莲草直胸跳甲3个气味结合蛋白基因的克隆与表达分析

Cloning and Expression Analysis of three Odorant Binding Protein Genes in Agasicles hygrophila

摘要

气味结合蛋白昆虫嗅觉通讯过程中的重要蛋白质，参与昆虫气味识别的第一步反应，在昆虫觅食、聚集、求偶和寻找产卵场所等活动中起重要作用。为明确莲草直胸跳甲（Agasicles hygrophila）气味结合蛋白基因（OBP）表达特征，初步了解其功能，对3个OBP基因进行了克隆与生物信息学分析，并通过实时荧光定量PCR分析了它们在不同组织中的相对表达量。结果显示，AhygOBP27、AhygOBP32与AhygOBP44的开放阅读框分别为351、408、423 bp，其编码的蛋白质是分子量较小的酸性可溶性蛋白质。其中，AhygOBP27主要在雌雄虫的触角、头、足、翅中表达；AhygOBP32主要在雌雄虫的触角、足、翅以及雄虫的头中表达；AhygOBP44主要在雌雄虫的触角、头、足中表达。这3个基因在雌雄成虫触角中的表达水平均显著高于其他组织，其中AhygOBP27与AhygOBP44在雌性触角中的表达水平显著高于雄性；AhygOBP32在雄性触角中的表达水平显著高于雌性。推测这3个基因在莲草直胸跳甲嗅觉识别过程中起重要作用，AhygOBP27和AhygOBP44可能与识别寄主植物挥发物和寻找产卵地相关，AhygOBP32可能参与雄虫识别雌虫释放的性信息素。

Abstract

Odorant binding protein(OBP) is an important protein in the process of insect olfactory communication. OBPs are involved in the first step of insect odor recognition, and play an important role in insect activities such as foraging, aggregation, courtship, and looking for spawning places. In order to determine the expression characteristics of OBP genes in Agasicles hygrophila and to preliminarily understand its functions, in this study,three OBP genes were cloned and analyzed using bioinformatics. The relative expression levels of OBPs in different tissues were analyzed by quantitative real-time PCR. The results showed that the open reading frame of AhygOBP27, AhygOBP32, and AhygOBP44 were 351, 408, 423 bp, respectively. The proteins encoded by the three OBPs were acidic soluble proteins with small molecular weight. AhygOBP27 was mainly expressed in the antennae, head, feet and wings of both sexes. AhygOBP32 was expressed in antennae, head, leg and wings of the male and in antennae, feet and wings of the female. AhygOBP44 was expressed in the antennae, heads and feet of both sexes. The expression levels of above three genes in the antennae of male and female were significantly higher than that of other tissues. The expression level of AhygOBP27 and AhygOBP44 in female antennae were significantly higher than that in male antennae, and the expression level of AhygOBP32 in the antennae of males was significantly higher than that of females. The three genes might play an important role in the olfactory recognition of Agasicles hygrophila, AhypOBP27, and AhygOBP44 might be related to the recognition of host plant volatiles and the search for spawning ground; AhygOBP32 might be involved in the recognition of sex pheromone emitted by females.

Graphical abstract

关键词

喜旱莲子草 / 莲草直胸跳甲 / 气味结合蛋白 / 基因克隆 / 组织表达

Key words

Alternanthera philoxeroides / Agasicles hygrophila / odorant-binding protein / gene cloning / tissue expression

喜旱莲子草（Alternanthera philoxeroides）是一种全球范围内的恶性入侵杂草^[1]，其生长迅速，有极强的繁殖力和生态适应性，会对入侵地的生态环境造成严重影响^[2]。19世纪末，喜旱莲子草侵入到我国后迅速蔓延传播，已成为我国分布最广、危害最为严重的杂草之一，且目前分布范围仍在扩大^[3]。为了有效遏制喜旱莲子草，受其侵害的国家均采取过各种措施，而利用其专食性天敌莲草直胸跳甲是目前最有效的防治方法^[4]。

莲草直胸跳甲（Agasicles hygrophila）原产于南美洲，先后被多个国家引进用于防治喜旱莲子草^[5-6]。我国于1986年首次引进后，对其进行了一系列的寄主专一性测定实验^[7-8]，认为其安全可靠，可在我国大量推广用于防治喜旱莲子草。研究表明，莲草直胸跳甲是利用喜旱莲子草的主要挥发物与非寄主植物挥发物的特异性比例来寻找定位寄主植物^[9]，嗅觉在莲草直胸跳甲识别喜旱莲子草的过程中起到了至关重要的作用。

