三浅裂野牵牛SnRK2基因家族的鉴定和表达分析

Identification and Expression Analysis of SnRK2 Gene Family in Ipomoea trifida

摘要

蔗糖非酵解型蛋白激酶SnRK可分为SnRK1、SnRK2和SnRK3共3个亚族，其中，SnRK2是一类仅存在于植物中的蛋白激酶，已在多种植物中得到了鉴定，其在植物生长发育、胁迫响应和信号转导中发挥了重要作用。为探究三浅裂野牵牛中SnRK2基因家族的成员并推测其功能，利用拟南芥SnRK2蛋白序列，通过生物信息学方法筛选并鉴定ItfSnRK2基因家族成员，对各成员的特征进行分析，采用转录组数据分析ItfSnRK2各成员在不同组织和非生物胁迫下的表达谱。结果发现，三浅裂野牵牛中共有7个ItfSnRK2基因，分别位于6条不同的染色体上，依据染色体排列顺序依次命名为ItfSnRK2.1~ItfSnRK2.7，它们均含有保守的激酶结构域和调节结构域。进化树分析结果显示，ItfSnRK2分为3个亚家族。基因结构分析显示，同一亚家族的成员具有相似的基因结构和保守基序组成。表达谱分析则揭示了ItfSnRK2基因具有组织表达的特异性，ItfSnRK2.2、ItfSnRK2.3、ItfSnRK2.4和ItfSnRK2.5的表达受非生物胁迫诱导，可能与抗性调节有关，以上结果为进一步了解SnRK2基因在甘薯逆境胁迫响应和信号转导中的具体功能提供了重要线索，也为甘薯的抗逆性改良提供了潜在的基因资源。

Abstract

Sucrose nonfermenting-1-related protein kinase(SnRK) is a widely available non-glycolytic protein kinase involved in sucrose metabolism, which can be categorized into three subfamilies: SnRK1, SnRK2, and SnRK3. SnRK2 is exclusively found in plants and has been identified in various plant species, playing crucial roles in plant growth, development, stress response, and signal transduction pathways. In order to identify SnRK2 gene family members in Ipomoea trifida and speculate on their functions, in this study, using bioinformatics methods, ItfSnRK2 gene family members were screened and identified through blasting with the protein sequences of SnRK2 in Arabidopsis thaliana. And then the characteristics of each member were analyzed and their expression profiles in different tissues and under abiotic stress using transcriptome data were examined. The results revealed that there were seven ItfSnRK2 genes in Ipomoea trifida, all of which contained conserved kinase domains and regulatory domains. These genes were located on six different chromosomes and were named as ItfSnRK2.1-ItfSnRK2.7 based on chromosome arrangement order, and they could be divided into three subfamilies according to the evolutionary tree analysis results. Gene structure analysis showed that members of the same subfamily had similar gene structure and conserved motif composition. Expression profile analysis showed that ItfSnRK2 genes had tissue-specific expression patterns, and expression of ItfSnRK2.2, ItfSnRK2.3, ItfSnRK2.4, and ItfSnRK2.5 was induced by abiotic stress, possibly related to resistance regulation. The results of this study would provide important clues for further understanding the specific functions of SnRK2 gene in the stress response and signal transduction of sweet potato, and also provide potential gene resources for the improvement of sweet potato stress resistance.

