植物氮代谢与氮素利用遗传基础研究进展

Research Progress on Nitrogen Metabolism and Genetic Basis of Nitrogen Utilization in Plant

摘要

植物养分高效利用的分子调控机理是植物科学中重大的基础科学问题，同时也是保障国家粮食安全和生态安全的重要基础。氮元素作为植物生长发育所必需的一类大量营养元素，是影响作物生长和产量的关键因素。工业革命后，伴随氮肥在农业生产中的规模化使用，全球粮食产量逐年稳步提升，但同时造成土壤酸化板结、水体富营养化、空气污染等系列生态安全问题。近些年，聚焦植物氮素利用效率调控机制或氮高效育种的理论研究与应用研究逐渐成为国内外科学家的研究热点。植物氮素利用效率是受多种遗传和环境因素互作调控的复杂性状，涉及到氮素的吸收、转运、同化、再利用等多个代谢过程。文章综述了调控植物氮素吸收与转运、氮素同化、氮素再分配或再利用的关键因子及其分子网络，重点总结近些年我国植物科学家在解析作物氮素利用效率遗传基础上取得的重要进展，探讨植物氮素利用效率调控基因在水稻、小麦、玉米等主粮作物氮高效与高产协同育种中的应用潜力。最后，展望了未来作物高产高效育种设计策略，强调遗传资源在氮素利用效率改良中的必要性。

Abstract

Molecular regulatory mechanism underlying efficient nutrient utilization in plants is an important subject for theoretical research in plant science, and is also an important foundation to ensure national food security and ecological security. Nitrogen, acting as an essential macronutrient for plant growth and development, is a key factor determining crop growth and production. Along with occurrence of the first Industrial Revolution, a large-scale application of nitrogen fertilizer in agricultural activities led to a gradually and steadily increasement of crop yield on a global scale, while posed a serious threat to ecosystem security, such as soil acidification and compaction, anthropogenic eutrophication, and air pollution, etc. Recently, both the theoretical research and applied research focusing on the molecular mechanism of plant nitrogen use efficiency (NUE) or crop NUE improvement during breeding program become hot research topics for scientists around the world. Plant NUE is a complex trait modulated by interactions of various genetic and environmental factors, involving in multiple metabolic processes including uptake, transport, assimilation, and reutilization or remobilization of nitrogen. In this review, the key components and the molecular networks controlling nitrogen uptake and transport, nitrogen assimilation, nitrogen remobilization or reutilization were introduced, recent progresses in elucidating the genetic basis of crop NUE mainly made by Chinese scientists were summarized, and furthermore, the application potential of NUE genes in the program of high-NUE and high-yield synergistic improvement in staple food of rice, wheat, and maize was explored. Finally, strategies for breeding high-yield and high-efficiency cultivars in future were proposed, and the necessity of genetic resources in crop NUE improvement was emphasized.

Graphical abstract

关键词

氮 / 氮代谢 / 氮素利用效率 / 遗传基础 / 产量 / 作物

Key words

nitrogen / nitrogen metabolism / nitrogen use efficiency (NUE) / genetic basis / yield / crop

现代农业生产的可持续发展与作物养分利用效率的改良紧密相关。氮元素是植物生长发育所必需的大量营养元素之一，也是影响作物产量的关键因素。工业革命之后，伴随种质资源的创新、栽培管理的优化，尤其是氮肥在农业生产上的大面积使用，全球粮食产量得到了稳步提升。然而，在全球极端天气变化、农业耕地质量退化等背景下，现代作物品种过度依赖氮肥带来的增产、稳产效应，将会面临愈加严峻的挑战，培育氮高效品种是应对此系列问题的根本策略。因此，由国际水稻、小麦、玉米研究中心等组成的国际农业研究磋商组织提出了通过改良养分利用效率以提高作物产量为目标的第二次绿色革命^[1]。现阶段，我国耕地普遍存在土壤氮沉积量偏高的问题，过量使用化肥造成的负面效应日益突出，如何依靠科技力量推动农业生产减肥增效、挖掘氮素利用效率（Nitrogen use efficiency，NUE）调控网络并培育氮高效品种，是我国农业可持续发展亟待解决的一个科学问题。因此，本文将综述植物氮代谢与氮素利用遗传基础的最新研究进展，以期为推动我国农业可持续发展提供新思路。

