1∶1）抽提2次、氯仿抽提1次、氯仿和水饱和酚（体积比1∶1）抽提1次能够最终获得完整性最好、浓度最高、无明显蛋白污染的赤霞珠葡萄叶片总RNA。

2.3 实时荧光定量PCR分析

qRT-PCR扩增结果与融解曲线如图3所示。

将获得的酿酒葡萄植株叶片RNA样品反转录为cDNA在PCR仪中反应后，用RNase-Free dd H₂O稀释，接着加入Primer F、Primer R、dTOP Mix（实时荧光定量检测预混酶试剂）、ddH₂O等物质进行反应。qRT-PCR是在标准PCR体系中加入了荧光物质通过荧光信号的积累能够实时监测每次循环后PCR产物的变化，并生成荧光扩增曲线，该技术能够实现对初始模板的定量分析^[33]。qRT-PCR试验要求提取的RNA有2个要素，一是浓度高、完整性较好，二是无蛋白和DNA污染，二者缺一不可。图3结果显示，对内参基因进行qRT-PCR扩增后出现对应的扩增曲线，且融解曲线为单峰，为80~90 ℃，表明扩增产物特异性好，提取RNA可用于实时荧光定量PCR分析；同时内参基因的Ct值在19左右，大部分目的基因的Ct值为20~30，少数2个基因在30左右（表3）。按照图4的RNA提取流程，结果表明，优化后LiCl法得到的RNA质量良好，能够用于qRT-PCR分析。

3 结论与讨论

本研究在分析比较4种常用RNA提取方法的基础上，确定从LiCl法出发，从基因组DNA污染和蛋白污染2个方面进行优化，最终获得用于提取酿酒葡萄赤霞珠叶片总RNA的方法。该方法提取的RNA完整性好、纯度高、无污染，可用于后续反转录以及实时定量PCR分析，为后续其作为材料的相关代谢调控研究奠定基础。

研究结果显示，LiCl法（基于改良SDS法）提取RNA效果最好，RNA条带清晰不拖尾，亮度高，虽然有轻微DNA和蛋白污染，但是无论是浓度还是完整性均是最佳，有利于后续试验的进行。改良CTAB法提取的RNA完整性较好、浓度较高，但是提取葡萄叶片需要的样品量较多、样品较少时，不利于实验进行，且有蛋白和DNA污染。使用Trizol法和重蒸酚法很难从赤霞珠叶片中提取出高质量的总RNA，尽管重蒸酚法中基本上无DNA和蛋白污染，Trizol法存在严重降解和污染等问题。有研究表明，重蒸酚法提取喜树RNA的效果较好^[34]，而在本研究中对葡萄叶片的提取效果不理想，这可能是因为葡萄赤霞珠叶片中含有较多的有机酸、多酚和其他一些次生代谢物质，这些物质可与RNA相互作用，形成不溶于水相的复杂混合物，在抽提过程中RNA可与这些物质共聚合而损耗，从而影响RNA的提取量和质量。有报道指出，Trizol对葡萄RNA的提取质量好，条带锐利，可清晰看出28S与18S亮度比为2∶1^[35]。但在本试验中，提取效果不理想，推测可能是由于提取组织的不同，导致杂质未去除完全。上述结果表明，这2种方法均不适合赤霞珠叶片总RNA的提取，最终选在LiCl法的基础上进行改良。

根据上述结果，从基因组DNA污染和蛋白污染2个方面进行优化。针对DNA污染，研究发现，在用重蒸酚提取RNA的方法中无基因组污染，选择加入醋酸钠进行优化，结果并没有提高RNA的提取质量，甚至使RNA降解；RNase-FreeDNase I消化是比较常用的去除RNA溶液中DNA的方法，结果显示，无明显基因组DNA条带。进一步利用氯仿和水饱和酚这2种试剂去除蛋白污染，发现氯仿和水饱和酚（体积比1∶1）抽提5次和氯仿水饱和酚（体积比1∶1）抽提3次中间加1遍氯仿效果是比较理想的，消除了蛋白污染，RNA浓度也较高。

本研究进一步利用其反转录获得cDNA，并以其为模板进行荧光实时定量分析，内参基因以及其他基因的Ct值约为20左右，符合实验要求。同时利用实时定量成功检测到一些抗寒基因不同程度的表达，这与文献报道相一致^[36]，表明制备的RNA可以用于后续荧光实时定量分析，这为酿酒葡萄叶片以及其他组织RNA提取提供一定参考。

本研究通过对4种常规RNA提取方法比较发现，LiCl方法相对较优，进一步针对RNA降解以及蛋白和DNA污染问题进行优化发现，β-疏基乙醇、氯仿和水饱和酚（体积比1∶1）抽提2次，然后加入氯仿抽提1次，最后用氯仿和水饱和酚（体积比1∶1）抽提1次是提取赤霞珠葡萄叶片RNA的最适宜方法，进一步经RNase-FreeDNase I进行消化，就可以得到纯度高、完整性好、用于实时定量PCR的酿酒葡萄叶片RNA。尽管本研究获得最佳的试验方法，解决了完整性、高纯度无污染的问题，但用时较长，后续将进一步对实验操作精简进行研究。

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基金资助

国家自然科学基金面上项目(31970324)

辽宁省教育厅基础研究项目(J2020042)