水稻穗长QTL qPL3的鉴定与遗传效应分析

Identification and Genetic Effect Analysis of Panicle Length QTL qPL3 of Rice

摘要

水稻穗长是决定穗型的关键因素之一，与产量形成及品质改良密切相关。发掘穗长控制基因对于我国水稻育种及生产具有十分重要意义。以籼稻品种9311为供体、粳稻品种日本晴为背景的染色体片段代换系群体为研究对象，筛选到1个穗长较受体亲本日本晴显著变短的代换系N40。为了定位N40中控制穗长的QTL，构建了5个仅携带1个导入片段的单片代换系，其中，代换系N40-1仅在第3号染色体上携带1个导入片段，且其穗长与日本晴穗长相比显著变短，其他4个株系的穗长与日本晴穗长无显著差异。结果表明，N40-1携带的导入片段上含有穗长QTL，暂命名为qPL3。遗传分析结果表明，来源于籼稻9311的qPL3等位基因相对于日本晴表现为完全显性。随后利用构建染色体单片段叠代系的方法将qPL3初步定位于分子标记STS3-18与RM571之间，物理距离约为909.5 kb。同时，构建了日本晴背景下携带9311 qPL3位点的近等基因系，明确了日本晴背景下导入9311 qPL3等位基因能极显著降低植株的穗长、结实率及分蘖数，但并不影响穗粒数和株高。

Abstract

Panicle length is one of the key factors determining panicle shape and closely related to yield formation and quality improvement. The discovery of control gene for panicle length is of great practical significance for rice breeding and production. In the previous study, CSSLs population with indica variety 9311 as donor and japonica variety Nipponbare as recipient were constructed. In this study, a substitution line N40 whose panicle length was significantly lower than that of Nipponbare was found. In order to map this QTＬ controlling panicle length in N40, five substitution lines with only one introduced fragment were constructed，among which N40-1 only carried one introduced fragment on chromosome 3, and its panicle length was significantly lower than that of Nipponbare. On the contrary，panicle length of the other 4 lines was not significantly different from that of Nipponbare. Those results suggested that the introduced fragment carried by N40-1 contained a panicle length QTL, which was tentatively designated as qPL3. Genetic analysis showed that the qPL3 allele derived from 9311 was completely dominant relative to Nipponbare. Ultimately, qPL3 was preliminarily located in the physical interval of 909.5 kb flanked by the molecular marker STS3-18 and RM571 via constructing a single-fragment line of chromosome substitution lines. A near-isogenic line carrying qPL3 locus under Nipponbare background was constructed, clarifying that the allele of qPL3 derived from 9311 qPL3 could significantly reduce panicle length, seed setting rate, and tiller number of plants, but did not affect grain number per panicle and plant height．

Graphical abstract

关键词

水稻 / 穗长 / QTL / 遗传效应

Key words

rice / panicle length / QTL / genetic effect

水稻作为我国最重要的粮食作物之一，其产量的提升直接关系到国家粮食安全^[1-2]。已有研究表明，水稻穗型是决定产量形成的重要因素^[3-6]。穗长是水稻穗子长短的衡量指标，其长短直接影响着1次枝梗和2次枝梗的空间分布、每穗粒数、着粒密度、穗轴弯曲弧度等性状，是决定穗型的关键因素之一^[7-10]。因此，发掘穗长控制基因对于我国水稻育种及生产具有十分重要的现实意义^[11-12]。