1 植物氮代谢调控网络

植物、动物和人类体内氮素的最初来源，几乎全部来自于土壤。植物从土壤中获取氮素主要包括3个过程，即氮素吸收与转运、氮素同化以及氮素再分配或再利用（图1）^[2-3]。相应地，植物氮素利用效率主要包括氮素吸收效率（Nitrogen uptake efficiency，NUpE）、氮素同化效率（Nitrogen assimilation efficiency，NAE）、氮素再利用效率（Nitrogen remobilization efficiency，NRE）等，受多种遗传因子、环境因素及其互作的调控。其中，NUpE和NAE是影响农作物NUE的2个主要因素。

1.1 氮素吸收与转运

植物吸收与转运无机氮源的主要形式是硝酸根离子和铵根离子^[4]。一般认为，富氧型土壤中无机氮源的主要形式是硝酸根离子，而水田、湿地或酸性土壤中无机氮的主要形式是铵根离子。因此，生长在氧化态土壤（如旱田等富氧环境）中的植物偏好吸收硝酸根离子，而生长在还原态土壤（如沼泽或水田缺氧环境）中的植物偏好吸收铵根离子或氨基酸^[5]。根系周围的无机氮源除具有上述异质性特征外，还呈现波动性特征（根系周围的氮浓度通常为100 μmol/L~10 mmol/L），植物因此演化出亲和性不同的氮素转运系统，即高亲和性转运系统和低亲和性转运系统^[6]。植物吸收土壤无机氮主要通过根中定位于细胞膜上的铵根转运蛋白（Ammonium transporter，AMT）和硝酸根转运蛋白（Nitrate transporter，NRT）协同完成^[7]。水稻吸收转运的无机氮源主要是铵根离子。此外，水稻根部通气组织能够向根系周围释放氧气，促使根表面铵根离子发生硝化作用而生成硝酸根离子。因此，硝酸根离子也是水稻吸收无机氮源的一种重要形式。

1.1.1 铵根吸收和转运

铵根离子的吸收转运主要由定位在细胞膜上的AMT家族成员完成。利用酵母突变菌株功能异源互补等方法，高等植物中编码AMT蛋白的基因相继被克隆。模式植物拟南芥基因组包含6个AtAMTs^[8]，AtAMT1;1主要在根表皮、皮层、中柱鞘及地上部分表达，其表达受低氮强烈诱导；AtAMT1;2主要在根内皮层细胞和地上部分组成性表达；AtAMT1;3在根表皮和皮层细胞特异表达，其表达受低氮轻微诱导；AtAMT1;4在花粉粒中特异表达；AtAMT1;5和AtAMT2;1主要在根维管束、皮层细胞、根尖和地上部分表达，其在根中的表达受低氮诱导。研究表明，拟南芥AtAMTs家族成员的基因表达量普遍受氮源、光合作用产物及昼夜节律等环境因素调控。

水稻AMT家族包括至少12个成员，构成4个亚家族，分别为OsAMT1、OsAMT2、OsAMT3和OsAMT4。OsAMT1亚家族基因编码高亲和性铵根转运蛋白，而其他3个亚家族基因编码低亲和性铵根转运蛋白。OsAMT家族部分成员的生化功能已被详细阐明。OsAMT1亚家族包含3个基因序列与其他物种高度保守的成员：OsAMT1;1、OsAMT1;2和OsAMT1;3^[9]。OsAMT1;1在地上部分组成性表达且在根中受铵根离子诱导表达，其转录丰度相对较高；OsAMT1;2在根中特异表达且其表达量受铵根离子诱导；OsAMT1;3在根中特异表达但其表达量受铵根离子抑制，目前认为其可能协同OsAMT1;1调控低氮生长条件下铵根离子的吸收与转运。此外，OsAMT2在根和地上部（如叶子、叶鞘等）表达且其表达量不受外界氮源调控，而OsAMT3的表达水平相对较低。有研究发现，在野生稻驯化到栽培稻的过程中，OsAMT1;1的核苷酸多态性指数显著降低，暗示OsAMT1;1在水稻驯化过程中经历过一定程度的人工选择^[10]。AMT家族蛋白通常以同源或异源多聚体的形式发挥生物学功能。外源高浓度铵根引起AMT蛋白发生磷酸化修饰和构象变化，植物根据AMT蛋白的构象变化调控铵根的吸收速率。目前认为，AMT家族成员的转运活性对水稻氮素吸收效率的高低起着直接决定作用。

