博落回生物碱和茶皂素对4种蔬菜病原菌的室内联合毒力

Combined Toxicity of Macleaya Alkaloids and Tea Saponin against Four Vegetable Pathogens

摘要

为明确博落回生物碱与茶皂素混配对辣椒疫霉病菌、瓜果腐霉病菌、番茄晚疫病菌和番茄灰霉病菌的联合毒力，以期为博落回生物碱与茶皂素复配型植物源农药的开发提供依据，采用生长速率法测定博落回生物碱和茶皂素单剂及其混剂对上述4种病原菌的EC₅₀、毒力比率以及最佳配比的联合毒力。结果表明，博落回生物碱对辣椒疫霉病菌、瓜果腐霉病菌、番茄晚疫病菌和番茄灰霉病菌的EC₅₀值分别为29.3、89.0、24.8、29.6 μg/mL；茶皂素对4种病原菌的EC₅₀值分别为90.0、90.3、55.2、83.0 μg/mL。毒力比率筛选结果表明，博落回生物碱和茶皂素EC₅₀剂量百分比为90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50和40∶60时，对辣椒疫霉病菌的毒力比率分别为1.30、1.38、1.45、1.33、1.29和1.28，表现为增效作用；EC₅₀剂量百分比为40∶60和10∶90时，对瓜果腐霉病菌的毒力比率分别为1.26和1.28，表现为增效作用；EC₅₀剂量百分比为80∶20和50∶50时，对番茄晚疫病菌的毒力比率分别为1.27和1.25，表现为增效作用；博落回生物碱和茶皂素复配对番茄灰霉病菌表现为相加作用。最佳配比的联合毒力筛选结果表明，博落回生物碱与茶皂素质量比为1.0∶3.1和1.0∶4.6的混剂对辣椒疫霉病菌表现为增效作用，增效系数分别为2.30和1.54；质量比为1.0∶1.5和1.0∶9.1的混剂对瓜果腐霉病菌表现出较好的增效作用，增效系数分别为1.67和2.12；博落回生物碱与茶皂素混剂对番茄灰霉病菌的联合毒力主要表现为相加作用；博落回生物碱与茶皂素质量比为1.8∶1.0的混剂对番茄晚疫病菌表现出较好的增效作用，增效系数为1.52。综上，博落回生物碱与茶皂素复配对辣椒疫霉病菌、瓜果腐霉病菌和番茄晚疫病菌具有明显的协同增效作用，对番茄灰霉病菌表现为相加作用。

Abstract

To determine the combined toxicity of the Macleaya alkaloids and tea saponin mixture against four vegetable pathogens, including Phytophthora capsici, Pythium aphanidermatum, P. infestans, and Botrytis cinerea, in order to provide a basis for the development of botanic pesticides of Macleaya alkaloids and tea saponin mixture, in this study, using the growth rate method, the EC₅₀ values, toxicity ratios, and combined toxicity of the optimal ratio of the single agents of Macleaya alkaloids, tea saponin, and their mixture against the four pathogens mentioned above were determined. The results showed that the EC₅₀ values for Macleaya alkaloids against P. capsici, P. aphanidermatum, P. infestans, and B. cinerea were 29.3, 89.0, 24.8, 29.6 μg/mL, respectively. The EC₅₀ values for tea saponin against the same fungi were 90.0, 90.3, 55.2, 83.0 μg/mL. The screening results of toxicity ratios showed that when the EC₅₀ percentage ratios of Macleaya alkaloids and tea saponin were at 90∶10, 80∶20, 70∶30, 60∶40, 50∶50, 40∶60, the toxicity ratios against P. capsici, were 1.30, 1.38, 1.45, 1.33, 1.29, 1.28, respectively, indicating a synergistic effect. Similarly, the toxicity ratios of Macleaya alkaloids and tea saponin at the EC₅₀ percentage ratios of 40∶60 and 10∶90 against P. aphanidermatum were 1.26 and 1.28, respectively, also indicating a synergistic effect. At the EC₅₀ percentage ratios of 80∶20 and 50∶50, the toxicity ratio of Macleaya alkaloids and tea saponin against P. infestans were 1.27 and 1.25, respectively, showing a synergistic effect. The combination of the Macleaya alkaloids and tea saponin indicated an additive effect on Botrytis cinerea. The screening results of combined toxicity of the optimal ratio showed that the mixture with the mass ratios of Macleaya alkaloids and tea saponin with 1.0∶3.1 and 1.0∶4.6 had synergistic effects on P. capsici with a synergistic coefficient of 2.30 and 1.54, respectively. Additionally, the mixture with the mass ratios of Macleaya alkaloids and tea saponin with 1.0∶1.5 and 1.0∶9.1 showed a distinct synergistic effect on P. aphanidermatum, with a synergistic coefficient of 1.67 and 2.12, respectively. The combined toxicity of the Macleaya alkaloids and tea saponin mixture against B. cinerea was mainly additive. Finally, the mixture with the mass ratios of Macleaya alkaloids and tea saponin with 1.8∶1.0 showed an obvious synergistic effect on P. infestans, with a synergistic coefficient of 1.52. Therefore, the combination of Macleaya alkaloids and tea saponin had an obvious synergistic effect on P. capsici, P. aphanidermatum, and P. infestans, while it showed an additive effect on B. cinerea.

