小片蝽线粒体基因组及蝽科系统发育分析

Mitochondrial Genome of Sciocoris lateralis andPhylogenetic Analysis of Pentatomidae

摘要

为了从线粒体基因组水平探讨小片蝽Sciocoris lateralis在蝽科的分类地位，丰富蝽科线粒体基因组基本数据，为蝽科系统发育进化研究提供一定的理论依据，通过高通量测序，首次测定并分析了小片蝽完整线粒体基因组（Genbank登录号：OP531920），提取蝽科物种的13个蛋白编码串联序列（PCGs），使用最大似然法、贝叶斯法构建系统发育树。结果显示，小片蝽昆虫的线粒体全基因组长度为15 445 bp，包括13个蛋白编码基因（Protein-coding genes，PCGs）、2个rRNA基因（ribosome RNAs，rRNAs）、22个tRNA基因（transfer RNAs，tRNAs）和1个控制区（Control region）。小片蝽线粒体基因组结构排序与其他蝽科物种一致，均无基因重排现象。小片蝽线粒体全序列AT含量为74.26%，GC含量为25.74%。13个蛋白编码基因中，cox1、nad1和nad6的起始密码子为TTG，其余10个蛋白编码基因的起始密码子是ATT、ATA、ATG。在所测得的tRNA基因中，trnS1和trnV缺失DHU臂，其他20个tRNA均能折叠形成典型的三叶草结构。基因错配方式主要为G-U错配。基于13个PCGs构建的蝽科系统发育树结果显示，小片蝽与斑须蝽的亲缘关系最近并且位于蝽亚科分支，支持二星蝽族Eysarcorini和Strachiini族的单系性，而棕蝽族Caystrini和腹沟族Halyini互为姐妹群，这与传统形态学分类结果一致；益蝽亚科与蝽亚科曼蝽属（Menida）形成姐妹群关系，该系统发育关系与传统形态分类学研究结果不一致。

Abstract

In order to explore the taxonomic position of Sciocoris lateralis in the family Pentatomidae at the mitochondrial genome level, enrich the basic mitochondrial genome data of the family Pentatomidae, and provide a theoretical basis for the phylogenetic evolution of Pentatominae, in this study, the complete mitochondrial genome of S. lateralis was determined and analyzed for the first time through high-throughput sequencing(Genbank login Number: OP531920). 13 protein-coding tandem sequences(PCGs) from species of Pentatomidae were extracted and phylogenetic trees were constructed using the maximum likelihood method and Bayesian method. The results showed that the mitochondrial genome length of the insects was 15 445 bp, including 13 Protein-coding genes(PCGs), 2 rRNA genes(ribosomal RNAs), 22 tRNA genes(transfer RNAs), and a control region. The sequence of the mitochondrial genome was consistent with that of other species, and there was no gene rearrangement. The content of AT and GC was 74.26% and 25.74%, respectively. Among the 13 protein-coding genes, the start codons of cox1, nad1, and nad6 were TTG, while the start codons of the other 10 protein-coding genes were ATT, ATA, and ATG. Among the measured tRNA genes, trnS1 and trnV were missing DHU arms, while the other 20 tRNAs were able to fold to form a typical clover structure. The main pattern of gene mismatch was G-U mismatch. Based on the 13 PCGs, the phylogenetic tree of Pentatomidae showed that S. lateralis and Dolycoris baccarum were closely related and located in the subfamily of Pentatominae, supporting the monophyletic families of Eysarcorini and Strachiini, while Caystrini and Halyini were sister groups. This was consistent with the traditional morphological classification. Asopinae and Menida were sister groups, the phylogenetic relationship was inconsistent with the conclusion of traditional morphological taxonomy.

Graphical abstract

关键词

小片蝽 / 线粒体基因组 / 蝽科 / 系统发育

Key words

Sciocoris lateralis / mitochondrial genome / Pentatomidae / phylogeny

蝽科Pentatomidae由Leach于1815年建立，是蝽总科Pentatomoidea中种群数量最大的科，世界分布10亚科近5 000种。蝽科物种大部分为植食性昆虫，以刺吸式口器吸食蔬菜、果树和森林等幼枝嫩叶汁液，是重要的农业害虫，例如，稻绿蝽Nezara viridula危害水稻、赤条蝽Graphosoma rubrolineatum危害伞形花科植物，此外，有部分是捕食性昆虫，蠋蝽Arma custos捕食鳞翅目、鞘翅目幼虫等害虫，是生物防治的利用对象^[1]。小片蝽Sciocoris lateralis Fieber，1851隶属于半翅目Hemiptera蝽科Pentatomidae蝽亚科Pentatominae片蝽属。该属昆虫多分布于热带地区，国内外对该属的记录也多为形态特征描述。小片蝽虫体较小且体色较暗；前胸背板前侧缘具一显著的黄白色宽带，向后不甚达侧角外缘；小盾片长宽约相等，端部宽阔圆钝，基角凹陷明显，各胸节腹板黑色，中、后胸腹板凹槽状；足黄褐色。小片蝽以成虫形态刺吸植物汁液，主要危害油蒿、奇楠沉香等药用植物^[2-3]，主要分布于我国广东、海南、云南等地^[4]。