气味结合蛋白（Odorant binding proteins，OBPs）是一类存在于昆虫嗅觉感受器淋巴液中的小分子球状蛋白^[10]。当外界气味分子进入触角感器后，首先与淋巴液中的OBPs结合形成复合体，随后到达嗅觉神经元，激活神经元树突膜上的气味受体，使化学信号转变为电信号，并刺激神经，指导昆虫作出相应反应^[11]。因此，OBPs与气味分子结合是昆虫嗅觉识别的第一步反应^[12]。

1981年，首个OBP家族成员在多音天蚕Antheraea polyphemus雄蛾的触角中被鉴定出来，OBPs也被认为只在昆虫的触角中特异性表达^[13]。后来发现，OBPs不仅在触角中表达，在除触角以外的其他组织中也有表达，这可能与其行使不同的功能有关^[14]。如二化螟Chilo suppressalis CsupOBP8主要在成虫触角中表达，可识别β-紫罗酮、橙花叔醇、法尼醇和二己酮等多种寄主植物挥发物^[15]；麦长管蚜（Sitobion avenae Save）的OBP3在足部高表达，暗示着其具有某种特殊的嗅觉功能^[16]；中华蜜蜂（Apis cerana cerana Acer）的OBP19在口器中表达量较高，推测它们与味觉识别相关^[17]。近年来，随着分子生物技术不断发展，越来越多的研究通过对昆虫的OBP基因进行表达分析以探究其功能，其中，包括鞘翅目^[18]、鳞翅目^[19]、膜翅目^[20]、半翅目^[21]、直翅目^[22]、缨翅目^[23]等中的近100种昆虫。

莲草直胸跳甲作为防治恶性入侵杂草喜旱莲子草的专食性天敌昆虫，嗅觉在其定位识别寄主植物的过程中起到了关键性的作用。因此，本试验拟探究连草直胸跳甲基于OBPs所介导的嗅觉识别机制。课题组前期通过对莲草直胸跳甲触角转录组测序鉴定得到36个Minus-C OBPs和11个Classic OBPs^[24]，但这些基因在其嗅觉识别过程中行使的具体功能还有待研究。基于此，本试验从鉴定筛选出的Classic OBPs中选取了具有完整开放阅读框的AhygOBP27、AhygOBP32与AhygOBP44进行克隆和序列分析，并明确它们在雌雄成虫不同组织中的表达模式，为探究OBP基因在莲草直胸跳甲的嗅觉识别过程中的功能，进一步防治喜旱莲子草奠定分子基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试虫源来自华南农业大学，后长期饲养于山西农业大学生物安全与生物防治实验室人工气候箱，培养条件为：温度（25±1）℃，光周期L∶D=14 h∶10 h，相对湿度85%±5%。

1.2 试验方法

1.2.1 莲草直胸跳甲RNA的提取与cDNA合成

收集莲草直胸跳甲雌雄成虫触角、头、胸、腹、足、翅6个组织，每个样品设置3个重复。将切取的组织在液氮中研磨成粉，利用TRIzol试剂（Takara，中国）提取总RNA；取1 μg总RNA作为模板，用Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）反转录试剂盒（Takara，中国）合成cDNA第1链，保存在-20 ℃备用。

1.2.2 莲草直胸跳甲气味结合蛋白基因的克隆

利用Primer Premier 5.0软件设计克隆引物（表1），以1.2.1合成的莲草直胸雌虫触角cDNA为模板，利用2×Taq PCR Master（Tiangen，中国）进行全长序列扩增。PCR反应体系为20 μL：2×Taq PCR Master 10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物（10 μM）各0.8 μL，ddH₂O 7.4 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性25 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，32个循环；72 ℃彻底延伸6 min。产物通过琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒（Biomed，中国）进行回收后连接到pMD^TM20-T载体（Takara，中国）上，转入DH5α感受态细胞（Takara，中国）中培养。挑选单菌落进行PCR验证，将条带正确的菌液送至上海生工进行测序。

1.2.3 莲草直胸跳甲气味结合蛋白的生物信息学分析

使用NCBI的ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）预测目的基因的开放阅读框。利用ExPASy-ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）对两种气味结合蛋白的理化性质进行预测。采用DNAMAN 9.0对气味结合蛋白的氨基酸序列进行多序列比对，MEGA 7.0中的邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育树，bootstrap重复1 000次^[25]。

1.2.4 莲草直胸跳甲气味结合蛋白基因的组织表达分析

以1.2.1合成cDNA为模板，通过BeaconDesign 7.0设计荧光定量PCR引物（表1）。核糖体蛋白L13基因（Ribosomal Protein L13，RP，基因登录号：OQ187814.1）作为内参基因，使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix（东洋纺生物科技）对莲草直胸跳甲雌雄成虫各组织进行荧光定量PCR，荧光定量仪器为ABI7500（美国赛默飞世尔科技公司）。试验设置3次生物学重复与3次技术重复。反应体系为20 μL：2×SYBR Mix 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，cDNA 1 μL，ddH₂O 7.4 μL。qPCR反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；72 ℃彻底延伸10 min。60~95 ℃进行熔解曲线分析。