关键词

博落回生物碱 / 茶皂素 / 病原菌 / 生长速率法 / 联合毒力

Key words

Macleaya alkaloids / tea saponin / pathogen / growth rate method / combined toxicity

农药残留已成为影响我国农产品安全的主要问题之一^[1]。安全无污染的植物源农药受到广泛关注^[2]，截至2019年底，我国植物源农药登记共计28种，单剂247个，混剂36个，母药/原药41个^[3]。尽管筛选出具有开发价值的植物资源很多，但由于原料加工、制剂、储存等特殊要求，生产成本相对较高，导致其在使用和推广上存在很大障碍^[4]。

博落回是罂粟科博落回属多年生草本植物，是一种具有较大开发利用价值的植物资源^[5-6]，其有效成分为博落回生物碱，使用后易降解，对环境污染小，不产生病虫害抗性，对人畜安全可靠^[7-8]。因此，将之开发为一种新型的植物源农药，对充分利用其进行病害虫绿色综合治理具有重要意义。博落回的主要化学成分为异喹啉生物碱，其中血根碱和白屈菜红碱最高，在抗菌活性方面博落回生物碱对水稻白叶枯病菌、姜瘟病菌、稻瘟病菌、苹果炭疽病菌和烟草黑胫病菌等多种细菌和真菌均有较好的抑制作用^[9-10]；在杀虫活性方面，对黄守瓜菜青虫^[11]、小菜蛾^[12]、菜粉蝶^[13]等均有较好的防治作用。小果博落回总生物碱在0.75 mg/mL时对番茄灰霉病的保护和治疗作用分别为73.6%和43.1%^[14]；对辣椒疫霉病菌（P. capsici）具有较强的抑制作用^[15]。满汉云^[16]等研究发现，博落回总生物碱水分散粒剂对番茄疫病具有较好的防治效果。贾长青^[17]等研究发现，血根碱衍生物在供试浓度50 μg/mL时对瓜果腐霉的抑制率为63.8%。

博落回生物碱与其他农药复配在病虫害的防治方面已取得一定进展。谷清义等^[18]研究表明，博落回生物碱与苏云金芽孢杆菌复配对小菜蛾防治效果较好。闫瑞坤等^[19]研究博落回生物碱与垂序商陆提取物复配对松梢螟幼虫的联合毒力表明，复配比例在1∶3时表现出明显的增效作用。王锐等^[20]研究发现，苦参碱与博落回生物碱复配对多种瓜果和蔬菜害虫均有防治效果。通过与其他农药复配，博落回生物碱对病虫害的防效和防治谱均有较好的提升。截至目前，博落回生物碱复配研究主要集中在杀虫剂开发，博落回生物碱复配型杀菌剂的研究较少。

茶皂素作为一种植物源农药，虽然自身抑菌活性不高，但研究表明其对多种农药都表现出较好的增效作用，通过其与其他农药复配，可大大减少农药的用量。本研究采用生长速率法，通过测定博落回生物碱和茶皂素单剂及其混剂对辣椒疫霉病菌、瓜果腐霉病菌、番茄晚疫病菌和番茄灰霉病菌4种蔬菜病原菌的毒力比率筛选具有增效作用的配比，进一步测定具有增效作用配比混剂的联合毒力，旨在为博落回生物碱与茶皂素复配型植物源农药的开发提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 病原菌

辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）、瓜果腐霉病菌（Pythium aphanidermatum）、番茄晚疫病菌（Phytophthora infestans）和番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）均由中国农业科学院植物保护研究所提供。

1.1.2 试剂

博落回总生物碱（含量为76%），参照贾长青等^[21]报道方法自制；茶皂素（65%）上海源叶生物科技有限公司生产；葡萄糖、琼脂粉等其他试剂均为分析纯，市购。

1.1.3 主要仪器设备

超声波清洗机（KQ800E，昆山市超声仪器有限公司）、超净工作台（SW-CJ-2FD，苏州净化工作台设备有限公司）、恒温恒湿箱（HWS450B，杭州绿博仪器有限公司）、立式压力蒸汽灭菌器（YM50，上海三申医疗器械有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 室内离体活性测定