穗长作为影响水稻产量潜力的重要农艺性状之一，受到了广泛的关注和研究^[13-14]。已有研究表明，穗长是一个数量性状，由多个基因控制，且遗传力低^[15-16]。目前，已报道了250多个穗长QTL（Quantitative Trait Locus，QTL），其中，部分被精细定位和克隆。ZHANG等^[17]以水稻粳稻品种日本晴（Nipponbare，NP）与籼稻品种WS3构建的遗传材料为研究对象，在第6和8号染色体上分别鉴定到1个主效的穗长QTL，并命名为qPL6和qPL8。随后采用染色体片段叠代系构建的方法将qPL6和qPL8分别精细定位到25、278 kb的物理区间内^[17-18]。进一步分析表明，qPL6和qPL8不仅能显著增加植株的穗长、枝梗数和每穗粒数，而且对植株的株高、分蘖数以及结实率等农艺性状无显著影响。XU等^[9]利用以粳稻品种日本晴为受体亲本、9311为供体亲本构建的染色体片段代换系为遗传材料，在第5染色体上精细定位到1个穗长QTL qPL5，位于218.6 kb物理区间内，同时采用构建近等基因系（Near isogenic lines，NIL）的方式明确了来源于籼稻9311的qPL5等位基因不仅能显著增加穗长、株高、每穗粒数，而且不改变着粒密度、结实率、千粒质量、分蘖数及抽穗期等农艺性状。LIU等^[19]从穗长较短的粳稻品种秀水79与长穗品种C-堡杂交构建的遗传群体中鉴定到4个穗长QTL，其中位于第9号染色体上的LP1表现出正向加性遗传效应，并被精细定位于90 kb的物理区间内。一些穗长QTL已经被成功克隆，如DEP1、IPA1、PT2/OsGRF4、COG1等。异三聚体G蛋白由α、β和γ共3个亚基组成，控制穗长的主效QTL DEP1编码γ亚基，其富含半胱氨酸区域的缺失改变了G蛋白信号的传递，进而影响了基因的表达量，引起穗长和千粒质量等性状改变^[20-21]。IPA1作为控制株型的QTL，能同时引起植株穗长的改变，该基因编码定位于细胞核的蛋白OsSPL14，受OsmiR156调控；OsSPL14基因表达量增加，可使植株表现出大穗、壮秆的表型；进一步研究发现，OsSPL14可以正向调控DEP1的表达，进而引起穗长等穗型性状的改变^[21-23]。PT2/OsGRF4是一个调控穗长和粒型的基因，其编码一个生长调控因子，在miR396c靶位点上的突变可显著提高该基因的表达水平，进而促进细胞分裂和细胞膨大，引起穗长增加、粒型改变等表型^[24]。COG1是一个控制穗型的基因，其编码MADS盒基因OsMADS17，粳稻品种C418中5'端调控区域的65 bp缺失可引起COG1的表达水平改变，进而引起穗长等性状改变^[25]。虽然目前已经定位并克隆了一些调控水稻穗长的QTL，然而相比目前已鉴定的250多个穗长QTL，成功克隆的QTL很少，并且大多数QTL的遗传效应还不明确。因此，仍需进一步挖掘水稻种质资源中的穗长QTL并明确其遗传效应，进而为培育高产优质水稻品种提供资源。

本研究中，以前期构建的籼稻品种9311为供体亲本，粳稻品种日本晴为轮回亲本的染色体片段代换系（Chromosome segment substitution line，CSSL）N40为研究材料。采用构建染色体单片段代换系的方法鉴定N40携带的导入片段中含有的穗长QTL，并利用构建NIL的方式明确目标基因的遗传效应。研究结果不仅为进一步克隆目标基因奠定了基础，也为分子设计高产品种提供了新的基因资源。

1 材料和方法

1.1 试验材料

粳稻品种为日本晴，籼稻品种为9311，代换系N40是以9311为父本、日本晴为母本构建而来，这些材料为扬州大学农学院稻米品质等重要性状的遗传改良与分子育种课题组已有材料。其中，代换系N40遗传背景中携带5个导入片段，分别命名为SL1、SL2、SL3、SL4、SL5。

1.2 试验材料种植

试验材料夏天种植在江苏省扬州市邗江区槐泗镇林桥村安宁组试验田，冬天海南繁种时种植在海南陵水扬州大学试验基地。种植时单株插秧，每行10株，株行距为15 cm×25 cm。所有染色体单片段代换系和叠代系均种植6行。