1.1.2 硝酸根吸收和转运

高等植物吸收、转运和分配硝酸根离子主要由定位在细胞膜上的NRT和离子通道蛋白介导完成，其中包括硝酸根/多肽转运蛋白（Nitrate transporter1/Peptide transporter，NRT1/PTR）、硝酸根转运蛋白NRT2、氯离子通道（Chloride channels，CLCs）和阴离子通道（Slow type anion channels，SLAC/SLAHs）四个蛋白家族^[11-12]。植物NRT1/PTR家族转运底物的特异性较差，近期被统一命名为NPF家族。拟南芥NPF家族包含53个成员（水稻包含至少80个成员），主要发挥转运硝酸根或多肽的生物学功能。除了NRT1.1/CHL1和NRT1.3属双亲和性硝酸根转运蛋白，大多数NPF蛋白家族成员属低亲和性硝酸根转运蛋白^[8]。Chlorate resistant 1（CHL1）是植物中第一个被鉴定到的NPF蛋白家族成员，其在细菌、真菌和动物中的同源蛋白均具有转运多肽的生物学功能。拟南芥NRT2家族包含7个成员（水稻包含至少5个成员），且以硝酸根作为唯一转运底物^[13]。其中，NRT2.1、NRT2.2和NRT2.4属高亲和性硝酸根转运蛋白。除NRT2.7外，其他NRT2家族成员均需要伴侣蛋白NRT3.1/NAR2辅助其发挥硝酸根转运功能。CLC蛋白家族成员主要以SLAC1/SLAH或阴离子质子交换器的形式发挥硝酸根转运功能。拟南芥CLC蛋白家族含有7个成员，其中CLCa和CLCb蛋白定位于液泡膜上，具有比转运氯离子更高的硝酸根转运活性，调控硝酸根由细胞质向液泡内的定向转运^[14]。SLAC1/SLAH蛋白家族主要以阴离子通道的形式发挥生物学功能，其在拟南芥中含有5个成员，其中，SLAC1和SLAH3具有硝酸根转运活性^[15-16]。已有研究表明，转录调控对硝酸根转运蛋白的转运活性影响较大，NRT1.1/CHL1和NRT2.1的转录丰度受外源硝酸根或铵根浓度、氮饥饿处理、昼夜节律等环境因素调控。硝酸根转运蛋白家族不同成员对植物硝酸根吸收效率的贡献，与植物所处生长发育阶段及植物内源氮素水平紧密相关。

1.1.3 硝酸根分配

驱动植物氮代谢通路的还原力主要来自地上部分光合器官，因此，根吸收而来的硝酸根往往被转运到地上部分后同化为有机氮。根中硝酸根在木质部转运是植物体内硝酸根分配的关键环节，拟南芥硝酸根转运蛋白NRT1.5、NRT1.8和NRT1.9协同调控该过程。NRT1.5定位于中柱鞘细胞的细胞膜上，转运中柱鞘细胞中的硝酸根至木质部内，发挥木质部硝酸根装载的生物学功能^[17]。NRT1.8定位于木质部薄壁细胞的细胞膜上，转运木质部硝酸根至中柱鞘细胞内，发挥木质部硝酸根卸载的生物学功能^[18]。NRT1.9定位于韧皮部伴胞的细胞膜上，调控韧皮部硝酸根向下转运，抑制硝酸根被过量转运至地上部分^[19]。

植物叶片中由根转运而来的硝酸根，在细胞质和叶绿体中同化为有机氮或储存在液泡中。叶柄是植物储存硝酸根的主要器官，叶柄硝酸根含量往往被作为一些农作物氮肥需求的一个指标。拟南芥NRT1.4定位于叶柄中，调控同一叶片中硝酸根的分配^[20]。NRT1.7定位于叶片小维管束韧皮部，参与调控衰老叶片维管束硝酸根的装载和幼嫩叶片维管束硝酸根的再分配^[21]。此外，NRT2.4定位于叶片韧皮部薄壁细胞中，协同调控低氮生长条件下衰老叶片中的硝酸根转运^[22]。目前认为，由蒸腾作用驱动的木质部硝酸根转运介导硝酸根的长距离分配，而由离子渗透压驱动的韧皮部硝酸根转运介导硝酸根的局部分配。

