过量表达SbWRKY50基因对高粱田间长势的影响

Effects of SbWRKY50 Overexpression on the Growth of Sorghum in Field

摘要

叶片衰老是一个由复杂调控网络调控的生物学过程，该调控网络包括环境因素和内部因子，如转录因子（Transcriptional factors, TFs）和植物激素，其中，乙烯（Ethylene ET）对于植物衰老尤为关键。高粱（Sorghum bicolor L.）WRKY家族转录因子SbWRKY50是乙烯信号途径中关键成员乙烯不敏感3（ETHYLENE INSENSITIVE 3 EIN3）的直接靶标，能够抑制高粱叶片衰老。然而，SbWRKY50在田间是否能够通过调控叶片衰老影响高粱农艺性状仍然未知。文章对SbWRKY50过表达高粱的田间表型进行分析，并对SbWRKY50过表达高粱和野生型进行黑暗处理，检测叶绿素含量、鲜质量、干质量、乙烯合成速率。结果表明，过表达植株在田间自然条件下依然可以延缓高粱衰老；衰老相关基因SbSAG20、SbSAG21与SbSAG39的表达分析发现，这些基因的表达量在SbWRKY50过表达高粱中显著低于野生型。表明SbWRKY50通过抑制衰老相关基因表达延缓高粱衰老。SbWRKY50过表达高粱相比于野生型更为滞绿，且叶绿素含量、鲜质量、干质量显著高于野生型，表明SbWRKY50过表达可以增加高粱的田间生物量。综上，SbWRKY50过表达不仅可以延缓高粱衰老，而且能够增加高粱生物量。

Abstract

The onset of leaf senescence is governed by a complex regulatory network including environmental cues and internal factors such as transcription factors(TFs) and phytohormones, in which ethylene(ET) is one key inducer. The TF SbWRKY50 of WRKY family from Sorghum bicolor L.is a direct target of the key component ETHYLENE INSENSITIVE3(EIN3) in ET signalling, functioning for leaf senescence repression. However, it remains unknown whether SbWRKY50 can affect sorghum agronomic traits by regulating leaf senescence in the field. In this paper, field phenotypic analysis of SbWRKY50 overexpressing sorghum was conducted, and the chlorophyll content, fresh weight, dry weight, and ethylene synthesis rate of SbWRKY50 overexpressing sorghum and wild-type sorghum were detected after dark treatment. The results found that overexpressing plants could still delay sorghum senescence under natural field conditions. Expression analysis of senescence-related genes SbSAG20, SbSAG21,and SbSAG39 revealed that the expression levels of these genes were significantly lower in SbWRKY50 overexpressing sorghum than that of wild-type. The results showed that SbWRKY50 delayed sorghum senescence by inhibiting the expression of senescence-related genes. Compared with wild-type, SbWRKY50 overexpressing sorghum was greener, and chlorophyll content, fresh weight, and dry weight were significantly higher than those of wild-type. In conclusion, SbWRKY50 overexpression could not only delay sorghum senescence but also increase sorghum biomass.

Graphical abstract

关键词

高粱 / SbWRKY50 / 田间 / 叶片衰老

Key words

Sorghum bicolor L. / SbWRKY50 / field / leaf senescence

叶片衰老是植物发育的最后阶段，其过程受到分子和细胞层面的精确调控^[1-3]。叶片衰老过程清晰可见，尤其是叶片颜色的变化，其中涉及到叶绿素和大分子的降解、细胞体积的缩小以及细胞代谢的退化^[1-5]。这些复杂的变化往往是通过大量衰老相关基因（Senescence-associated genes，SAGs）的表达^[6-7]以及营养成分从老叶向生殖器官或生长活跃的幼嫩组织转移实现的^[8-9]。

高粱（Sorghum bicolor L.）是世界第五大谷类作物，为亚洲和非洲主食之一，也被广泛用于动物饲料、糖浆和生物燃料^[10-11]。滞绿是高粱开花后适应干旱的一个重要性状^[12-13]。前人研究表明，延绿高粱杂交种在干旱条件下可多产生47%的生物量^[14]。因此，了解叶片衰老的分子机制以及延缓高粱衰老对于高粱种植有着重要意义。

植物激素对叶片衰老具有加速或延缓作用^[1，15-17]。乙烯对叶片衰老的促进作用早已阐明^[18-19]。外源施加乙烯会加速叶片衰老，而抑制乙烯的生物合成会延缓叶片衰老^[20-21]。EIN3（ETHYLENE-INSENSITIVE 3）是乙烯信号途径的核心成分和关键转录因子。EIN3的突变会延缓叶片衰老，而过表达EIN3会加速衰老^[22-24]。另外，CLE多肽也能通过抑制EIN3的功能来延缓叶片衰老^[25]。转录组分析表明，EIN3在不同的发育过程中可激活或抑制下游靶标^[26]。EIN3可直接或间接诱导叶绿素分解途径相关基因NON-YELLOWING 1（NYE1）、NON-YELLOW COLORING 1（NYC1）和SAGs的表达，从而实现对叶片衰老的调控^[27]。然而，叶片衰老过程中的乙烯信号途径非常复杂，其潜在的分子机制还不完全清楚。

