外源GA对夏黑葡萄果梗代谢的影响

Effect of GA on Metabolism of Summer Black Grape Pedicels

摘要

利用赤霉素（GA）蘸穗处理葡萄是促进果实膨大的重要途径，研究葡萄膨大期间，外源GA诱导的葡萄果穗花梗器官代谢生理变化，可为科学解释GA处理后花梗与果实的协同发育机制提供依据。以夏黑葡萄为材料，在葡萄盛花期（FFS）分别用15、0 mg/L GA蘸穗处理果实，在处理后的第7天（FFS15-1、FFS0-1）、第20天（FFS15-2、FFS0-2）采样2次；于果实膨大期（FES）在前期的处理基础上再用25 mg/L GA进行第2次处理，并于处理后第7 天采样（FES25），采用液相色谱-质谱（LC-MS）检测、鉴定、筛选、注释差异代谢物（SDM）和被富集的代谢途径（MPSE）。结果表明，FFS15-1与FFS0-1相比，出现54种差异代谢物，且上调的SDMs有31种，多具有抗氧化活性，其中，4-coumaric acid参与Phenylpropanoid biosynthesis途径，可加剧木质素的积累；下调的SDMs有23种，主要为氨基酸类，且参与aminoacyl tRNA biosynthesis途径，有利于氮素转运。FFS15-2与FFS0-2相比，上调的SDMs有42种，多与氮素转运、转化有关，表明该时期葡萄对氮素需求强烈。FES25与FFS0-2相比，出现33种SDMs，其中，Indole-3-acrylic acid、Indole-4-carboxaldehyde显著上调，主要起生长调节作用，可能是外源GA处理花梗后的核心代谢产物，直接促进果实膨大和坐果；而FES25与FFS15-2相比，仅产生9个SDM，表明二者间的代谢特征相似，但Trigonelline和（15Z）-9,12,13-Trihydroxy-15-octadecenoic acid显著下调，可缩短细胞周期，加速花梗细胞分裂促进生长。葡萄开花后期至膨大初期，用GA蘸穗处理后，果粒迅速膨大，代谢物Indole-3-acrylic acid、Indole-4-carboxaldehyde运输至果实后有助于提高坐果率，代谢物Trigonelline和（15Z）-9,12,13-Trihydroxy-15-octadecenoic acid显著下调可加速器官发育，这与此期果实膨大需求相一致。

Abstract

Dipping treatment using gibberellic acid(GA) in grape fruits is an important way to promote fruit enlargement. Study on the metabolic physiological changes of pedicel organs induced by exogenous GA during grape expansion can provide a basis for scientific explanation of the collaborative development mechanism of pedicels and fruits after gibberellic acid treatment. In this study, summer black variety(Vitis vinifera L×Vitis labrusca L) was used as the material. The grapes were treated by dipping with 15 mg/L and 0 mg/L of GA at full flowering stage(FFS), and sampled twice on the 7th days(FFS15-1, FFS0-1) and 20th days(FFS15-2, FFS0-2) after treatment. At the fruit expansion stage(FES), the grapes were treated twice with 25 mg/L of GA on the basis of the previous stage, and then sampled after 7 days(FES25). LC-MS was applied to detect, identify, screen, and note significantly differential metabolites(SDM) and metabolic pathways of significant enrichment(MPSE). The results showed that FFS15-1 exhibited 54 differential metabolites compared to FFS0-1, and there were 31 upregulated SDMs, most of which had antioxidant activity. Among them, 4-coumaric acid participated in the phenylpropanoid biosynthesis pathway, which could exacerbate lignin accumulation. There were 23 downregulated SDMs, mainly amino acids, and they participated in the aminoacyl tRNA biosynthesis pathway, which was beneficial for nitrogen transport; compared to FFS0-2, FFS15-2 upregulated 42 SDMs, mostly related to nitrogen transport and transformation, indicating a strong demand for nitrogen in grapes during this period. Compared with FFS0-2, FES25 had 33 SDMs, significantly up-regulated Indole-3-acrylic acid and Indole-4-carboxaldehyde,which played a role in growth regulation and might be the core metabolic product of exogenous GA treatment on pedicels, directly promoting fruit expansion and fruit setting. Compared with FES15-2, FES25 only produced 9 SDMs, indicating that the metabolic characteristics between them were similar，and Trigonelline and(15z)-9,12,13-trihydroxy-15-octadecenoic acid were significantly down regulated, which could shorten the cell cycle, accelerate division of pedicel cells, and promote growth. From the late flowering stage to the early stage of grape expansion, after being treated with GA, the fruit rapidly expanded. The transportation of metabolites Indole-3-acrylic acid and Indole-4-carboxylate to the fruit helped to improve fruit setting rate. The significant downregulation of metabolites Trigonelline and(15Z)-9,12,13-Trihydroxy-15-octadecenoic acid could accelerate organ development, which was consistent with the demand for fruit expansion during this period.