1.2 氮素同化

直接由AMT吸收而来或间接由硝酸根/亚硝酸根还原酶（Nitrate/nitrite reductase，NR/NiR）还原而来的铵根离子经过谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合酶（Glutamine synthetase/Glutamine-2-oxoglutarate aminotransferase，GS/GOGAT）循环被同化为谷氨酰胺和谷氨酸（图1），是植物体内无机氮的主要储存形式和氨基酸的最初来源。研究表明，GS/GOGAT循环催化1分子铵根离子最终合成1分子谷氨酸，是植物氮素同化过程的关键环节^[23]。植物中的GS主要包括2类同工酶：定位于细胞质中的GS1和定位于质体中的GS2。与其他物种类似，水稻中编码GS1的一个小基因家族已被鉴定，包括OsGS1;1、OsGS1;2和OsGS1;3。GS1;1主要定位于成熟叶片的维管束中，OsGS1;1在各个器官组成性表达，叶片中的表达量相对较高。GS1;2在根中含量和活性最高，OsGS1;2是公认的根中同化无机氮的关键基因。OsGS1;3在小穗中特异表达。OsGS1;2和OsGS1;3不能互补OsGS1;1功能缺失型突变体的表型，表明OsGS1家族成员具有不同的生物学功能。GS2主要协同依赖还原态铁氧还蛋白（Ferredoxin，Fd）提供还原力的Fd-GOGAT同化叶片中经光呼吸途径释放的氨。植物中的GOGAT主要以2种类型存在：一类是Fd-GOGAT，另一类是依赖还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）提供还原力的NADH-GOGAT。Fd-GOGAT定位于叶绿体基质中，主要在绿色组织中特异表达。通过对AtFd-GOGAT功能缺失型突变体的研究，科学家们发现Fd-GOGAT主要参与同化光呼吸途径损失的氨气。NADH-GOGAT定位于细胞质或根等非光合器官的质体中，水稻中该酶由功能分化的2个基因OsNADH-GOGAT1和OsNADH-GOGAT2编码。OsNADH-GOGAT1主要在发育旺盛的根尖、新叶或幼穗等器官中表达，且其根中表达量受外源谷氨酰胺诱导，表明NADH-GOGAT1主要参与水稻根中以及衰老器官转运至幼嫩器官中的氮素同化过程。与NADH-GOGAT1相对应，NADH-GOGAT2主要在水稻成熟叶片和叶鞘中表达，对其功能研究的报道相对较少。目前认为，植物体内GS/GOGAT循环同化无机氮的主要参与成员分别是叶片中定位于质体中的GS2和Fd-GOGAT以及根中定位于细胞质的GS1和NADH-GOGAT1。

除GS/GOGAT循环外，天冬酰胺合成酶（Asparagine synthetase，AS）、依赖NADH提供还原力的谷氨酸脱氢酶（Glutamate dehydrogenase，GDH）以及氨甲酰基磷酸合成酶（Carbamoyl-phosphate synthase，CPSase）协同参与催化植物体内氨的同化过程。细胞质定位的AS能够催化谷氨酰胺的氨基转移至天冬氨酸上，合成天冬酰胺和谷氨酸。高氮碳比的天冬酰胺是植物体内无机氮储存和长距离运输的重要形式（图1）。线粒体定位的NADH-GDH通常催化谷氨酸进行脱氨基作用。但当植物处于逆境生长条件下，NADH-GDH能够选择性地催化氨固定到α-酮戊二酸上，生成谷氨酸^[24]。高等植物体内同化的天冬氨酸，能够在天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate aminotransferase，AspAT）的作用下发生转氨基作用生成谷氨酸，不同植物AspAT同工酶具有不同的组织和亚细胞定位。此外，定位于质体中的CPSase能够催化重碳酸盐和氨发生反应，生成瓜氨酸和精氨酸的前体氨甲酰磷酸。拟南芥基因组包含5个AtAspAT基因，其分别编码线粒体、叶绿体、过氧化物酶体以及细胞质定位的AspAT酶^[25]。已有研究表明，细胞质和线粒体定位的AspAT的表达受氮源诱导，而叶绿体定位的AspAT表达不受其诱导。

1.3 氮素再利用

植物生长发育期间，新陈代谢活动往往会损失体内已同化的部分氮素。例如，当植物由营养生长进入生殖生长阶段，叶片等衰老器官进行蛋白质降解或氨基酸脱氨基作用，以及体内的甲硫氨酸、异亮氨酸、木质素等生物合成途径，这些生物学过程往往会释放出大量NH₃（图1）。此外，当植物处于高光、高氧或低CO₂等胁迫生长条件下，1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的氧化活性升高，植物进行光呼吸并释放大量CO₂和NH₃^[26]。据报道，C₃植物光呼吸途径释放的NH₃量相当于其初级氮代谢同化氨的近10倍^[27]。因此，为了高效地利用由土壤吸收而来的氮，植物能够将上述生命活动释放的NH₃再次同化为谷氨酰胺和谷氨酸，这一现象被称为氮素的再利用。通常来说，谷氨酰胺和天冬酰胺是植物氮素再利用过程中氮素长距离运输的主要形式。氮素再利用过程伴随植物的整个生长发育周期，包括2个关键时期：一是幼苗期，种子子叶或胚乳中的储存蛋白分解后，根中AS、GS1和NADH-GOGAT等酶催化合成谷氨酰胺或天冬酰胺并转运至地上部分再次利用；一是成熟期，衰老叶片中的蛋白质分解后，叶片中GS2、Fd-GOGAT、GDH等酶催化合成谷氨酰胺或天冬酰胺并转运至新叶或种子中再次利用（图1）。研究表明，玉米等单子叶植物灌浆期间，旗叶的衰老速率与种子含氮量的高低呈正相关，是影响氮素再利用效率的重要因素。植物成熟期谷氨酰胺的生物合成效率是影响氮素再利用的重要环节，其包括2条空间相对独立的途径：一条是线粒体GDH和细胞质GS1催化的老叶合成途径（图1）；另一条是质体GS2/Fd-GOGAT和细胞质GS1/NADH-GOGAT催化的新叶合成途径。氮素再利用过程促进植物体内营养元素转移至种子，是影响农作物产量和品质建成的重要生物学过程。