Graphical abstract

关键词

三浅裂野牵牛 / SnRK2基因家族鉴定 / 生物信息学分析

Key words

Ipomoea trifida / SnRK2 gene family identification / bioinformatics analysis

干旱、寒冷、盐碱等环境胁迫会对植物的生长发育带来严重影响^[1]，而可逆蛋白磷酸化是植物细胞内发生的抵抗胁迫反应的重要方式^[2-3]。研究发现，SnRK是广泛存在于植物中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶^[4-6]，在植物胁迫信号转导通路中发挥了关键作用^[6]。基于序列相似性、特征结构域以及代谢作用，SnRK被细分为3个亚家族：SnRK1、SnRK2和SnRK3^[7]。与SnRK1不同，SnRK2和SnRK3仅在植物中存在，其中，SnRK2可将底物磷酸化，从而调节下游基因或转录因子的表达，在盐、干旱、低温胁迫以及种子萌发、果实成熟等过程中发挥了至关重要的作用。自小麦中发现了第1个SnRK2（PKABA1）基因以来^[3]，SnRK2基因家族已在多个物种中进行了鉴定和全面分析，包括拟南芥^[7]、草莓^[8]、土豆^[9]、棉花^[10]、烟草^[11]、地钱^[12]、甜瓜^[13]等。FUJII等^[14]分离得到了SnRK2.2单突变拟南芥以及SnRK2.2/SnRK2.3双突变的拟南芥，发现双突变体试验株对脱落酸高度敏感，经脱落酸处理后，双突变体试验组表现出明显的生长抑制。当拟南芥暴露于盐胁迫时，AtSnRK2.10被诱导表达，它通过维持有效的光合作用和防止氧化损伤提高植物的抗盐性^[15]。AtSnRK2.10还可通过与WRKY转录因子共同作用，参与调控非生物胁迫过程^[16]。MAO等^[17]通过在拟南芥中过量表达小麦TaSnRK2.4并获得转基因植株，转基因植株在抗盐、抗干旱以及抗冻害方面的表现均优于对照组。枸橘PtrSnRK2.4介导了PtrABF2的磷酸化过程，并通过促进腐胺合成，在植物抗旱性中发挥了积极作用^[18]。在苹果中，MdERDL6-1可诱导MdSnRK2.3的表达，通过对MdAREB1.1/MdAREB1.2的磷酸化提高MdTST1/MdTST2的转录活性，共同调节果实中可溶性糖的积累^[19]。

甘薯（Ipomoea batatas（L.）Lam）又名红薯、山芋，是旋花科的一种双子叶植物，世界第七大粮食作物，被认为是一种新型生物能源作物。干旱和盐等胁迫限制了甘薯的产量，但其响应非生物胁迫的机制尚不清楚。截至目前，甘薯SnRK基因的研究报道较少，主要集中在SnRK1在氮素吸收、碳同化和非生物胁迫响应的研究^[20-21]。甘薯是六倍体（2n=6x=90），由于甘薯复杂且高度杂合的遗传背景，其农艺性状的改良受到限制^[22]，使得研究人员对甘薯农艺性状的研究存在较大困难。

有研究表明，在番薯属的700个左右物种之中，二倍体三浅裂野牵牛（Ipomoea trifda，2N=2x=30）与甘薯的亲缘关系最近。故本研究对三浅裂野牵牛SnRK2基因家族进行了全面探讨，并分析了它们在不同组织中以及非生物胁迫下的表达谱，旨在为进一步阐明甘薯抗逆性机理提供理论基础，同时也为甘薯抗性品种的选育提供遗传基础。

1 材料和方法

1.1 ItfSnRK2基因家族的鉴定及其蛋白理化性质分析

I. trifida基因组序列和注释文件来自于密歇根州立大学建立的甘薯资源库（Sweetpotato Genomics Resource，http://sweetpotato.plantbiology.msu.edu/）^[23]。利用BioEdit软件，用拟南芥SnRK2蛋白序列在三浅裂野牵牛SnRK2蛋白数据中Blast，将E=0作为筛选标准^[24]，获得候选序列。利用在线程序CD-Search （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi/）和Pfam （https://pfam.xfam.org/）验证各候选序列是否存在蛋白激酶作用结构域^[25]。在基因组序列数据中得到ItfSnRK2各成员的序列信息，包括氨基酸序列、DNA序列、CDS序列，并基于gff文件，利用TBtools软件提取ItfSnRK2基因启动子序列，进行后续的深入分析。使用ExPASy Proteomics Server（https://web.expasy.org/protparam/）在线工具^[26]对ItfSnRK2蛋白质的理化性质进行分析，包括氨基酸数、分子质量（Molecular weight）和等电点（Isoelectric point，pI）等。

1.2 氨基酸序列比对

在Phytozome11.0数据库（http://phytozome.jgi. doe.gov/pz/portal.html#）中下载10个拟南芥SnRK2蛋白序列，采用DNAMAN软件对AtSnRK2和ItfSnRK2蛋白序列的保守结构域进行分析。

1.3 系统进化分析

在Genbank数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中分别下载10个水稻OsSAPK、8个马铃薯StSnRK2和9个辣椒CaSnRK2蛋白序列^[9，27-28]。利用MEGA 7.0构建三浅裂野牵牛、拟南芥、水稻、马铃薯、辣椒SnRK2蛋白的系统进化树，MEGA提供ClustalW和Muscle共2种多序列比对方法，选用ClustalW方法，采用Neighbor Joining（邻接法）构建系统进化树，Bootstrap重复值为1 000。

1.4 染色体定位分析

通过解析gff文件，获取ItfSnRK2各成员在染色体上的相对位置信息。利用TBtools^[29]软件进行可视化，并根据染色体定位结果对ItfSnRK2基因家族成员进行命名。