Graphical abstract

关键词

葡萄花梗 / 外源赤霉素 / 差异代谢物 / 液相色谱-质谱 / 代谢途径 / 协同代谢机制 / 果实膨大

Key words

grape pedicel / exogenous gibberellic acid / differential metabolites / liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) / metabolic pathways / collaborative metabolic mechanism / fruit-expansion

一般多倍体葡萄（如夏黑、巨峰）长势旺、抗性强，有长成大粒葡萄的潜力，但存在结实不良现象^[1]。葡萄花后的膨大期间用赤霉素（GA）类生长调节剂蘸穗，可促进坐果并获得商品性极佳的大粒葡萄^[2-3]。蘸穗后GA不仅作用于果粒，还作用于花梗等器官，从而改变花梗代谢。葡萄花梗在整个果穗中起支撑和运输功能^[4]，在葡萄生长和组成中起关键作用^[5]，能将水、糖、信号等输送到果实。花梗发育可影响葡萄的外观，如花梗短会使果粒紧凑，增加病害风险，适宜的花梗长度可使果粒均匀，有利于着色和综合品质提高，这也是葡萄花前使用GA拉穗的原因。目前，关于外源GA蘸穗促进坐果与膨大的研究多集中于果粒，极少涉及果梗，探索GA蘸穗处理后果粒与果梗的协同代谢机制，有助于提高对葡萄果粒膨大的科学认识。有研究证实，葡萄花梗的直径和果粒大小间存在相关性^[6]，GA处理后，花梗的组织结构和生理代谢会根据浆果即将到来的运输和机械要求进行调整^[7]，如促进维管发育以满足浆果膨大需求^[8]，但木质素基因生物合成的提前和过度表达，极易在果实成熟期和贮藏期间导致花梗变硬、变脆，导致浆果脱落^[9-10]。外源GA诱导葡萄花梗的代谢物和代谢途径变化，既能反映花梗本身的生长特征，也能反映果实的代谢物需求，有助于解释赤霉素处理后器官间的协同代谢机制。

本研究在果实盛花期和膨大期利用GA处理果穗，使用LC-MS代谢组研究技术，研究GA诱导花梗代谢物和代谢途径变化，为揭示花梗代谢变化对促进浆果膨大的机制提供支持，也为葡萄膨大技术的改进提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

试验地位于兰州市红古区，国家葡萄产业技术体系兰州综合试验站种植基地。当地海拔1 700 m，年均气温9.1 ℃，降水量450 mm，日照时数2 700 h，无霜期160 d。