1.3 数据分析

以OBPs在雄虫胸部的表达量为基准，采用2^-∆∆Ct法计算OBP基因在其它组织中的相对表达量。利用SPSS 22.0对OBP基因表达量数据进行统计分析，采用Tukey法对雌、雄虫在不同组织的相对表达量差异进行显著性分析，采用t检验对同一组织在雌、雄虫中的相对表达量差异进行显著性分析（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 莲草直胸跳甲气味结合蛋白的克隆

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到与目的片段大小一致的条带（图1）。随后进行克隆测序，测序结果显示，AhygOBP27 ORF长351 bp，编码116个氨基酸；AhygOBP32 ORF长408 bp，编码135个氨基酸；AhygOBP44 ORF长423 bp，编码140个氨基酸，登录号分别为ON260784.1、ON260785.1和OQ606235.1。

2.2 莲草直胸跳甲气味结合蛋白的理化性质分析

理化性质预测结果显示（表2），3个OBP基因所编码的蛋白分子量较小，等电点（pI）小于7，酸性氨基酸数目多于碱性氨基酸，属于酸性蛋白质；疏水/亲水性数值小于零，表现为亲水性。因此，3个OBP都属于分子量较小的酸性可溶性蛋白，与昆虫气味结合蛋白的特征相符合。

2.3 莲草直胸跳甲气味结合蛋白的序列分析

序列比对结果显示（图2），3个OBP的氨基酸序列中均含有6个半胱氨酸残基，且第2、3个半胱氨酸残基之间有3个其他氨基酸，第5、6个半胱氨酸残基之间有8个其他氨基酸，具有Classical OBPs亚家族蛋白的典型特征。其中AhygOBP27与沙葱萤叶甲Galeruca daurica GdauOBP的氨基酸序列一致性最高，达66.7%，与榆蓝叶甲Pyrrhalta aenescens PaenOBP18的氨基酸序列一致性次之，为55.8%；AhygOBP32与大猿叶甲Colaphellus bowringi CbowOBP17的氨基酸序列一致性高达74.6%，其次就是与榆蓝叶甲Pyrrhalta aenescens PaenOBP15序列一致性达68.6%；AhygOBP44与大猿叶甲Colaphellus bowringi CbowOBP8和赤拟谷盗Tribolium castaneum TcasOBP4的氨基酸序列一致性分别为30.23%和27.78%。

2.4 莲草直胸跳甲气味结合蛋白的进化分析

通过对莲草直胸跳甲3个OBP与其他24种昆虫OBP相应氨基酸序列进行系统进化分析，结果显示（图3），AhygOBP27与沙葱萤叶甲Galeruca daurica、榆蓝叶甲Pyrrhalta aenescens、黑肩毛胸榆叶甲Pyrrhalta maculicollis的OBP遗传距离较近；AhygOBP32与桑天牛Apriona germarii AgerOBP4遗传距离最近；AhygOBP44与与大猿叶甲Colaphellus bowringi CbowOBP8遗传距离最近。系统发育树主要聚类为两大支，其中AhygOBP27与AhygOBP44聚类为同一大支，而AhygOBP32单独成支。因此推测，AhygOBP32可能与AhygOBP27和AhygOBP44行使的功能不同。

2.5 莲草直胸跳甲气味结合蛋白的组织表达分析

AhygOBP27在雌雄成虫的各组织中均有表达，从高到低依次为触角、足、头、翅、胸和腹（图4-A）。其中AhygOBP27在雄虫触角中的相对表达量分别是头、胸、腹、足、翅的6.63倍、105.49倍、66.35倍、2.86倍和13.66倍，在雌虫触角中的相对表达量分别是头、胸、腹、足、翅的13.35倍、202.89倍、795.32倍、8.23倍和26.80倍。此外，AhygOBP27在雌虫触角中的相对表达量极显著高于雄虫触角（P<0.01），约为雄虫触角的1.65倍。

AhygOBP32主要是在雌雄成虫的触角、足、翅以及雄虫的头中表达，其他组织中几乎不表达（图4-B）。在雄虫中，AhygOBP32的相对表达量从高到低依次为触角、头、足、翅、腹和胸，其中AhygOBP32在触角的相对表达量显著高于其他组织（P<0.05），分别是头、足和翅的231.41倍、3 752.61倍和4 384.72倍。在雌虫中，AhygOBP32的相对表达量从高到低依次为触角、足、翅、头、胸和腹，AhygOBP32在触角中的相对表达量也显著高于足和翅（P<0.05）。此外，AhygOBP32在雄虫触角中的相对表达量极显著高于雌虫（P<0.01）。