1.5 基因结构、保守结构域分析

使用TBtools中的Amazing Optional Gene Viewer功能对基因的结构进行分析。使用在线基序比对和搜索工具MEME（https://meme-suite.org/meme/）分析ItfSnRK2中的保守基序。基序的数目设置为10，其他参数为系统默认^[23]。

1.6 启动子顺式作用元件分析

为了分析ItfSnRK2启动子的顺式作用元件，利用TBtoolst提取ItfSnRK2基因起始密码子（ATG）上游的2 000 bp序列。在PlantCARE数据库（http://bioinforma-tics.psb.agent.be/webto-ols/plant-care/html/）预测顺式作用元件。使用Microsoft Office Excel 2019软件对数据进行处理，利用TBtools进行可视化。

1.7 组织特异性表达分析和非生物胁迫下的表达分析

在甘薯资源库中下载不同组织（花的愈伤组织FC、茎的愈伤组织SC、花Flower、花苞Flower bud、叶leaf、根Root）、不同非生物胁迫（冷胁迫Cold、热胁迫Heat、干旱胁迫Drought、盐胁迫NaCl）和脱落酸激素处理的转录组数据，采用TBtools对7个ItfSnRK2基因以FPKM取Log₂值并绘制热图。

2 结果与分析

2.1 ItfSnRK2基因家族的染色体定位与编码蛋白的理化性质分析

使用拟南芥SnRK2基因家族的蛋白序列在三浅裂野牵牛数据库中进行BLASTP比对，共鉴定到7个ItfSnRK2家族成员。基于染色体定位分析的结果，将它们依次命名为ItfSnRK2.1~ItfSnRK2.7^[30]，7个ItfSnRK2基因位于在三浅裂野牵牛的6条染色体上，其中第1、5、9、12、13号染色体上均包含1个ItSnRK2基因，第10号染色体上分布2个ItSnRK2基因（图1）。

由理化性质分析结果可知（表1），ItfSnRK2各成员的氨基酸数目介于337~364个，分子质量介于38 414.93~41 993.41 u，均为酸性、亲水性蛋白（pI<7.0，脂溶指数<100）。此外，ItfSnRK2.2、ItfSnRK2.3、ItfSnRK2.4、ItfSnRK2.6为不稳定蛋白；而ItfSnRK.1、ItfSnRK.5、ItfSnRK.7为稳定蛋白。

2.2 ItfSnRK2氨基酸序列比对

使用DNAMAN进行多序列比对，结果显示（图2），ItfSnRK2各成员与拟南芥AtSnRK2的氨基酸序列呈现出较高的相似性，说明ItfSnRK2的序列具有高度的保守性。由图2可知，SnRK2的蛋白序列具备典型的保守特征结构域，包括N端的激酶结构域和C端的调节结构域；N端的激酶结构域高度保守，包含ATP结合结构域（图2中用红色框标示）和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的活性位点（图2中用蓝色框标示）；而C端区域非常分散，包含了响应非生物胁迫的结构域（图2中用绿色框标示）和ABA诱导调节结构域（图2中用黄色框标示）。这些结构域的存在为SnRK2在生物学功能上的多样性和复杂性提供了结构基础。

2.3 系统进化分析

为了进一步研究ItfSnRK2蛋白和其他植物物种中蛋白质之间的进化关系，采用Neighbor Joining法（邻接法）对三浅裂野牵牛ItfSnRK2和拟南芥、水稻、马铃薯和辣椒SnRK2蛋白构建系统进化树，结果如图3所示：参照Hrabak等对拟南芥AtSnRK2的分类^[4]，图中涉及到的SnRK2序列可分为3个亚族（I、II和III）。其中，ItfSnRK2蛋白在亚族I有3个成员，分别是ItfSnRK2.3、ItfSnRK2.4、ItfSnRK2.6；亚族II中有2个成员组成，分别是ItfSnRK2.1、ItfSnRK2.7；亚族III有2个成员，分别是ItfSnRK2.2、ItfSnRK2.5。

2.4 基因结构、保守结构域分析

通过Tbtools分析ItfSnRK2的外显子/内含子结构，结果表明（图4），三浅裂野牵牛SnRK2成员均含有9个外显子；除ItfSnRK2.5和ItfSnRK2.7含有9个内含子外，其他的ItfSnRK2成员都含有8个内含子。