用无菌水将2种药剂分别配制成100 μg/mL的溶液，以杀菌剂多菌灵和吡唑醚菌酯作对照。在含药马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）平板中央分别接种供试菌种的新鲜菌丝块直径5 mm的菌饼，菌丝面朝下（每个处理3次重复）。将接菌培养皿放置于25 ℃恒温恒湿箱中培养，每隔24 h观察1次，直至空白对照组菌落直径超过70 mm，采用十字交叉法测菌落直径，取其平均值。

抑制率=（对照菌落增长直径－药剂处理菌落增长直径）／对照菌落增长直径×100%（1）

1.2.2 博落回生物碱与茶皂素对4种蔬菜病原菌的室内毒力测定

测定博落回生物碱与茶皂素对4种蔬菜病原菌的EC₅₀时，采用菌丝生长速率法。设置空白对照和5个浓度梯度（表1）。参照1.2.1测定的各个浓度下对病原菌的抑制率，计算博落回生物碱与茶皂素对4种蔬菜病原菌的EC₅₀。

1.2.3 博落回生物碱与茶皂素最佳配比筛选

测定采用Horsfal方法^[22-23]进行混配比例设计。以博落回生物碱与茶皂素2种单剂的EC₅₀为基础浓度，将2种药剂EC₅₀药液按照体积比和空白对照共设置12个处理进行测定（表2），每处理3次重复，采用十字交叉法参照1.2.1计算各配比的抑制率，根据以下判断毒力比率与增效效果（毒力比率>1.25为增效作用；毒力比率<0.75为颉抗作用；0.75≤毒力比率≤1.25为相加作用）。选择毒力比率>1.25的配比进行联合毒力测定。

预期抑制率=（博落回生物碱EC₅₀剂量实际抑制率×配比中博落回生物碱EC₅₀剂量）×100+（茶皂素EC₅₀剂量实际抑制率×配比中茶皂素EC₅₀剂量）×100%（2）

毒力比率＝实际抑制率／预期抑制率（3）

1.2.4 最佳配比的联合毒力测定

采用文献[24]定量筛选，根据筛选出的最佳配比（1.2.3试验结果），将有增效作用的体积配比进行混合测定联合毒力并计算混剂的增效系数（SR；SR>1.5为增效；0.5≤SR≤1.5为相加；SR<0.5为颉抗），利用公式计算SR并评价复配剂增效比。

B=（a₁+a₂）/［a₁/A₁+a₂/A₂］（4）

SR=B/A（5）

式中，A₁、A₂分别代表混剂中博落回生物碱和茶皂素的EC₅₀实测值；A表示EC₅₀实测值、B表示EC₅₀理论值；a₁表示博落回生物碱的百分含量、a₂表示茶皂素在混剂中的百分含量。

1.3 数据分析

采用Orgin 9.1软件对数据进行统计，计算各处理平均菌落直径和平均抑制率；采用SPSS 26软件对药剂浓度对数值及对应的菌丝生长抑制率概率值进行回归分析，求出各单剂及其不同配比混剂的毒力回归方程、相关系数r和EC₅₀^[20]。

2 结果与分析

2.1 博落回生物碱和茶皂素对4种植物病原菌菌丝生长抑制活性

抑菌活性测定结果表明（表3），博落回生物碱对4种蔬菜病原菌的抑制活性优于茶皂素。与常规杀菌剂多菌灵和吡唑醚菌酯相比，博落回生物碱和茶皂素单剂抑菌活性较差，因此，如用单剂进行田间防治，需要较大剂量的博落回生物碱和茶皂素。

2.2 博落回生物碱与茶皂素对4种病原菌的室内毒力

由表4可知，博落回生物碱对辣椒疫霉病菌、番茄晚疫病菌和番茄灰霉病菌菌丝生长的EC₅₀值，分别为29.3、24.8、29.6 μg/mL，低于茶皂素对辣椒疫霉病菌、番茄晚疫病菌和番茄灰霉病菌的EC₅₀值（分别为90.0、55.2、83.0 μg/mL）；博落回生物碱与茶皂素对瓜果腐霉病菌的EC₅₀相当，分别为89.0、90.3 μg/mL。