WRKY家族转录因子的显著特点是其具有植物所特有的“WRKYGQK”保守序列^[28-30]。拟南芥的全基因组表达分析表明，WRKY家族转录因子是参与植物衰老的第二大类转录因子^[31-32]。许多WRKY转录因子对叶片衰老至关重要，如正调控因子WRKY6^[33]、WRKY22^[34]、WRKY45^[35]、WRKY53^[36]和WRKY75^[37]，负调控因子WRKY54和WRKY70^[38]。此外，WRKY转录因子也能对各种植物激素做出响应，如脱落酸（Abscisic acid，ABA）、赤霉素（Gibberellic acid，GA）和茉莉酸（Jasmonic acid，JA）^[34,39-44]，这些激素都能促进植物衰老^[5]。同时，WRKY转录因子也可响应乙烯信号。EIN3被报道可间接通过调控WRKY转录因子介导叶片衰老^[45]。前期研究发现，SbWRKY50作为乙烯通路关键成员EIN3的直接靶标，可通过招募PRC1（Polycomb repressive complex 1）复合体引起高粱叶绿素降解途径中多个成员的H2A单泛素化修饰，进而抑制它们表达，调控叶片衰老^[46]。然而，SbWRKY50在田间自然条件下能否同样延缓高粱衰老，以及SbWRKY50的滞绿作用对高粱农艺性状的影响仍然未知。

本研究对野生型高粱以及SbWRKY50过表达高粱的田间表型进行观察，从而分析SbWRKY50的育种潜力，旨在为高粱甚至其他作物的育种工作提供方向和支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试高粱品种为P898012，由黑龙江八一农垦大学戴玲燕教授提供。SbWRKY50过表达高粱由南京大学生命科学学院植物生长发育课题组通过遗传转化获得。

1.2 试验地概况

高粱种植在江苏省南京市南京农业大学白马教学科研基地，属亚热带湿润气候区，平均气温为25~35 °C，肥力情况均衡。土壤理化性质为：有机质含量为2.06%~2.41%，全氮含量为0.105%~0.121%，有效磷含量为8.42~10.28 mg/kg，速效钾含量为85.28~94.40 mg/kg。

1.3 试验方法

1.3.1 材料种植

高粱品种P898012（野生型）和SbWRKY50过表达高粱的种子播种于植物培养室，湿度为70%，昼夜温度均为22 °C，光周期为连续光照，出苗后移植于白马教学科研基地直至生长成熟。

1.3.2 样品收集

不同时期高粱叶片中SbWRKY50和SbWRKY42的表达分析，选取生长40 d或者60 d从下往上数第5片叶子提取RNA。田间高粱叶片不同区域中SbWRKY50和SbWRKY42的表达分析，选取生长70 d从下往上数第5片叶子提取RNA。对于田间生长的高粱叶片中衰老相关基因的表达分析，选取生长120 d从下往上数第5片叶子提取RNA。黑暗处理诱导叶片衰老试验，选取生长21 d高粱的幼苗进行为期5 d的黑暗处理，观察表型特征，并进行叶绿素含量以及生物量测定。所有试验均进行3次生物学重复。田间高粱黄绿叶分析，选取生长75 d从下往上数20片高粱叶片进行黄绿叶百分比统计。

1.3.3 荧光定量分析

使用RNA提取试剂RNA isolator Total RNA Extraction Reagent（Vazyme）从高粱叶片中提取总RNA。随后用反转录试剂盒The HiScript II Q RT SuperMix for qPCR kit（Vazyme）对1 µg RNA进行反转录，用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme）进行定量实时PCR分析，以SbACTIN1基因的表达为内参。实时定量PCR所用仪器为the Step One Plus real-time PCR system（Applied Biosystems），荧光定量PCR程序为95 °C 30 s；95 °C 10 s，60 °C 30 s，40个循环；溶解曲线使用仪器默认溶解曲线采集程序。进行荧光定量分析的引物见表1。

1.4 测定项目及方法

1.4.1 叶绿素含量

取300 mg叶片样品研磨并溶于5 mL无水乙醇中。12 000 r/min离心5 min后，取上清，用分光光度法分别于649、665 nm波长下测定吸光值。根据朗伯-比尔定律计算提取液中叶绿素含量（以乙醇为空白对照）。