AhygOBP44在雌雄成虫各组织中表达规律一致，从高到低依次为触角、足、头、腹、翅、胸（图4-C）。在雌虫中，AhygOBP44在触角中的表达量分别是头、胸、腹、足、翅的19.14倍、3 987.23倍、957.17倍、5.91倍和1 338.24倍；在雄虫中，AhygOBP44在触角中的表达量分别是头、胸、腹、足、翅的3.24倍、2 002.32倍、296.17倍、2.38倍和3 492.53倍。此外，AhygOBP44在雌虫触角中的相对表达量极显著高于雄虫触角（P<0.01），约为雄虫触角的3.83倍。

因此，莲草直胸跳甲这3个OBP基因均在雌雄成虫的触角中高表达，且AhygOBP27与AhygOBP44更偏向于在雌虫中表达，AhygOBP32更偏向于在雄虫中表达。

3 结论与讨论

在昆虫嗅觉感知过程中，OBPs作为最先发挥功能的关键组分，与环境中的脂溶性气味分子相互作用，并将其转运至化学受体神经元，激活树突膜表面分布的嗅觉受体，是嗅觉系统正常运行的必须蛋白^[26]。根据昆虫OBPs序列中保守氨基酸的数量可分为Classical OBPs、Minus-C OBPs、Dimer OBPs和Plus-C OBPs^[27]。研究表明，昆虫OBPs会朝着产生更多二硫键，空间结构更复杂的方向进化，以适应感受特殊气味物质的嗅觉需求^[28]，因此，与Minus-C OBPs相比Classic OBPs更多地存在于较为进化的物种中^[29]。本试验基于莲草直胸跳甲触角转录组数据，从中选取了3个具有完整开放阅读框的Classic OBPs进行克隆和生物信息学分析。进化分析结果显示，这3个OBP都与叶甲科的昆虫OBP序列一致性较高，在进化关系上更加同源，可能行使相似功能。叶甲科中与AhygOBP27和AhygOBP44聚为同一大支的沙葱萤叶甲GdauOBP15在雌性寻找寄主植物中发挥更重要的作用^[30]，花绒寄甲DhelOBP21参与了识别植物挥发物β-蒎烯^[31]；与AhygOBP32聚为同一支的GdauOBP20被证实参与定位寄主植物^[32]。因此，推测AhygOBP27与AhygOBP44可能起识别寄主挥发物的作用，AhygOBP32与定位寄主植物相关。

触角是昆虫重要的化学感受器官之一，在嗅觉感受中行使重要功能。在触角中特异性或高表达的气味结合蛋白一般都与嗅觉识别相关，如苜蓿盲蝽（Adelphocoris lineolatus）几乎只在触角中表达的AlinOBP1参与了感知性信息素的过程^[33]；薇甘菊颈盲蝽（Pachypeltis micranthus PmicOBP4）在触角中高表达，其在嗅觉系统中发挥着重要作用^[34]。本研究中，莲草直胸跳甲3个OBP基因在雌雄成虫触角中的表达量显著高于其他组织，推测它们在莲草直胸跳甲的嗅觉识别过程中发挥重要作用。此外，在头、胸、腹、足和翅等其他部位中表达的OBP可能参与感知味觉配体或其他代谢过程，如黑腹果蝇（Drosophila melanogaster DmelOBP49）在成虫头部高度表达，参与了对苦味剂的识别^[35]；绿盲蝽（Apolygus lucorμm）在足中高表达的AlucOBP38参与了对寄主次级代谢产物的识别^[36]。这3个OBP基因在头、足和翅中也有表达，因此，推测它们可能具有上述功能。

当然，OBP在雌雄成虫中也存在差异表达，这与其在生命活动中行使不同的功能密切相关。例如，黄胫小车蝗（Oedaleus infernalis Saussure）在雄虫头部高表达的OinfOBP2与发觉和辨别性信息素有关^[35]；梨小食心虫（Grapholita molesta）在雌虫触角中高表达的GmolOBP3与寻找寄主植物和雌虫产卵地相关^[36]。本研究中，AhygOBP27与AhygOBP44在雌虫触角中的表达水平显著高于雄虫，AhygOBP32在雄虫触角和头部中的表达水平显著高于雌虫。因此，推测AhygOBP27与AhygOBP44可能与识别寄主植物挥发物和寻找产卵点相关，AhygOBP32可能参与感受雌虫信息素、寻找配偶等生命活动。本试验通过对莲草直胸跳甲3个OBP基因进行克隆、系统进化和组织表达分析，初步了解它们在莲草直胸跳甲嗅觉识别过程中发挥的作用，为提高喜旱莲子草的防治效率提供了新思路。后续还会利用RNA干扰、荧光竞争试验等技术进一步验证它们的功能。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31570436)

山西农业大学省部共建有机旱作农业国家重点实验室自主研发项目(202003-4)