蝽科昆虫线粒体基因DNA（Mitochondria DNA，mtDNA）是双链闭合的环状分子，长度在13~16 kb，mtDNA包含13个蛋白质编码基因（Protein-coding genes，PCGs），22个转运RNA基因（Transfer RNAs，tRNAs）2个核糖体RNA基因（Ribosome RNAs，rRNAs），以及一个控制区（Control region），mtDNA被广泛用于物种的鉴定、种群遗传进化和系统发育树构建的研究中^[5-6]。截至2022年8月，NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）公布的半翅目蝽科昆虫线粒体完整基因组序列有49个，而关于片蝽属的昆虫线粒体完整基因组未见报道。

本研究测定小片蝽线粒体基因组，首次详细分析该物种线粒体基因组结构，绘制了RNA二级结构图，并结合NCBI数据库已报道的49个蝽科PCGs串联序列，构建蝽科系统发育树，从线粒体基因组水平探讨片蝽属在蝽科中的分类地位，旨在探讨蝽科4亚科以及部分族间的系统发育关系。

1 材料和方法

1.1 标本采集及DNA提取、测序

本试验的昆虫标本小片蝽于2021年7月28日采集自中国海南省海口市白沙门公园（20°07'13"N，110°33'53"E），标本采集后放入装在无水乙醇溶液的冻存管中，带回实验室后置于-20 ℃冰箱中保存，证据标本（SXAU2-98）目前保存在山西农业大学植物保护学院昆虫分类研究所中。

总DNA提取自小片蝽标本的胸部肌肉，严格按照试剂盒（TaKaRa Clontech DNA）使用手册进行DNA提取，检验合格后，送至公司进行高通量测序（百迈克生物技术），使用全基因组鸟枪法（Whole Genome Shotgun，WGS）策略，构建不同插入片段的文库，利用第2代测序技术（NextGeneration Sequencing，NGS），基于Illumina NovaSeq 6000测序平台，对其进行双末端（Paired-end，PE150）测序，测序大小为27 361 506 bp。

1.2 序列组装、注释与分析

使用fastp（version 0.20.0，https://github.com/OpenGene/fastp）软件对原始数据进行过滤，过滤标准为：截除Reads中的测序接头以及引物序列；过滤掉平均质量值小于Q5的reads；过滤掉N含量大于5的Reads。经过上述一系列的质量控制之后得到的高质量Reads，称之为Clean Data，得到Clean Reads数为27 073 068。

利用Geneious v. 11.0.5^[7]软件进行序列的组装、注释。注释完毕后，打开MITOS Web网页（http：//mitos.bioinf.uni-leipzig.de/），将参数设置遗传密码（Genetic code）选择无脊椎动物（05-Invertebrate），然后上传序列，该网页可以预测22个tRNAs的位置和二级结构。rRNAs基因边界通过人工查验与已知蝽科的RNA基因比较来确定，控制区的位置由相邻基因的边界来确定。使用MEGA v.11.0分析其碱基组成和密码子使用情况（RSCU）。AT偏斜（AT-skew）和GC偏斜（GC-skew）的计算方法如下。

AT-skew=（A-T）/（A+T）（1）

GC-skew=（G-C）/（G+C）（2）

使用DnaSP v.6.12.03^[8]计算蝽科每个PCG的每个非同义位点的非同义替换数（Ka）和每个同义位点的非同义替换数（Ks），不包括终止密码子。将组装注释完整的小片蝽的线粒体全基因组序列，上传至NCBI GenBank数据库，登录号为OP531920。

1.3 系统发育树的构建

本研究从NCBI数据库中下载50种蝽科（含本研究测定的小片蝽）的昆虫线粒体全基因组序列（表1），以盾蝽科的角盾蝽Cantao ocellatus和紫蓝丽盾蝽Chrysocoris stollii等2个物种作为外群。基于贝叶斯法（Bayesian，BI）和最大似然法（Maximum-Likelihood，ML）构建系统发育树^[9]。其中，最大似然法构建的系统发育树在PhyloSuite_1.2.2软件中运行，由系统自动筛选最佳分区，分支置信度采用超快自展法（Ultrafast bootstraping）重复100 000次计算所得。贝叶斯树根据文献[10]中运行计算得知，当分割频率的标准差低于0.01时，该程序将停止运行。