Ca（mg/g）=（13.95A₆₆₅-6.88A₆₄₉）×V/1 000×W（1）

Cb（mg/g）=（24.96A₆₄₉-7.32A₆₆₅）×V/1 000×W（2）

Ct=Ca+Cb（3）

式中，Ca代表叶绿素a，Cb代表叶绿素b，Ct代表叶绿素a和叶绿素b含量总和；V是提取物的体积（mL），W是鲜叶的质量（g）。

1.4.2 乙烯合成速率

高粱叶片的乙烯含量由南京优选生物公司测定。称取30 d苗龄野生型高粱和过表达转基因高粱叶片各10 g，静置于清洁、干燥的气密玻璃瓶中6 h；用注射器分别吸取1 mL的顶部气样，注入配备30 m HP-PLOT分子筛柱（AGILENT，货号为19095P-QO4）的气相色谱仪（SHIMADU，型号为GC-14C）中进行乙烯合成速率的测定。气相色谱仪的层析柱可将气体样品中的乙烯与其他有机挥发物质分开，并测定乙烯气体的浓度。

1.5 数据统计

数据以平均值±标准差表示。各处理之间的统计显著性由one-way ANOVA（针对1个变量）和two-way ANOVA（针对2个或多个变量）确定，并以双尾P<0.05和P<0.01表示统计显著性。

2 结果与分析

2.1 SbWRKY50基因与叶片衰老的关系

已有研究发现，在134个SbWRKY的启动子附近（-1 500 bp~500 bp区域，其中转录起始位点被定义为0）搜索EIN3的潜在结合基序（AYGWAYCT）^[47]，发现了9个SbWRKY具有潜在的SbEIN3结合序列^[46]。通过蛋白序列比对发现，SbWRKY42和SbWRKY50在拟南芥中的同源蛋白与乙烯信号通路或叶片衰老相关^[48-49]。进一步在高粱自然衰老的叶片中发现，SbWRKY50在衰老叶片中的表达量急剧下降，而SbWRKY42的表达量则无明显差异^[46]。然而，SbWRKY42和SbWRKY50在田间条件下是否也与叶片衰老相关仍不清楚。因此，本研究检测了SbWRKY42和SbWRKY50在田间自然条件下生长不同天数高粱叶片中的表达，结果发现，SbWRKY50在衰老叶片中的表达量极显著降低（P<0.01），而SbWRKY42的表达量在衰老叶片和嫩叶中无明显差异（图1-A）。同时，本研究也检测了SbWRKY42和SbWRKY50在田间生长条件下高粱叶片不同部位中的表达，结果发现，SbWRKY50的表达模式与单个叶片（从顶端到基部）的衰老梯度成反比（图1-B），而SbWRKY42在叶片不同部位的表达无明显差异（图1-C）^[46]。说明SbWRKY50在田间自然条件下也与叶片衰老相关。

2.2 SbWRKY50过表达植株在田间的表型分析

已有研究发现^[46]，相对于野生型，在温室生长条件下的SbWRKY50过表达植株能够显著延缓高粱衰老，而且SbWRKY50过表达植株中叶片衰老相关基因和叶绿素降解相关基因的表达显著降低，叶绿素合成相关基因的表达显著升高。为了进一步确定SbWRKY50在田间自然条件下是否能够影响高粱衰老，随机在田间选择3个区域（每个区域均相邻种植了野生型高粱和SbWRKY50过表达高粱）并对叶片的衰老程度进行分析，结果发现，经过75 d的生长，经历拔节期、孕穗期后，野生型高粱的多个叶片均出现不同程序的衰老，而SbWRKY50过表达高粱几乎无衰老（图2-A）。同时，相比于野生型，SbWRKY50过表达高粱含有更低的黄叶百分比（图2-B）。表明SbWRKY50在田间自然条件下也能延缓高粱衰老。

2.3 SbWRKY50过表达高粱中衰老相关基因的表达分析

已有研究发现，SbWRKY50是乙烯通路关键成员EIN3的直接靶标，可通过招募PRC1复合体调控叶片衰老^[46]。同时，EIN3可直接或间接诱导叶绿素分解途径相关基因NYE1、NYC1、SAGs等的表达，从而实现对叶片衰老的调控^[27]。为了进一步探究自然环境下SbWRKY50调控高粱衰老的途径，本研究检测了田间生长的SbWRKY50过表达植株和野生型中与衰老相关的基因（SbSAG20、SbSAG21与SbSAG39）的表达量，结果发现，它们在SbWRKY50过表达植株中的表达量均极显著低于野生型（P<0.01）（图3），结合SbWRKY50在温室条件下对于衰老的作用，表明SbWRKY50在温室条件以及田间自然条件下均能通过影响衰老相关基因的表达调控高粱衰老。