2.3 博落回生物碱与茶皂素最佳配比筛选

以单剂博落回生物碱与茶皂素的近似EC₅₀为基础，采用交互测定法进行最佳配比的筛选，试验结果表明（表5），在测试配比中，T₂、T₃、T₄、T₅、T₆和T₇处理对辣椒疫霉病菌的毒力比率分别为1.30、1.38、1.45、1.33、1.29和1.29，表现为增效作用，其他配比表现为相加作用，混剂的毒力比率随博落回生物碱含量的降低，呈先增加后降低趋势。因此，取T₂、T₃、T₄、T₅、T₆和T₇共6个比例作下一步的联合毒力验证；博落回生物碱和茶皂素EC₅₀剂量比例T₇和T₁₀时对瓜果腐霉病菌的毒力比率分别为1.26和1.28，表现为增效作用，其他配比表现为相加作用，由毒力比率可知，混剂的随博落回生物碱含量的降低，抑菌活性无明显变化，因此，取T₇和T₁₀这2个比例进行联合毒力验证。T₃和T₆处理对番茄晚疫病菌的毒力比率分别为1.27和1.25，表现为增效作用，其他配比表现为相加作用，因此，取T₃和T₆这2个比例进行联合毒力验证；博落回生物碱和茶皂素复配对番茄灰霉病的毒力比率均介于0.75~1.25，均表现为相加作用，不必要进行联合毒力的增效系数测定。

2.4 最佳配比联合毒力测定

结合两单剂的EC₅₀，根据Wadley法计算博落回生物碱与茶皂素不同比例混剂理论上的EC₅₀，并与实际观察的EC₅₀（理论）比较，计算增效系数（SR）。由表6可知，T₂、T₃、T₄和T₅处理对辣椒疫霉病菌的增效系数为0.54、0.65、1.10和1.00，均介于0.5~1.5，表现为相加作用，T₆和T₇处理对辣椒疫霉病菌的增效系数为2.30和1.54，大于1.5，表现为增效作用；T₇和T₁₀处理对瓜果腐霉病菌的增效系数分别为1.67和2.12，均大于1.5，表现为增效作用；T₆处理对番茄晚疫病菌的增效系数为0.93，均介于0.5~1.5，表现为相加作用，T₃处理对番茄晚疫病菌的增效系数为1.52，大于1.5，表现为增效作用。

3 结论与讨论

张家美等^[25]研究表明，农药合理混配不但可以延缓药剂抗性的发生和发展，亦可扩大防治谱，提高防效、降低单位面积内的用药。将不同作用机理的杀菌剂复配表现出优于单剂的防治效果，极大地促进复配杀菌剂的快速发展^[26]。茶皂素通过与其他农药复配，可大大减少农药的用量，具有良好的复配利用基础^[27-29]。本试验研究了博落回生物碱与茶皂素复配的协同增效作用。针对辣椒疫病菌，最佳配比混剂中博落回生物碱抑制中浓度含量从29.3 μg/mL降至6.3 μg/mL；针对瓜果腐霉，最佳配比混剂中博落回生物碱抑制中浓度含量从89.0 μg/mL降至4.2 μg/mL；针对番茄晚疫病菌，最佳配比混剂中博落回生物碱抑制中浓度含量从29.6 μg/mL降至2.2 μg/mL，博落回生物碱的用量明显降低，博落回生物碱与茶皂素复配对番茄灰霉病菌表现出相加作用，可能是由于两种药剂对番茄灰霉的作用机理相同^[26]。文献报道茶皂素对多种杀菌剂都有较好的增效作用，研究表明茶皂素的抑菌增效机制主要是其可改善杀菌剂的理化性质，改变靶标病原菌体内生物酶的活性，增强靶标病原菌对杀菌剂的敏感性；田间增效机制主要是茶皂素作为一种非离子型表面活性剂，可提高药液的润湿沉积和对靶标作物的附着力、润湿力及有效沉积量，从而延长药效期，提高农药的田间防治效果^[30]。因此茶皂素对博落回生物碱的田间防效增效作用有待进一步深入研究。

本试验研究结果表明，博落回生物碱与茶皂素混配对辣椒疫霉病菌、瓜果腐霉病菌、番茄晚疫病菌和番茄灰霉病菌均具有一定的增效或相加作用。由增效系数可知，针对辣椒疫霉病菌，博落回生物碱与茶皂素质量比为1.0∶3.1的增效系数最大，可作为最佳配比；针对瓜果腐霉病菌，博落回生物碱与茶皂素质量比为1.0∶9.1时增效系数最大，可作为最佳配比；针对番茄晚疫病菌，博落回生物碱与茶皂素质量比为1.0∶8.1的增效系数最大，可作为最佳配比。该研究结果为植物源农药博落回生物碱对蔬菜病原菌的田间防治提供了科学依据。

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基金资助

贵州省千层次创新型人才培养项目（2020-［2018］-025号）

贵州省高等学校科技创新团队项目(黔教技［2023］097号)

国家民委中兽药重点开放实验室招标课题(［2021］006号)

武陵山民族药资源综合利用重点实验室(铜市科研［2021］34号)