1.3 遗传群体构建

2018年夏天水稻生长季以N40为母本与日本晴杂交，获得的杂交种后冬天在海南繁种。2019年鉴定到携带导入片段SL1、SL2、SL3、SL4、SL5的染色体单片段代换系。2020年正季考察5个代换系的穗长，结合基因型与穗长表型确定穗长QTL所在的导入片段。同时配制N40-1/NP组合并获得杂交种，同年冬天在海南繁种。2022年获得覆盖目标基因的染色体片段叠代系，并考察穗长等农艺性状。

1.4 主要农艺性状测定

首先选取除边行外的15株单株，并标记它们的主茎穗，待抽穗后，考察穗型相关性状如穗长、每穗粒数等。籽粒灌浆结束后测量植株的株高、分蘖数及结实率。其中，抽穗期是统计从播种日期开始到1/2以上水稻株系稻穗抽穗所经历的天数；株高是测定植株从地面至最高穗顶端的长度；穗长是测定穗颈节至穗顶的长度（不含芒长）；结实率是统计每穗实粒数与每穗总粒数的比值；分蘖数则仅统计有效分蘖数。

1.5 分子标记的开发

构建染色体单片段叠代系及QTL定位过程中利用的分子标记分为两类：SSR标记和InDel标记。SSR标记选自Gramene网站（https：//www.gramene.org/），InDel标记是基于NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中提供的籼、粳稻序列间的差异，利用Primer 6.0软件设计。本研究利用的分子标记由南京擎科生物有限公司进行合成，具体信息见表1。

1.6 DNA提取及基因型鉴定

水稻插秧30 d后，田间摘取新鲜的叶片，并参照CTAB方法提取水稻基因组DNA^[26]。随后利用分子标记进行聚合酶链式反应（PCR）扩增目标片段。PCR反应体系为20 μL体系，其中模板DNA 1.0 μL，TapMix 10.0 μL，ddH₂O 9.0 μL。PCR扩增程序为：95 °C预变性5 min；94 °C变性50 s，50~60 °C退火40 s，72 °C延伸40 s，32个循环；72 °C延伸5 min，18 °C保温。PCR反应结束后，利用3%琼脂糖凝胶对目标片段进行检测，并在凝胶成像仪上成像。

1.7 QTL定位

利用单因素方差分析对各染色体片段叠代的穗长进行差异显著性分析，以P<0.01为阈值，当P值低于0.01时则认为导入的供体片段上携带1个QTL。QTL命名的规则参照MCCOUCH等^[27]报道的方法。

1.8 数据分析

本研究利用SPSS 23.0软件中的独立样本t测验对数据进行差异显著性分析，其他数据利用Excel 2013进行分析。

2 结果与分析

2.1 qPL3的鉴定

前期研究利用籼稻品种9311为供体、粳稻品种日本晴为受体构建了一套包含125个系的染色体片段代换系群体^[28-29]，其中代换系N40的穗长为19.15 cm，较受体亲本日本晴的穗长（21.90 cm）极显著降低，推测N40携带的导入片段中可能含有控制穗长的QTL。如图1所示，通过分析N40的遗传背景发现，其携带5个导入片段，分布在第3、6、11号染色体上，其中，第3号染色体上有3个导入片段。根据导入片段的数目，将导入片段分别命名为SL1、SL2、SL3、SL4、SL5。根据导入片段的物理位置，分别在5个导入片段的两端或中央选取1~3对具有良好多态性的分子标记，对导入片段进行验证。基因型检测与高通量测序获得的导入片段的物理位置一致。为定位代换系N40携带的导入片段中含有的穗长QTL，利用10对分子标记检测了N40/NP的F₂分离群体中约500个单株，构建了5个仅含一个导入片段的染色体单片段代换系，其中代换系N40-1仅含有SL3导入片段。

为定位N40携带的导入片段中含有的穗长QTL，测定了5个染色体单片段代换系的穗长，结果如图2所示，N40-1的穗长为19.94 cm，较受体亲本日本晴的穗长（22.42 cm）极显著变短（P<0.01），缩短的幅度为11.06%。其他4个系的穗长分别为21.06、21.26、21.07、21.65 cm，差异显著性分析结果表明，这4个系的穗长与日本晴的穗长无显著差异。由此推测，代换系N40-1携带的导入片段中含有控制穗长QTL，暂时命名为qPL3。