2.4 SbWRKY50过表达高粱的黑暗处理表型以及生物量分析

叶绿素含量的高低与植物的光合能力紧密相关，是影响作物生物量的重要性状。已有研究表明，温室生长条件下的SbWRKY50过表达植株中叶绿素降解相关基因的表达显著降低，而叶绿素合成相关基因的表达显著升高^[46]。为了进一步探究SbWRKY50延缓叶片衰老是否能够通过调控叶绿素含量影响高粱生物量，首先对野生型高粱和SbWRKY50过表达高粱进行了黑暗处理，结果表明，黑暗处理后的SbWRKY50过表达高粱比野生型更为滞绿（图4-A）。

同时，SbWRKY50过表达高粱的叶绿素含量也显著高于野生型（P<0.05）（图4-B），表明SbWRKY50过表达高粱有着更高的叶绿体活性。进一步研究表明，黑暗处理后的SbWRKY50过表达高粱的鲜质量和干质量也均极显著高于野生型（图4-C、D）（P<0.01）。此外，也对黑暗处理后的野生型高粱和SbWRKY50过表达高粱的乙烯合成速率进行了测定，结果发现，野生型高粱中乙烯合成速率显著高于SbWRKY50过表达高粱（P<0.05），这也与黑暗处理后二者的衰老表型相一致（图4-E）。表明SbWRKY50可以延缓高粱衰老，且能够提高高粱生物量。

3 结论与讨论

叶片衰老是一个复杂的组织退化过程，会在环境因子和内源信号的共同作用下导致大量生理生化变化^[8]，其中，包括植物激素的变化^[35，39]和大量转录因子表达谱的改变^[15，38]。然而，叶片衰老过程中转录因子在激素信号传导中的作用仍知之甚少。WRKY家族转录因子是响应叶片衰老的第二大转录因子家族^[31]。在WRKY转录因子家族中，WRKY5^[50-51]、WRKY6^[33，52]、WRKY22^[34]、WRKY45^[35]、WRKY53^[36]和WRKY75^[37]曾被报道正向调控叶片衰老，而WRKY54和WRKY70^[38]则在拟南芥中发挥负向调控作用。已有研究发现^[46]，SbWRKY50在衰老叶片中的表达急剧下降，表明其参与叶片衰老；而另一个WRKY家族转录因子SbWRKY42在自然衰老叶片中的表达几乎保持不变。同时，本研究中的田间试验结果也证明了这个现象。即使SbWRKY42的同源基因在拟南芥中被报道参与衰老相关调控^[49]，且其可能是SbEIN3的潜在靶标，但在高粱中SbWRKY42并不调控叶片衰老^[46]。说明基因在物种进化过程中可以发生功能分化，因地制宜满足不同植物的生长需要。

植物滞绿意味着更持久的叶绿体活性以及更活跃的叶绿素积累。叶绿体是绿色植物进行光合作用的场所，其中含有的光合色素叶绿素从太阳光捕获能量，并将其存储在能量储存分子ATP和NADPH中，以支持植物的生长和发育。同时，叶绿素也能对氮、铁、镁等元素的吸收、转运和利用进行调控，确保植物的正常生长和光合作用的进行^[53-54]。本研究的前期工作也表明，SbWRKY50是乙烯信号途径关键成员EIN3的直接靶标^[46]，在乙烯信号下游通路中发挥关键作用。SbWRKY50过表达高粱相对于野生型更为滞绿，且含有较低的SAGs表达水平^[46]。而敲除或者沉默SbWRKY50会加速叶片衰老，表明SbWRKY50在温室培养条件下负调控高粱衰老^[46]。植物衰老的调控网络虽然极为复杂，但最终的归因主要有3个，分别为影响衰老相关基因的表达、影响叶绿素合成相关途径以及影响叶绿素降解相关途径^[46]。高粱可被广泛用于动物饲料、糖浆和生物燃料^[10]。本研究发现，过表达SbWRKY50在田间自然条件下依然可以延缓高粱衰老，同时也可通过影响叶绿素途径增加高粱的鲜质量和干质量，暗示其具有提高高粱田间生物量的潜力。同时，前人研究也表明^[14]，延绿高粱杂交种在干旱条件下可多产生47%的生物量。因此，SbWRKY50在高粱滞绿方面的作用能否提高干旱条件下的高粱生物量仍有待进一步研究。

总之，本研究在前期工作的基础上进一步揭示了乙烯响应因子SbWRKY50也可以在田间自然条件下调控高粱衰老。SbWRKY50的滞绿作用也显著提高了高粱生物量。因此，本研究结果将有助于进一步了解叶片衰老的分子机制，也为提高高粱甚至其他作物的产量提供了一定的基础和依据。

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基金资助

国家自然科学基金(32070200)

中央高校基本科研专项(0208/14380180)