1.2 试验方法

试材为5年生夏黑葡萄，促早栽培，砧木5BB。株距1.2 m，行距2 m，独龙蔓树形，V型叶幕。每处理10棵树，重复3次，所有处理的负载量一致，每棵树留10穗葡萄，并统一于花前4月17日整穗，留穗尖5 cm。2次使用GA蘸穗处理果穗，GA用量为生产中比较成熟的使用浓度，其中，4月26日盛花期（Full flowering stage，FFS），设置0 mg/L（FFS 0）和15 mg/L（FFS 15）2个赤霉素处理，其作用是拉长果穗和促进坐果，每个处理5个果穗，3次重复；5月12日果实膨大期（Fruit expansion stage，FES），以上2个处理均使用25 mg/L赤霉素处理1次，促进果实膨大。每个处理5个果穗，3次重复。其他管理措施一致。

1.3 测定项目及方法

每处理随机摘取不同果穗的40粒葡萄，迅速剪下其花梗，加液氮利用研钵研磨后，置于液氮中保存待测。其中，5月1日第一次采样，编号为FFS 0-1和FFS 15-1；5月20日再次采样，编号为FFS 0-2和FFS 15-2。果实膨大期处理过的5月20日采样记为FES 25。

1.3.1 仪器

使用高分辨Q-Exactive HF质谱仪分析代谢组变化，其主要原理是利用液相色谱柱将代谢产物分离出来，再将这些分离后的代谢产物通过电离源转化为离子，最后在质谱仪中进行精确的质谱分析^[11]。

1.3.2 代谢物定性

对检测出的代谢物特征，使用Compound Discoverer 3.1软件进行保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐等工作，同时利用Thermo mzCloud在线数据库、Thermo mzValut本地数据库、ChemSpider数据库等进行物质鉴定。

1.3.3 主成分分析（PCA）

PCA分析前，先对QC样本TIC总离子流图进行重叠，然后对进行差异比较的分组样品进行主成分分析。

1.3.4 差异分组的正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）

采用OPLS-DA分析代谢物的组间差异与试验组的相关程度信息。利用SIMCA软件进行OPLS-DA模型评估。

1.3.5 差异代谢物筛选

首先，对样本进行t-Test假设检验，选取P<0.05的代谢物，确保选出的代谢物在统计学上具有显著性差异。计算代谢物的Fold Change，初步筛选可能具有生物学意义的代谢物。|log₂（Fold Change）|≥1，表明这些代谢物在2组样本间有着至少2倍的变化幅度。在OPLS-DA模型中，通常认为VIP>1的代谢物在区分不同类别样本中起着重要作用。

本研究最终筛选条件为|log₂（Fold Change）|≥1、P<0.05及VIP>1，所选代谢物不仅在表达量上具有显著差异，而且在统计学上具有显著性，同时对样本分类具有高度影响能力和解释能力。

1.3.6 差异代谢物KEGG功能注释及富集分析

利用MetaboAnalystR进行KEGG通路富集。

2 结果与分析

2.1 统计分析

2.1.1 QC总样本PCA得分图

QC样本PCA能反映样本间总体代谢差异。由图1可知，QC总样本均聚集在一起，表明样本数据可靠。FES 25和FFS 15-2处理间有部分重叠，表明2个处理总样本间的代谢物差异小，其他处理样本间均被某主成分清晰分离，且2个主成分得分在0.7左右，表明它们间的代谢存在明显差异。

2.1.2 组内PCA

由图2可知，在95%的置信区间内，任2组样本均被第一主成分明显分开，不同处理的2个主成分得分均在0.7左右，表明样本间存在明显的代谢差异，数据可信。

2.1.3 OPLS-DA

从图3、4可以看出，OPLS-DA模型可以很好地解释处理组间的差异，95%置信区间（Hotelling's T-squared ellipse）内，不同对比组均被明显区分，R值接近1，Q值>0.5，表示模型稳定可靠。同时随着置换保留度逐渐降低，置换的Y变量比例增大，随机模型的R²和Q²均逐渐下降，说明原模型不存在过拟合现象，表明所建模型稳定可靠。