2.2 qPL3的遗传分析和定位

代换系N40的高通量测序结果表明，SL3在第3号染色体上物理位置为31.4~35.0 Mb（图3-A）。为定位片段中所携带的穗长基因，以染色体单片段代换系N40-1与受体亲本日本晴杂交并自交衍生的1 189个单株为材料，利用分子标记STS3-4，STS3-5和STS3-6检测这些单株的基因型。根据基因型检测的结果，随机选取3个标记间为日本晴基因型（NP型）、9311基因型（9311型）以及双亲基因型（Heter型）的单株各30株进行穗长表型鉴定。由图3-B可知，9311型和Heter型植株的穗长较NP型植株的穗长极显著（P<0.01）或显著（P<0.05）缩短，该结果表明，分子标记STS3-4和STS3-5与qPL3连锁，且来源于9311的qPL3等位基因为显性基因。

为进一步定位qPL3，利用分子标记STS3-4和STS3-5分析N40-1/NP分离群体中的1 500个单株基因型，共筛选到65株重组类型单株。随后在分子标记STS3-4和STS3-5间开发了6对具有多态的分子标记，并利用它们对基因型重组的单株进行了基因型分析，构建了6类覆盖目标基因的染色体片段叠代系（I-VI）。最后结合穗长表型及基因型分析将qPL3初步定位在分子标记STS3-18与RM571之间，物理距离约为909.5 kb（图3-B）。

2.3 qPL3遗传效应的分析

为了系统分析qPL3的遗传效应，采用分子标记辅助选择的方法构建了日本晴背景下携带1.67 Mb导入片段（位于分子标记STS3-4和RM571之间）的NIL（图4-A和B）。NIL及日本晴植株的农艺性状测定结果表明，与受体亲本日本晴相比，NIL的株高和每穗粒数无显著差异（图4B-D和G），但结实率及分蘖数较日本晴显著降低（P<0.05），降低的幅度分别为26.64%和10.00%（图4-B，E-F）；植株抽穗期较日本晴显著的推迟（P<0.05），推迟的天数约为7 d（图4-H）。以上结果表明，来源于9311的qPL3能极显著降低水稻植株的穗长，但并不影响穗粒数以及株高。进一步分析NIL导入片段携带的已知功能基因，发现导入片段SL3上携带已克隆抽穗期基因Hd6，推测NIL植株抽穗期延迟主要由其携带9311型Hd6引起^[30]。

3 结论与讨论

穗型是水稻重要农艺性状，与水稻的产量密切相关，进一步分析NIL导入片段携带的已知功能基因穗长是影响穗型的关键因子之一。近年来，虽然在穗长的遗传调控分子机理方面取得了一定的进展，鉴定并克隆了一些基因/QTL，但由于缺乏对相关基因遗传效应的系统评价，且大多数基因存在“一因多效”的遗传效应，造成育种实践中可以直接利用的穗长基因较少^[31]。因此，进一步定位与穗长发育相关的基因/QTL，并明确目标基因的遗传效应，不仅有助于进一步阐明穗长调控的遗传机制，还对培育高产水稻品种具有重要的指导意义。