2 植物氮素利用效率

工业革命之后，随着商品化肥的大规模生产和使用，全球粮食产量显著增长。据估计，在未来40 a，农业化肥施用量需增加近3倍才能满足持续增长的人口和消费需求^[28]。提高农作物NUE是降低农业生产成本和解决消费需求的根本策略，培育氮高效作物的首要前提是建立明确的氮素利用效率测定方法。针对不同作物或研究目的，科学家建立了评价植物NUE的多种方法和计算公式，包括氮素利用指数（Nitrogen usage index，NUI）、NUpE、NAE、农学利用率（Agronomic efficiency，AE）、表观利用率（Apparent nitrogen recovery，AR）和生理效率（Physiological efficiency，PE）等（表1）。

其中，NUE主要由NUpE和NAE共同决定。如何选择利用这些公式评估作物利用氮素的能力，主要取决于作物种类、收获性状、研究目的（如某个特定的生理过程）等。例如，NUE（产量）反映了外源氮肥对作物增产的贡献，由产量与施氮量的比值计算而来；NUpE反映了根系从土壤中捕获氮素的能力，由植物总氮含量与外源施氮量的比值计算而来；NAE反映了植物获取外源氮素并转化为产量的能力，由产量与植物总氮含量的比值计算而来。值得指出的是，由于施加到土壤中的氮肥受土壤微生物活动、土壤类型以及土壤和植物损失气态氮等多种因素影响，现阶段很难精确计算植物可获得的氮肥总量或植物实际吸收的氮肥总量。

2.1 氮素吸收效率

提高作物NUpE可有效减少因土壤氮素过度流失造成的环境污染。作物根冠形态结构和氮素转运蛋白活性是影响NUpE的2个主要因素。研究表明^[33-34]，铵态氮促进侧根起始而硝态氮促进侧根伸长，暗示通过合理施肥控制作物根冠形态是改良NUpE的有效途径之一。研究表明^[35]，生长素信号通路中一个F-box蛋白编码基因AFB3的表达受硝酸根诱导，调控根冠形态。NRT1.1/CHL1通过感知外源硝酸根并激活MADS-box类转录因子ANR1介导的硝酸根信号通路，调控硝酸根诱导的侧根伸长^[33]。此外，铵根转运蛋白AMT1;3和GDP甘露糖焦磷酸酶GMPase在铵态氮诱导的根形态建成过程中发挥重要生物学功能^[34,36]。通过基因工程修饰上述遗传因子以改良根冠形态结构，为提高农作物NUpE提供了有效的切入点。

植物硝酸根离子的吸收与转运主要由NRT1、NRT2和CLC蛋白家族完成^[37]。NRT家族基因表达量由硝酸根、氮代谢物、碳源、昼夜节律、pH值等环境因素及其上游转录调控因子的活性决定。2类硝酸根离子诱导型激酶CIPK8和CIPK23，通过改变AtNRT1.1转运活性调控了拟南芥氮素吸收效率。由于NRT家族成员的数目和结构在单子叶与双子叶植物间显著不同，仅仅通过序列比对确定单子叶植物NRT家族的功能还有待商榷。例如，与拟南芥不同，水稻硝酸根转运伴侣蛋白OsNAR2.1同时在转录水平和蛋白水平与OsNRT2.1、OsNRT2.2和OsNRT2.3a互作。因此，通过遗传修饰操控AtNRT或其调控因子在单子叶植物中的同源基因，不一定能有效改良水稻、小麦、玉米等单子叶主粮作物的氮素吸收效率。相比偏好吸收硝态氮的农作物，偏好吸收铵态氮的农作物NUpE高低主要由AMTs活性决定。AMT多聚体在细胞膜上的空间构象变化受蛋白质磷酸化修饰调控，决定了AMTs转运土壤铵根离子的效率。当植物处于高浓度铵态氮土壤环境中，AMTs蛋白C端保守的苏氨酸被磷酸化修饰而发生空间构象变化，关闭三聚体离子通道，从而避免体内铵态氮的过度积累。OsAMT1;1的一个等位变异在水稻驯化过程中被栽培稻固定，暗示挖掘野生稻中OsAMT1;1的其他等位变异或许能为改良水稻NUpE提供有效的遗传资源。此外，尿素是农业生产过程中施用氮肥的主要形式，混合施用尿素酶可有效阻止或降低土壤尿素流失。细胞膜定位的尿素转运蛋白MIPs和DUR3分别调控了低亲和性和高亲和性尿素转运过程，暗示通过遗传修饰改变尿素转运活性亦是改良农作物NUpE的有效策略之一。