Fig.4　Construction and verification of OPLS-DA model

2.2 差异代谢物的筛选与鉴定

2.2.1 差异代谢物统计

不同处理间具有显著差异的代谢物（Significantly differential metabolites，SDM）如表1，盛花期FFS 15-1与FFS 0-1间共出现54个SDM，到膨大期FFS 15-2与FFS 0-2间SDM增加到64个，这是GA引起的代谢差异变大。FES 25与FFS 0-2处理间产生33个SDM，而FES 25与FFS 15-2处理间有23个SDM，表明后者代谢差异较小。

2.2.2 盛花期GA处理

FFS 15-1与FFS 0-1间差异代谢物与KEGG途径如表2所示。

从表2可以看出，花期使用GA3处理7 d后，FFS 15-1与FFS 0-1间出现的SDMs按VIP排序，前20种SDMs中上调的有12种，包括酚类、黄酮类和有机酸类，且多具有抗氧化能力，如Catechin，Phaseolic acid等。下调的8种SDMs包括5种氨基酸，分别为Leucine，D-（+）-Proline，Valine，Threonine和L-tyrosine。此外，Rhododendrin具有良好的抗氧化能力，但发生显著下调。表明GA处理花梗后，首先对抗氧化类和氨基酸代谢物产生影响。从显著富集的代谢途径（Metabolic pathways of significant enrichment，MPSE）看，ko00941途径包含3种抗氧化类SDMs，ko00970、ko00290途径有3种氨基酸类SDMs参与，而Valine参与5条MPSEs，意味着这些代谢途径和代谢物比较活跃。

用GA处理20 d后，按VIP对FFS 15-2和FFS 0-2间的前20种差异代谢物排序（表3），发现4种SDMs下调，包含3种氨基酸和1种丙酸衍生物，其中Leucine、D-（+）-Proline的下调倍数最大。上调的SDMs有13种，为氨基酸和酰胺类物质，列VIP前3位的为L-Glutamine，Catechin，L-Pyroglutamic acid。ko00970，ko00220，ko00330分别包含5、3、3个SDMs。而L-Glutamic acid，L-Glutamine，Leucine分别参与9、7、4个MPSEs，表明这些代谢物和代谢途径是该时期比较重要的。

2.2.3 果实膨大期GA处理

从表4可以看出，果实膨大期使用GA处理7 d后，FES 25与FFS 0-2间总SDMs不足20个，仅6种SDMs参与MPSEs，下调的3种SDMs包括2种有机酸（Glucoheptonic Acid和Urocanic acid）和一种含硫化合物（thiourea）。上调的SDMs主要为5种氨基酸和3种糖。按VIP排序，Indole-3-acrylic acid，Proline，2-Hydroxycinnamic acid排列前3位，是2个处理间最重要的SDMs。L-Tyrosine则参与5条MPSEs，表明L-Tyrosine是该时期比较重要的代谢物。

FES 25与FFS 15-2处理间仅出现9个SDMs，其中，2个下调的SDMs可调节细胞周期。上调的SDMs中2-（4-Bromobenzyl）-3-sulfanylpropanoic acid的VIP最高。2个处理间未富集任何1条MPSEs，表明2个处理间代谢特征相似（表5）。

3 结论与讨论

果穗松紧程度能影响葡萄商品性^[12]。GA是葡萄生产中最常用的生长调节剂，并在一个生长季多次使用，GA作用于果粒的同时，也影响花梗生长，而花梗是水、糖、营养物质和信号输送到葡萄浆果的必经之路^[13]。GA处理诱导的花梗代谢物变化，既反映花梗本身代谢特征，也反映果实膨大期间的代谢需求，对揭示花梗在果实膨大中的作用有重要意义。