使用MEME预测了SnRK2蛋白的10个保守基序。由图4可知，各亚族成员的保守基序组成相似；利用MEME工具对ItfSnRK2蛋白序列的保守基序进行预测，结果显示，各亚族成员的保守基序组成具有较高的相似性。7个ItfSnRK2成员均存在Motif 1~Motif 7，而值得注意的是，Group I的3个基因均含有Motif 8和Motif 9；Group II 中亲缘关系更近的2个基因ItfSnRK2.2和ItfSnRK2.5在5′端含有Motif 10。

2.5 顺式作用元件分析

为了更好地研究ItfSnRK2基因的功能，利用PlantCARE在线工具对ItfSnRK2基因启动子区域内的顺式作用元件进行了分析，结果显示（图5），三浅裂野牵牛SnRK2基因家族存在不同种类的顺式作用元件，主要包括16种光响应元件，8种激素响应元件和5种应激相关元件。

激素响应元件中，6个ItfSnRK2成员（除ItfSnRK2.4外）的启动子上均含有多个脱落酸响应元件（ABRE）。茉莉酸甲酯诱导响应元件（TGACG-Motif和CGTCA-Motif）在6个ItfSnRK2成员（除ItfSnRK2.6外）的启动子上都存在。5个成员的启动子上均含有水杨酸反应元件（TCA-element）。另外，还鉴定到生长素响应元件（TGA-element）、赤霉素响应元件（TATC-box，P-box，GARE-Motif）。

所有成员中均含有1种或多种应激相关元件，厌氧诱导响应元件（ARE）数量相对较多，除ItfSnRK2.3外的6个成员均含有；其次，在各成员启动子序列中还鉴定到缺氧诱导响应元件（GC-motif）、干旱响应元件（MBS）、低温响应元件（LTR）和压力胁迫响应元件（AT-rich element）；另外，ItfSnRK2所有成员中均含有1种或多种光响应元件。结果说明，ItfSnRK2成员可能参与激素和应激反应的调控。

2.6 ItSnRK2家族基因的表达谱分析

为研究三浅裂野牵牛SnRK2家族基因在花的愈伤组织、茎的愈伤组织、花、花苞、叶、根中的表达谱，以FPKM取Log2值后作图，结果如图6-A所示，所有成员均在1个或多个组织中表达，其中，ItfSnRK2.2、ItfSnRK2.3、ItfSnRK2.4在所有组织中表达量均较高，ItfSnRK2.7在各组织中表达量均较低。

如图6-B所示，ItfSnRK2.5在各种胁迫下表达量均较高，ItfSnRK2.2显著地响应了冷胁迫和ABA胁迫的诱导；ItfSnRK2.1和ItfSnRK2.7在5种胁迫处理下的表达量均呈现较低水平；ItfSnRK2.3和ItfSnRK2.4在除了冷胁迫之外的4种胁迫处理下的表达量较高；而ItfSnRK2.6在5种胁迫处理下几乎不表达。说明植物在处于非生物胁迫逆境时，部分ItfSnRK2基因表达量提高，有利于植物响应胁迫从而更好地适应环境，但具体的调控机理目前尚未研究清楚。

3 结论与讨论

3.1 ItfSnRK2成员的鉴定以及序列特征分析

目前，许多学者已经在拟南芥^[7]、甜瓜^[13]、烟草^[11]等多个物种中鉴定了SnRK2基因家族，它们是植物中普遍存在的一种蛋白激酶，与植物的生长发育息息相关。本研究在三浅裂野牵牛的全基因组中鉴定到7个SnRK2成员。ItfSnRK2基因家族成员编码的氨基酸残基数为334~364个，蛋白的分子质量在40 kD左右，7个ItfSnRK2蛋白的等电点都小于7，都为酸性，且均为亲水性蛋白，这一结果与甜菜（Beta vulgaris L.）SnRK2基因家族的蛋白质理化性质的研究结果相似^[25]。

多序列比对结果表明，ItfSnRK2的蛋白序列高度保守，且均具有典型的N端激酶结构域和C端调控结构域，包含ATP结合结构域、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的活性位点和ABA诱导调节结构域等，这一结果与在薄壳山核桃中的研究结果一致^[31]。已有研究发现，C端的保守结构域与ABA信号感知有关^[6]。

ItfSnRK2各成员的序列分析结果表明，同一亚族的ItfSnRK2成员，其蛋白序列的保守基序相似，且基序位置及排列顺序都十分相似。通常，相似的外显子/内含子和保守基序分布模式意味着它们具有相似的功能^[32]。但在物种的进化过程中，还会发生其他事件，如基因复制，可能会导致基因功能的分化^[33]。Motif 8和Motif 9仅存在亚族Ⅰ的3个成员中，而Motif 10仅在亚族Ⅲ的成员中出现，这些独特的保守基序可能与ItfSnRK2的功能密切相关。因此，进一步深入研究这些保守基序的具体作用与功能十分必要。