2.2 氮素同化效率

植物吸收的硝态氮先后经由细胞质定位的NR和质体定位的NiR还原为铵态氮（图1）。NR编码基因的表达受硝酸根诱导而被氨基酸和碳缺乏抑制，其酶活性受蛋白质降解及蛋白磷酸化修饰调控^[38]。GS/GOGAT循环是高等植物体内同化铵态氮的关键步骤，很多学者致力于阐明该循环的分子调控机制^[39]。GS催化谷氨酸和氨合成谷氨酰胺，包括细胞质定位的GS1和质体定位的GS2。增加GS活性可显著增加植物对氮素的利用效率，对植物的生长发育及产量形成具有重要作用。GS1主要参与同化植物根吸收而来的初级铵态氮，GS2主要参与同化叶片光呼吸或亚硝酸根还原产生的氨，其编码基因在水稻和拟南芥基因组中均只有一个拷贝。GOGAT催化谷氨酰胺和α-酮戊二酸反应生成谷氨酸，包括2个功能分化的成员Fd-GOGAT和NADH-GOGAT。Fd-GOGAT同化光呼吸途径释放的氨气，而NADH-GOGAT同化非光合器官中的铵态氮^[40-41]。大量研究表明，氮代谢过程中催化无机氮同化相关酶活性高低是影响高等植物氮素同化效率的重要因素。例如，过量表达GS1显著增加转基因植物GS1酶活性、植株鲜质量和干质量、叶片总蛋白含量及单株产量^[42-46]，表明增加GS1酶活性是改良氮素同化效率的有效途径。过量表达NADH-GOGAT1的转基因水稻粒质量增加近80%^[47]，表明NADH-GOGAT1是影响水稻等单子叶植物氮素同化效率与种子灌浆速率的关键组分。GS/GOGAT循环是影响植物氮素同化效率的关键步骤，通过遗传修饰其下游基因而改良氮素同化效率亦有报道。例如，过量表达天冬酰胺合成酶基因AtASN1的拟南芥种子中蛋白含量增加；过量表达GDH的烟草生物量增加；过量表达天冬酰胺氨基转移酶基因AspAT的烟草中编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）的基因表达量增加^[48-50]，表明氮同化下游代谢基因的遗传修饰亦可作为改良作物氮素同化效率的一种潜在方法。

2.3 氮素再利用效率

植物衰老期间，一些编码GS1、GDH、AS酶等氮代谢组分的基因被强烈诱导表达，老叶中的蛋白质发生降解并以氨基酸的形式转运至种子，为种子提供95%以上的氮素。水稻GS1催化老叶中谷氨酰胺的合成，叶片衰老诱导OsGS1;1上调表达，促进谷氨酰胺大量合成并加载至维管束，最终转运至嫩叶中再利用^[51]。嫩叶氮素的同化和再利用主要发生在叶绿体中，由GS2和Fd-GOGAT 2个关键酶催化完成。衰老诱导AtASN1上调表达，促进衰老叶片中的氮转运至嫩叶中，同时增加种子氨基酸含量。此外，氨基酸渗透酶（Amino acid permease，AAP）蛋白家族促进衰老叶片氨基酸加载至韧皮部，参与调控衰老期间氨基酸由源向库的转运。AtAAP2调控木质部氨基酸加载至韧皮部，提高种子氮含量和产量^[52]。AtAAP6主要在木质部薄壁细胞表达，ataap6突变体韧皮部中氨基酸含量显著降低，暗示AAP6协同调控木质部氨基酸运载至韧皮部的过程^[53]。AAP1主要参与种子氨基酸的转运过程，过量表达AAP1增加种子蛋白含量和粒质量^[54]。目前的研究表明，氨基酸转运蛋白活性受光照、温度、氮源、病原菌、衰老等环境因素和发育进程调控，且其调控主要基于转录水平，而氨基酸转运蛋白转运氨基酸的分子机制尚不清楚。但是，过量表达拟南芥功能未知基因GDU1可非选择性促进各种氨基酸外运出细胞，其可能发挥分子伴侣的作用^[55]。据报道，过量表达丙酮酸磷酸双激酶（Pyruvate orthophosphate dikinase，PPDK）基因可加速叶片氮转运，促进莲座叶生长速率，提高种子含氮量和粒质量，表明PPDK可能成为改良作物氮素再利用效率的一个靶点^[56]。