3.1 盛花期GA处理与代谢变化

有研究证实，外源GA处理后，植物器官抗氧化能力增强，这与多个相似研究的结果一致^[14-15]。本研究发现，盛花期用GA处理果穗后，FSS 15-1与FSS 0-1间上调的SDM中多数具有抗氧化活性，如Catechin，Eriodictyol，（-）-Rhododendrin等，且它们参与的代谢途径ko00941也被显著富集，这对保持花梗活力有重要意义。上调的SDM中Phaseolic acid是一种羟基肉桂酸，具有抗氧化、延迟衰老作用^[16]，其同类物质4-Coumaric acid也发生显著上调，且参与ko00940、ko00130途径，这与其他研究结果一致，即GA3处理后苯丙素的生物合成代谢途径增强，促进木质素或类黄酮的生物合成，这也在很多研究中得到证实^[17]。虽然花梗器官中木质素持续积累可增强机械强度，但过度积累可能是造成葡萄成熟和贮藏期间落粒严重的关键因素^[18]，这是GA处理后造成的主要负面影响。3-Methoxycinnamic acid也是一种肉桂酸，但发生显著代谢下调，这可能与该SDM性质活泼，易转化成Isoorientin 2-O-（E）-p-coumarate和Kaempferol 3-（6-p-coumaryl-galactoside）等有关^[19]。FSS 15-1与FSS 0-1间下调的SDM主要是氨基酸，包括Leucine、Valine、Threonine，分别参与5、4、3条MPSEs，L-tyrosine也发生下调，但未被富集到某一代谢途径。所富集的Aminoacyl-tRNA biosynthesis（ko0097）途径包括基因表达的核心反应，氨基酸在掺入肽链以前必须活化获得额外能量，活化反应是在氨酰-tRNA合成酶催化下进行^[20]。本研究多种氨基酸代谢下调可能主要用于合成Aminoacyl-tRNA。此外，Leucine和Valine还参与ko00280途径，其中Valine降解产生1个丙酰辅酶A，Leucine分解代谢产生3个乙酰辅酶A，再进入TCA循环彻底氧化分解，产生ATP^[21]，所以，此时大量氨基酸降解、转运可满足快速生长期间对物质和能量需求。

20 d后，FFS 15-2与FFS 0-2间的Leucine、Valine代谢持续下调。此期重要的上调SDM有L-Glutamine、L-Glutamic acid和L-Pyroglutamic acid等，L-Glutamine可帮助快速增殖的细胞满足对ATP、生物合成前体和还原剂的需求^[22]，而在植物组织培养中，L-Glutamine对芽伸长的影响大于GA^[23]，此外，它还在器官间的氮运输中起着关键作用^[24]，有助于更多的氮素往果实积累。L-Glutamic acid作为GA的前体，触发植物从营养生长阶段到生殖生长阶段的过渡，并在植物生殖阶段发挥作用^[25]。L-Pyroglutamic acid则在氮同化中起重要作用，表明此时植物对氮素的需求增大。研究还发现，L-Glutamic acid参与9条MPSEs，涉及多种氨基酸的生成和转化，因此，L-Glutamic acid是此期最活跃的SDM。实际生产中，盛花期用GA处理20 d后，正是葡萄快速生长阶段，也是葡萄进行GA膨大处理的关键时期，此期葡萄对氮素需求旺盛。该时期花梗中与氮素代谢相关的SDM最终会被运输至果粒发挥作用，更多体现花梗的运输功能。