染色体单片段代换系与受体亲本之间在遗传背景上只有一个代换片段的差异，可以用来进行多年、多点、多次重复试验。用于QTL定位时，其简单的遗传背景可以有效消除其他QTL的干扰，再次通过回交即可以构建染色体单片段叠代系，进行QTL的精细定位，近年来已被广泛用于QTL的精细定位及图位克隆^[32-34]。本研究在鉴定穗长QTL时，同样利用构建染色体单片段代换系的方法，将N40中的携带穗长QTL定位在第3号染色体导入的供体片段中，并命名为qPL3。已有研究表明，通过构建染色体单片段叠代系的方法并结合后代测验是定位QTL的有效方法^[9，18]。本研究中，穗长是典型的数量性状，遗传力低，受环境影响大。为进一步定位qPL3，同样采用构建了覆盖目标基因染色体单片段叠代系的方法定位目标QTL。本研究表明，最终结合基因型和表型将qPL3基因定位于分子标记STS3-18与RM571之间，物理距离约为909.5 kb的物理区段内。由水稻基因组注释网站（http://rice.uga.edu/annotation_pseudo_current.shtml）信息可知，该定位区段内未见已报道的控制穗长或穗型等相关性状的基因，由此推测，本研究中定位的qPL3为新的控制穗长基因，后续将进一步通过构建覆盖目标基因染色体片段叠代系的方法精细定位目标基因。

已有研究表明，构建携带目标基因的NIL是评价基因遗传效应的有效方法^[35]。本研究在基因定位的过程中结合分子标记辅助选择构建了NP背景下携带9311 qPL3位点的NIL。通过对NIL植株农艺性状测定发现，在日本晴背景下来源于籼稻9311 qPL3的等位基因能极显著降低植株的穗长，但并不影响穗粒数和株高。前期研究中报道的穗长基因大多会影响株高，如qPL5、LP1等除了引起穗长改变外，还可显著的增加株高^[9]；qPA1可显著降低植株穗长和株高^[36]，基因功能研究表明该基因即为半矮秆基因sd1的等位基因。与之不同的是，本研究籼稻9311 qPL3等位基因对植株的株高并无显著影响，该遗传效应与qPL6的遗传效应类似^[17]。此外，部分穗长基因也会影响穗粒数及粒型相关性状，如OsGRF4、COG1等基因除引起穗长改变外，还可引起穗粒数及粒型的变化^[24，37]。本研究qPL3基因并不影响植株的每穗粒数，推测原因可能是该基因主要影响穗轴的伸长，对1、2级枝梗及颖花发育无显著影响。由此推测qPL3在定向改良水稻的穗长方面有较好的应用潜力。后续我们将采用分子标记辅助选择的方法构建不同遗传背景下携带9311 qPL3的NIL，进而系统评价qPL3的遗传效应。

已有研究表明，穗长的发育与植株的抽穗期等性状存在遗传相关性。一般而言，抽穗期与穗长呈正相关，主要原因为抽穗期推迟可形成更多的生物产量与经济产量，进而可引起穗长改变，如Ghd7和Ghd8等基因在控制植株抽穗期同时还正向调控穗长的发育^[21,38-39]。本研究中，NIL的抽穗期较受体亲本显著推迟。分析NIL导入片段发现，NIL携带的导入片段对应物理位置是31424853—33096621 bp，该区间内携带已克隆的水稻抽穗期基因Hd6^[29]。已有研究表明，来源于籼稻9311的Hd6等位基因可借助有功能的Hd1（日本晴携带有功能的Hd1）延迟抽穗期^[40-42]，由此推测NIL抽穗期推迟可能是由于NIL携带9311 Hd6等位基因而引起^[29]。值得关注的是，尽管NIL的抽穗期推迟，但NIL植株的穗长却显著降低，该结果与已报道的Ghd7和Ghd8等抽穗期基因可增加穗长的遗传效应不同，该结果进一步证明了qPL3对穗长具有显著的调控作用。后续将进一步构建携带更小供体片段的NIL来系统评价目标基因对抽穗期的影响。此外，NIL农艺性状测定结果表明，NIL植株结实率与分蘖数均发生改变，该结果与前期报道穗长基因均不同^[9]。对于结实率与分蘖数的改变是否由qPL3引起或是由其他基因引起仍然有待进一步研究。

综上所述，本研究鉴定的qPL3为新的穗长基因，研究结果不仅为进一步克隆目标基因奠定了基础，也为分子设计高产品种提供了新的基因资源。

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基金资助

江苏省农业科技自主创新项目（CX（23）3093）

江苏省作物基因组学和分子育种重点实验室开放课题项目(PL202303)