3 水稻氮素利用的遗传基础

3.1 水稻亚群间NUE分化及其环境适应性的遗传基础

众所周知，与动物相比，植物最大的特点是具有固着性，无法通过移动及时躲避逆境。为适应复杂多变的生存环境，植物演化出适应不同生存环境的亚群。以水稻为例，野生稻被人类驯化后，逐渐演化出籼稻和粳稻2个亚群。通常来说，籼稻的耐贫瘠性强而抗寒性较弱，粳稻的耐贫瘠性弱而抗寒性较强。为阐明调控籼粳稻不同环境适应性的分子机制，植物科学家通过构建籼粳稻染色体片段代换系，发现硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的自然变异是介导籼粳稻氮素利用效率分化的分子基础，籼稻型NRT1.1B等位基因对提高水稻氮素利用具有更好的应用前景^[57]。进一步研究发现，籼稻型NRT1.1B增强氮代谢相关微生物种群在根系富集，促进局部有机氮转化为无机氮，从而提升水稻NUE^[58]。采取类似的研究策略，植物科学家发现，OsNR2在籼稻和粳稻间产生分化，籼型OsNR2比粳型OsNR2具有更高的硝酸根还原酶活性。OsNRT1.1B和OsNR2分别编码硝酸根转运蛋白和硝酸根还原酶，它们的籼稻型等位基因通常具有较高的氮素利用效率和增产潜力^[59]。此外，ABC1 REPRESSOR1（ARE1）编码一个功能未知蛋白，籼稻型ARE1启动子区的小片段DNA插入通过抑制其基因表达而正调控氮素利用效率和水稻产量^[60]。利用全基因组关联分析方法，科研人员发现TCP/TB1转录因子家族成员基因OsTCP19是控制水稻适应不同土壤氮素环境的关键基因^[61]。启动子区含有InDel缺失突变型OsTCP19主要在低氮稻区的品种中携带，该突变增强氮响应转录抑制子OsLBD对OsTCP19启动子的高效结合，从而解除OsTCP19对分蘖促进基因DLT的转录抑制效应，促进氮素介导的分蘖形成过程。上述基因的功能解析，揭示了水稻亚群氮素利用效率分化及其适应土壤氮素环境变化的分子机制，为粳稻氮高效育种提供了重要遗传资源。

3.2 赤霉素信号偶联调控水稻氮素利用

水稻育种先后经历了矮化育种、杂交育种、分子育种、设计育种和智能育种阶段^[62]。其中，矮化育种迅速提升了水稻的抗倒伏能力和产量，被誉为作物的“绿色革命”。水稻矮化育种的实现得益于系列突变型半矮秆基因sd1的应用，SD1编码一个催化植物激素赤霉素（Gibberellins，GA）生物合成的关键酶^[63]。在植物体内，GA与受体GID1结合后，促进下游生长抑制因子DELLA蛋白通过泛素/26S蛋白酶体途径降解，从而解除DELLA蛋白对植物生长的抑制作用，促进植物增高。虽然GA合成受阻增强了水稻抗倒伏能力和收获指数，但同时降低了矮化品种的氮素利用效率。我国植物科学家对多个转录因子的功能解析，发现了GA信号通路协同调控水稻生长与氮代谢的新机制。其中，水稻转录因子GROWTH-REGULATING FACTOR 4（GRF4）是调控氮碳代谢平衡的关键因子^[64]。GRF4与互作因子GIF1形成复合体后，可激活多个氮碳同化关键基因的转录，而矮化品种中DELLA蛋白的大量积累抑制了GRF4-GIF1复合体的形成，从而降低其NUE（图2）^[65]。此外，水稻中一个含有APETALA2结构域的转录因子NITROGEN-MEDIATED TILLER GROWTH RESPONSE 5（NGR5）是介导氮素调控分蘖形成的关键因子^[66]。NGR5可招募转甲基酶复合物PRC2促进组蛋白H3K27me3甲基化修饰水平，抑制分枝抑制基因的表达；而NGR5蛋白自身是赤霉素受体GID1介导的26S蛋白酶体途径的底物之一，DELLA蛋白通过竞争性抑制GID1与NGR5的互作，释放NGR5活性并促进分蘖的发生（图2）。转录因子GRF4和NGR5的功能解析，揭示了赤霉素信号通路偶联调控植物氮碳平衡代谢的新机制，对培育水稻氮高效与高产协同品种具有重要启示。