3.2 果实膨大期GA处理与代谢变化

FES 25进行了保果和膨大2次处理，而FFS 0-2前期仅用清水处理，它们间出现的SDM中，Indole-3-acrylic acid的VIP值最大，研究显示它可由L-色氨酸解氨酶将L-色氨酸转化为吲哚3-丙烯酸和氨生成^[26]，被认为是一种植物生长激素，这可能是外源GA促进器官快速生长的关键SDM。对芳香族氨基酸研究发现，色氨酸在单独使用GA₃或PAC+GA₃处理的植物中含量明显升高，而在GA缺乏的植物中色氨酸含量持续降低^[27]，而这能间接影响Indole-3-acrylic acid生成，进而影响组织生长。该对比组还发现，Indole-4-carboxaldehyde代谢显著上调，在小麦中的研究证实代谢物tryptophan和4-indolecarbaldehyde与每穗粒数显著相关^[28]，结合本研究葡萄发育时间和GA处理时间分析，Tryptophan和4-indolecarbaldehyde对促进葡萄坐果也有直接作用。该对比组中Fructose 1、6-bisphosphate和β-D-glucopyranose显著上调，但未被富集到糖酵解途径。此外，蔗糖在植物生长发育中起着重要作用，是光合作用的主要终产物，并作为初级运输糖发挥作用，最终会被运输到果实，也间接证实GA处理后有助于糖的积累^[29]。GA对中枢代谢物积累模式的影响早期证据表明，在正常（非应激）生理条件下，植物在向开花过渡期间积累Proline^[30-31]。该对比组Proline显著上调，参与被显著富集的ko00330、ko00970途径，意味着Proline代谢和运输的重要性，这与前期的研究结果一致^[32-33]。

FES 25进行了保果和膨大2次处理，FFS 15-2仅进行保果处理，它们间的SDM仅9个，其中，2个下调，没有任何一条代谢途径被富集，证实二者间的代谢特征相似。上调的SDMs中2-（4-Bromobenzyl）-3-sulfanylpropanoic acid结构与Cysteine相似，也可能在防御逆境和氧化还原过程中发挥作用^[34]，而二硫化物的形成是氧化应激的常见结果，以作为蛋白质高阶结构的稳定剂或其生物活性的活性中心^[35]。本研究还发现，Trigonelline显著下调，并细胞周期调节因子发挥作用，可导致G2期细胞停滞，干扰DNA复制，进而延长细胞周期^[36]。SDMs中还发现，（15Z）-9,12,13-Trihydroxy-15-octadecenoic acid也发生显著下调，研究证实该物质存在于丁香芽的乙醇部分中，具有最高的抗氧化活性，可诱导线粒体活性并延迟细胞周期的G1期，使酵母细胞周期停滞在G1期^[37]。所以，果实膨大期用GA处理果穗后，葡萄果肉的细胞周期缩短，这是促进葡萄快速膨大的核心机制。

盛花期用15 mg/L GA处理果穗7 d，花梗中先上调的差异代谢物多具有抗氧化活性，这有利于保持花梗活力。4-Coumaric acid也显著上调并参与Phenylpropanoid biosynthesis途径，这能加剧木质素的积累，从而影响花梗组织结构。下调的氨基酸类代谢物主要参与Aminoacyl tRNA biosynthesis途径，有利于氮素转运，并为后期的快速生长提供物质和能量准备。20 d后，Leucine、Valine代谢保持持续下调，上调的差异代谢物均与氮素的转运、转化有关，表明该时期葡萄生长对氮素需求旺盛，而L-Glutamic acid参与9条代谢途径，是这个时期最活跃的代谢物。

果实膨大期用25 mg/L GA处理的果穗，与未经任何处理的果穗相比，花梗中的Indole-3-acrylic acid、Indole-4-carboxaldehyde显著上调，能直接促进果实膨大和坐果，这可能是外源GA发挥作用的核心代谢产物。此期，脯氨酸和多种糖类物质显著上调，也是该时期的代表性差异代谢物。FES 25与FFS 15-2间被富集的差异代谢物仅出现9个，且没有任何一条代谢途径被富集，证实两者间的代谢特征相似，但其中Trigonelline和（15Z）-9,12,13-Trihydroxy-15-octadecenoic acid显著下调，能缩短细胞周期，加速浆果膨大，这是GA在FES期的主要作用机制。

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基金资助

兰州文理学院博士基金项目(202205)

国家葡萄产业技术体系兰州综合实验站(CARS-29-23)