2 结果与分析

2.1 线粒体基因组结构特征

小片蝽的线粒体全基因组序列长度为15 445 bp（图1），共有37个基因，包括2个rRNAs、22个tRNAs和13个PCGs，以及1个控制区。分析线粒体基因组结构发现，小片蝽基因重叠共有7处，重叠长度范围在1~8 bp，基因重叠最长的区域发生在trnW和trnC基因之间，重叠数为8 bp（AAGCTTTA）；atp8和atp6基因重叠为7 bp（ATGATAA），nad4l和nad4基因的重叠为7 bp（TTATCAT）。最长基因间隔发生在nad1和trnS2 基因之间，间隔的长度长达24 bp。rrnS和trnI之间的区域长度为767 bp。

2.2 蛋白编码基因（PCGs）

小片蝽13个蛋白编码基因包括atp8、atp6、cox1、cox2、cox3、cytb、nad1、nad2、nad3、nad4、nad4l、nad5、nad6。有4个蛋白编码基因（nad1、nad4、nad4l、nad5）位于N链（Minor coding strand)，其余9个位于J链（Major coding strand)。nad5基因长度为1 705 bp，是最长的蛋白编码基因，最短的是atp8基因，长度仅为162 bp。ATN是atp8、atp6、cox2、cox3、cytb、nad2、nad3、nad4、nad4l、nad5的起始密码子，cox1、nad1和nad6的起始密码子是TTG；终止密码子均是TAG和TAA，这种完整的三联体密码子终止大部分的蛋白基因编码，也有以T或TA终止蛋白基因编码（表2）。大多数蛋白编码基因中的AT含量都高于70%，atp8基因的AT碱基含量最高，达79.63%，AT碱基含量最低的是cox1基因，含量为68.64%。除了nad1、nad4、nad4l、nad5基因的AT-skew值为负值外，其余9个基因的AT-skew值为正值（表3）

根据小片蝽相对密码子使用频率（RSCU）发现，使用频率最高的密码子是NNA（AUA、UUA、CGA等）和NNU（AAU、AUU、UUU）；使用频率最低的是密码子是NNG；而AUC、GUG、CGC、AGG这4个密码子的使用频率为0（图2）。

本研究通过计算同义替代率（Ks）、非同义替代率（Ka）和每个PCG的Ka/Ks值，探索蝽科的进化模式，结果显示，蝽科物种13个PCGs的Ka/Ks值均低于1（图3），说明PCGs均处于纯化选择阶段，因此，本研究选取物种的PCGs都可以用来分析蝽科的系统发育关系。atp8的Ka/Ks值最高（0.557），而cox1的Ka/Ks值最低（0.082）。

2.3 tRNAs基因

在小片蝽线粒体基因组tRNA总长度1 478 bp，14个tRNA基因（trnI、trnM、trnW、trnL2、trnK、trnD、trnG、trnA、trnR、trnN、trnS1、trnE、trnT、trnS2）位于J链，8个tRNA基因（trnQ、trnC、trnY、trnF、trnH、trnP、trnL1、trnV）位于N链，每个tRNA基因的长度在63~73 bp。22个tRNA基因的碱基含量为A（38.23%）、T（37.01%）、G（13.94%）、C（10.83%）。在小片蝽22个转运RNA基因的二级结构中，基因trnS1（GCT）和trnV（TAC）因缺失了DHU臂而不能形成典型的二级结构。22个tRNAs二级结构中，除了典型的碱基配对（A-U和G-C）外，还出现21对错配，例如G-U（图4）。

2.4 rRNAs基因与控制区

小片蝽线粒体基因中，rrnL基因和rrnS基因位于J链，碱基含量为A（31.97%）、T（45.00%）、G（15.02%）、C（8.02%）。rrnL基因长度为1 274 bp，位于trnV与trnL1之间，预测的二级结构包括有Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ等5个结构域，其中结构域III缺失，同时形成了44个茎环结构（图5）。rrnS基因长度为797 bp，位于控制区和trnV之间，其5'末端与控制区相邻，该二级结构包括3个结构域，由约26个茎环结构组成（图6）。控制区长度为767 bp，介于rrnS与trnI基因之间。

2.5 系统发育关系

以盾蝽科2个物种作为外群、蝽科4亚科50个物种作为内群，基于13个PCGs构建的2个系统发育树的拓扑结构结构基本一致。结果显示，小片蝽与斑须蝽Dolycoris baccarum的亲缘关系更近；支持二星蝽族Eysarcorini和Strachiini的单系性，棕蝽族Caystrini和腹沟族Halyini互为姐妹群；益蝽亚科类群很好地聚为一支，并和蝽亚科部分类群聚类到一起，其拓扑结构为：（（蠋蝽属Arma+蓝蝽属Zicrona）+（（疣蝽属Cazira+喙蝽属Dinorhynchus）+（（曙厉蝽属Eocanthecona+益蝽属Picromerus））），短喙蝽亚科的2个属聚在一起，也和蝽亚科部分物种聚为一支，而舌蝽亚科中的3个物种并没有聚为一支，不支持其单系性（图7、8）。