此外，我国植物科学家近些年先后鉴定到多个有望协同改良水稻氮素利用效率和产量的基因或分子模块，包括DEP1、GRF4-MYB61、NAC42-OsNPF6.1、Nhd1、DNR1、RNR10等^[67-72]，这些基因的优异等位变异实现了低氮生长条件下的增产、稳产，为作物减肥增效的分子设计提供了重要的遗传资源。

4 小麦氮素利用的遗传基础

小麦中转录因子编码基因TaNAC2-5A可调控氮代谢通路基因的表达，过量表达TaNAC2-5A促进根的生长和硝酸盐吸收速率，提高了小麦产量和氮素利用率^[73]。小麦中转录因子TaWabi5在ABA介导下可转录激活NRT2/NAR2的表达，在低氮生长条件下促进小麦对硝酸盐的吸收^[74]。研究人员利用基因编辑技术对OsARE1在小麦中的同源基因TaARE1进行定点编辑，获得了TaARE1优异变异的系列小麦are1材料，与对照相比，它们均呈现出晚衰表型，在低氮环境下增产3%~8%，表明在亲缘关系相近的作物中靶向编辑NUE同源基因是改良作物NUE和提升产量的有效方法^[75]。研究人员通过QTL定位方法鉴定到了一个包含TREE结构域的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶糖原合激酶的候选基因TaSRN-3D，其中，根系更为发达的近等基因系材料可以提高植物对硝酸盐的吸收水平^[76]。此外，研究团队通过基因组学方法，以氮高效小麦品种科农9204为研究材料，系统鉴定了小麦中的氮素吸收与代谢相关基因，发现根系形态建成与营养吸收相关基因的富集表达是科农9204氮高效形成的主要原因，该研究为培育氮高效小麦品种提供了丰富的基因资源^[77]。

5 玉米氮素利用的遗传基础

玉米中的ZmNPF7.9编码一种低亲和力的双向硝酸盐转运蛋白，在玉米籽粒的基底胚乳转移层中特异表达，其通过调节营养物质的运输在种子发育和粒质量建成中发挥作用。与此相吻合，其基因突变导致胚乳发育异常，种子百粒质量降低约60%^[78]。此外，氮响应转录因子ZmNLP5可调控ZmNIR1.1的表达，其编码基因主要在根尖表达，可增加玉米对氮素的吸收利用，具有增加玉米氮素利用和减少土壤氮素流失的应用潜力^[79]。科研人员从玉米祖先大刍草中克隆的控制玉米高蛋白品质形成和氮素高效利用的关键基因THP9，其编码一个天冬酰胺合成酶。在大刍草优异等位基因Thp9-T导入玉米自交系B73创制的近等基因系材料中，种子蛋白含量增加约35%，根、茎和叶中氮含量分别增加约54%、94%和18%，NUE和植株生物量均显著增加，表明Thp9-T在培育玉米高蛋白品种中具有关键作用^[80]。研究表明，ZmAMT3;1可在菌根特异表达，通过共生界面将氮素从真菌运输到植物中，增强玉米对环境氮源的获取能力，该研究为提高作物NUE提供了一条新思路^[81]。

6 结语

综上，植物氮代谢通路已被详尽阐明，其调控网络日趋完善。与传统育种策略相比，通过植物基因组编辑技术靶向设计氮代谢通路及其调控网络核心组分的活性，构建超级氮高效作物品种，是快速选育作物氮高效品种的重要策略。此外，现阶段对于植物氮营养调控机制及高产高效协同机制的研究，多数基于减肥增效的研究思想，而在全球土壤氮沉积量日趋积累的背景下，解析植物尤其是作物适应高氮环境的遗传机制与应对策略显得尤为迫切。值得注意的是，全球生态系统呈现逐步退化和资源匮乏的趋势，充分发挥固氮微生物在非豆科植物中的固氮功能，如在水稻、小麦、玉米等主粮作物中构建豆科植物的固氮系统，可能是未来农业可持续发展的重要研究方向。

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基金资助

国家自然科学基金(32372130)

国家自然科学青年基金(32401858)