3.2 ItfSnRK2成员在植物非生物胁迫响应中的潜在功能

在辣椒中，启动子上不同的顺式作用元件可能会造成基因的不同表达模式^[34]。在ItfSnRK2各成员的启动子上共鉴定到29种不同的作用元件，主要包括16种光响应元件、8种激素响应元件和5种应激相关元件。不同的启动子顺式作用元件组成可能是各成员在转录水平上发挥不同功能的原因之一^[35]。

研究发现，SnRK2在生物和非生物胁迫下被激活^[30]。第I亚族的3个成员中，ItfSnRK2.6在茎和花苞中的表达量相对较高，但在叶和根中的表达量相对较低；而ItfSnRK2.3和ItfSnRK2.4在各组织中的表达量均相对较高。虽然ItfSnRK2.6的启动子上存在多个ABRE元件，但其在脱落酸处理下并不表达或表达量较低，且在其他的几种胁迫下表达量也均较低，可能与ItfSnRK2.6的组织特异性表达有关。由非生物胁迫下的表达谱分析结果可知，ItfSnRK2.3、ItfSnRK2.4在冷胁迫、热胁迫、干旱胁迫和脱落酸处理下均有较高的表达量，它们的启动子上均鉴定到多种激素和应激响应元件，如ABRE和ARE等。

而第II亚族（ItfSnRK2.1、ItfSnRK2.7）的2个成员中，ItfSnRK2.1在根和茎中的表达量相对高于叶，ItfSnRK2.7在三浅裂野牵牛各组织中的表达量均较低，它们在各种胁迫处理下的表达量也都较低。ItfSnRK2.7启动子上应激响应类元件中只存在2个厌氧诱导响应元件，ItfSnRK2.1存在5个厌氧诱导响应元件，1个缺氧诱导响应元件和1个低温胁迫元件。推测不同的顺式作用元件与它们在非生物胁迫下的低表达情况有一定关系。

第Ⅲ亚族（ItfSnRK2.2、ItfSnRK2.5）成员在各组织以及各胁迫处理下均有较高的表达量。它们的启动子上存在应激响应元件（MBS和LRT等）。因此，推测4个成员（ItfSnRK2.2、ItfSnRK2.5、ItfSnRK2.3和ItfSnRK2.4）可能参与调控了非生物胁迫过程。

根据系统进化关系可知，ItfSnRK2.3/ItfSnRK2.4与StSnRK2.4、AtSnRK2.4的进化关系接近，结合已发现的过表达AtSnRK2.4拟南芥在萌发期及萌发后，对盐胁迫的耐受性得到了显著提升^[36]；而StSnRK2.4的表达量随盐胁迫处理时间延长呈现出先增后减的趋势，且在处理2 h时达到峰值^[9]。且表达谱分析发现，ItfSnRK2.3和ItfSnRK2.4响应了盐胁迫，推测ItfSnRK2.3和ItfSnRK2.4可能与I. tridifa的耐盐性相关。此外，AtSnRK2.2/AtSnRK2.3/AtSnRK2.6蛋白激酶可被渗透、盐、冷和ABA处理激活，过表达AtSnRK2.6可提高转基因拟南芥的种子产量^[37]；另外，AtSnRK2.6在ABI5-FLC推迟开花的机制中也发挥了重要作用^[38]。因此，与AtSnRK2.2/AtSnRK2.3/AtSnRK2.6进化关系接近的ItfSnRK2.2和ItfSnRK2.5可能在植物生长发育和胁迫响应中也发挥了重要作用，值得深入研究。

综上，本研究在三浅裂野牵牛全基因组水平上分析了SnRK2基因家族，共鉴定到7个ItfSnRK2基因，分布在6条不同的染色体上，被分为3个亚族。ItfSnRK2基因启动子区含有光响应、激素响应和应激相关元件，且数量不同。在7个成员中，ItfSnRK2.2、ItfSnRK2.3、ItfSnRK2.4和ItfSnRK2.5的表达受非生物胁迫诱导，可能与抗性调节有关，该结果为后续深入研究提供了依据和参考。

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基金资助

山西省“1331工程”重点学科建设计划经费(1331KSC)

山西省高校科技创新项目(2021L523)

山西省高校科技创新项目(2023L332)