3 结论与讨论

小片蝽线粒体基因组总长度为15 445 bp，包括了13个蛋白编码基因（PCGs），22个转运tRNA，2个核糖体rRNA基因和1个控制区，小片蝽线粒体基因组序列结构和顺序与其他蝽科物种的相同^[11-13]。碱基组成分析结果显示，小片蝽线粒体基因组全序列碱基含量组成为A（42.86%）、T（31.40%）、C（14.92%）、G（10.82%），AT含量为74.26%，AT偏斜值（AT-skew）为0.154，GC偏斜值（GC-skew）为-0.159。

根据相对密码子使用频率（RSCU）分析发现，小片蝽密码子的使用频率具有不均质性，NNU、NNA的相对同义密码子使用频率比较高，碱基A和U的出现频率高于G和C，说明了第3位密码子富含碱基AT，这可能是PCGs序列中AT偏斜大于GC偏斜的原因。其中位于N链蛋白质编码基因的T含量都达到了50%以上，而位于J链的T含量在30%~39%，因此位于编码N链蛋白质编码基因中T偏斜值较大，具有明显的AT偏好性。起始密码子既有典型的ATN，也有非典型的TTG；大部分蛋白编码基因终止密码子为TAA或者TAG，少部分基因终止密码子为TA或T，这种情况在半翅目昆虫线粒体组中较为常见^[14-15]。

通过计算线粒体基因的替代率，蝽科物种13个PCGs的Ka/Ks值均低于1，说明该基因均处于纯化选择阶段，atp8的Ka/Ks值最高，进化速率快。这类进化速率较快的基因（例如atp8、nad4l、nad6）的AT含量都比较高；cox1的Ka/Ks的比值最低，进化速率缓慢。这类进化速率较慢的基因（例如cox1、cox2、cox3、cytb）的AT含量普遍偏低，综上可知，碱基的AT含量偏斜与进化速率相关，cox1基因结构相对保守。因此，广泛利用cox1基因进行近缘种间的鉴定和系统进化研究^[16-20]。

对小片蝽22个tRNA的二级结构研究发现，trnS1和trnV缺失了DHU臂不能正常折叠形成典型的三叶草型二级结构。研究发现，半翅目昆虫的trnS1基因均缺少DHU臂，还有一些物种的tRNA也缺失DHU臂，例如菜蝽属物种trnS1和trnV均缺失DHU臂，tRNAs基因存在一些碱基错配的现象，错配最多是碱基G与碱U，这些情况在蝽科物种很常见^{[6，13，19-21，22-23]}。基于13个PCG构建的蝽科ML和BI系统发育树结果显示，小片蝽处于蝽亚科分支，小片蝽与斑须蝽D.baccarum的亲缘关系最近，但该分类单元的单系性仍需通过更广泛的类群取样来检验；腹沟族Halyini与棕蝽族Caystrini族间存在关系，具有较高的支持率，且这2个族的物种形态特征有相似之处：臭腺沟缘长、挥发域面积大且界限明显等；绿蝽族Nezarini和等片族Antestiini聚为一簇。形态分类上，Rider将绿蝽族Nezarini的珀蝽属Plautia暂时放置于等片族Antestiini内，本研究系统发育树支持这一结论。结果还显示，Strachiini形成一个单系群，秦岭菜蝽Eurydema qinlingensis是Strachiini分化较早的一支；二星蝽族Eysarcorini 2个属二星蝽属Eysarcoris、辉蝽属Carbula形成稳定的分支，结果高度支持该族的单系性，与学者研究结果一致^[24]；益蝽亚科是一个单系，但与蝽亚科曼蝽属Menida形成姐妹群关系，舌蝽亚科3个族物种与蝽亚科聚在一起，说明舌蝽亚科不是一个单系群，而是与蝽亚科形成并系群，短喙蝽亚科物种聚为一支并与蝽亚科蝽族形成姐妹群。有研究认为，应该重新审视益蝽亚科、短喙蝽亚科、舌蝽亚科在蝽科的亚科地位，建议将它们作为蝽亚科的族级阶元看待^[25]。

本研究通过对小片蝽线粒体全基因组的报道，丰富了蝽科线粒体基因组数据库，同时为蝽科系统发育关系的进一步探讨提供了一定的理论基础。对蝽科的深入研究还需后期补充大量蝽科物种基因组，同时，需结合形态学、生物学特性等进一步阐明蝽科系统发育关系，从而构建更合理的蝽科各阶元间的进化关系。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31872272)

山西省回国留学人员科研资助项目(2020-064)

山西省回国留学人员科研资助项目(2020-065)